Wnt3a协同BMP9调控间充质干细胞成骨分化及机制研究

目的：探讨经典Wnt信号通路与骨形态发生蛋白9（Bone morphogenetic protein 9,BMP9）诱导间充质干细胞（Mes－enchymal stem cells,MSCs）成骨的相互影响及分子机制。方法：以小鼠骨髓来源MSCs C3H10T1/2为目的细胞,用Wnt3a上调经典Wnt信号通路,联合BMP9作用于细胞,通过碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）活性测定、钙盐沉积实验、real time PCR、免疫细胞化学染色等方法观测BMP9与经典Wnt信号通路联合后对MSCs成骨分化的影响。结果：Wnt3a明显促进了BMP9诱导的ALP活性的增加[F=264.962,P=0.000;t（BMP9+Wnt3a）-BMP9=7.19,P=0.000;t（BMP9+Wnt3a）-Wnt3a=16.36,P=0.000],同时也明显增加了成骨标志物骨钙蛋白（Osteocalcin,OC）[F=3 920.102,P=0.000;t（BMP9+Wnt3a）-BMP9=39.10,P=0.000;t（BMP9+Wnt3a）-Wnt3a=62.56,P=0.000]和骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）[F=1 935.824,P=0.000;t（BMP9+Wnt3a）-BMP9=40.88,P=0.000;t（BMP9+Wnt3a）-Wnt3a=56.42,P=0.000]的表达以及Runx2的mR－NA的表达[F=3 635.980,P=0.000;t（BMP9+Wnt3a）-BMP9=79.37,P=0.000;t（BMP9+Wnt3a）-Wnt3a=86.96,P=0.000],并且还促进了钙盐沉积。结论：Wnt3a与BMP9相互协同诱导MSCs的骨向分化,其中成骨转录因子Runx2可能作为二者的交汇点起了重要作用。     

转化生长因子-?茁1促进骨形态发生蛋白9诱导间充质干细胞成骨分化

目的：探讨转化生长因子?茁1（transforming growth factor-?茁1,TGF-?茁1）在骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic protein 9,BMP9）诱导间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）成骨分化过程中的作用。方法：应用鼠MSC C3H10T1/2,以重组腺病毒法将BMP9导入,施加TGF-?茁1处理,建立BMP9联合TGF-β1诱导MSC成骨分化模型。改良SEAP化学发光法检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性;茜素红S染色进行钙盐沉积检测;实时荧光定量PCR检测成骨相关基因Ⅰa2型胶原（collagenⅠa2,COLⅠa2）、骨桥素（osteopotin,OPN）、骨钙素（osteocalcin,OCN）的mRNA转录表达水平,免疫细胞化学法检测细胞内OPN、OCN表达变化。荧光素酶报告基因法检测信号通路的Smad水平。结果：TGF-?茁1与BMP9联合处理较BMP9单独处理能更早更多地提高ALP活性和引起钙盐沉积（F处理=18 782.10,P=0.000）,持续处理达17 d后不再显示明显差异,TGF-?茁1单独处理与对照组间无明显差异（F=1.03,P=0.318）。TGF-?茁1与BMP9联合处理较BMP9单独处理可使COLⅠa2、OPN、OCN mRNA转录水平明显增高（COLⅠa2的F处理=250.30,P=0.000;OPN 的F处理=795.64,P=0.000;OCN的F处理=206.55,P=0.000）,COLⅠa2增高发生较早和显著（F=250.30,P=0.000）;细胞内OPN、OCN蛋白阳性表达显著增强。TGF-β1联合BMP9处理能刺激信号通路相应的Smad荧光素报告活性（?字2=32.84,P=0.000）。结论：在BMP9诱导MSC成骨分化中,联合应用TGF-?茁1具有促进成骨作用,BMP9与TGF-?茁1在成骨分化中可能存在互补效应。     

AP2α在BMP9诱导C3H10成骨分化中的作用及机制探讨

目的：研究转录蛋白2（activator protein 2,AP2）α在骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）9诱导小鼠间充质干细胞C3H10成骨分化中的作用及可能的分子机制。方法：重组腺病毒 Ad-BMP9感染小鼠C3H10细胞,显性负性突变体AP2α-△bHLH和AP2α-△TAD抑制 AP2α转录活性,通过RT-PCR、real-time PCR检测AP2α、BMP9及成骨相关基因的表达水平,Western blot检测骨桥蛋白（osteopontin,OPN）表达,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性测定、茜红素染色实验观测C3H10成骨分化。结果：BMP9具有强促成骨分化的作用,对AP2α的表达水平无影响,AP2α显性负性突变体可抑制BMP9诱导的成骨基因骨钙蛋白（osteocalcin,OC）、OPN及骨保护素（osteoprotegerin,OPG）表达的增高（OC：F=56.929,P=0.000;OPN：F=54.789,P=0.000;OPG：F=159.451,P=0.000）,ALP活性（F=69.776,P=0.000）及红色钙盐沉积减少。结论：BMP9可能通过影响AP2α的转录活性调控成骨分化进程。     

携带siRbpj重组腺病毒载体的构建及其对BMP9诱导骨髓间充质干细胞成骨分化作用影响

目的：构建并筛选特异性干扰Notch信号通路核转录因子Rbpj基因的重组腺病毒,探讨通过Rbpj的经典Notch信号通路在骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）9诱导骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,ＭＳＣs）成骨分化中的作用。方法：设计3对针对小鼠Rbpj的siRNA序列,将其分别亚克隆至pSES-HUS穿梭质粒,再与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183内同源重组获得重组质粒,经脂质体转染至HEK293细胞中包装扩增腺病毒,利用RT-PCR及Western blot进行筛选、验证有效的干扰腺病毒。该重组腺病毒与AdBMP9处理ＭＳＣs细胞株C3H10T1/2,采用组织化学和RT-PCR检测早期成骨指标碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）和晚期成骨指标骨桥蛋白（osteopontin,OPN）,骨钙蛋白（osteocalcin,OCN）及BMP下游靶基因Id 1、Runx 2等的表达。结果：成功构建了3个重组腺病毒,并筛选出干扰效率最好的AdsiRbpj-2重组腺病毒,转染C3H10T1/2,AdsiRbpj-2可以明显下调BMP9诱导的早期成骨指标ALP的活性及晚期成骨指标OPN、OCN的表达,成骨相关基因Runx 2等的表达也有下降。结论：成功构建了特异性阻断Notch经典信号通路腺病毒载体AdsiRbpj-2,该重组腺病毒能够抑制BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的成骨分化进程,从而进一步证明Notch信号通路在BMP9诱导的MSCs成骨分化过程中有着重要的作用。     

过表达NICD通过下调基因JunB的表达抑制BMP9

目的：研究Notch信号通路在骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic protein 9,BMP9）诱导小鼠间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化过程中的作用及其机制。方法：将细胞分为5组：空白组（Blank,n=3）,BMP9处理组（BMP9,n=3）,空白质粒对照组（BMP9+Control,n=3）,过表达Notch1胞内段质粒（Notch1 intracellular domain,NICD）处理组（BMP9+NICD,n=3）,DAPT处理组（BMP+DAPT,n=3）。通过碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色和钙盐染色分别验证过表达NICD对成骨分化早晚期情况的影响。进一步采用定量逆转录PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-RCR）和Western blot检测基因NICD、Hey1及成骨相关基因Smad-1/5/8、p-Smad-1/5/8、OPN、Runx2、OCN、JunB的表达。结果：早期ALP活性及染色结果显示,NICD组较Control组能显著抑制C3H10T1/2细胞成骨分化过程中ALP的形成[5 d：（33 167.66±2 018.45） vs. （146 451.00±14 889.67）,P=0.000;7 d：（58 981.33±4 724.70） vs. （89 588.66±5 928.32）,P=0.000],γ-分泌酶抑制剂（N-[N-（3,5-difluorophen-acetyl）-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester,DAPT）完全抑制Notch通路时得到相同的结果[5 d：（44 812.66±4 174.94） vs. （146 451.00±14 889.67）,P=0.000;7 d：（64 622.93±4 724.70） vs. （89 588.66±5 928.32）,P=0.000]。茜素红S染色结果显示,NCID抑制钙盐结节的形成,而DAPT阻断Notch通路明显促进钙盐结节形成。qRT-PCR结果表明,NCID组中NICD及靶基因Hey1的表达较Control组明显增加[（3.90±0.02） vs. （0.35±0.01）,P=0.000;（19.79±0.01） vs. （11.80±0.02）,P=0.000],Western blot得到相同结果[（1.32±0.01） vs. （0.19±0.01）,P=0.000],且NICD明显抑制成骨分化相关基因JunB、Runx2、OCN、OPN等的表达[（0.10±0.01） vs. （0.53±0.01）,P=0.000;（0.18±0.01） vs. （0.30±0.02）,P=0.000;（0.36±0.01） vs. （0.62±0.02）,P=0.000;（0.07±0.01） vs. （0.48±0.01）,P=0.000],而转录因子Smad-1/5/8、p-Smad-1/5/8的表达不受影响[（0.74±0.02） vs. （0.73±0.03）,P=0.000;（0.63±0.01） vs. （0.58±0.04）,P=0.000],DAPT阻断Notch通路后上述相关基因的表达明显增加。结论：本实验结果首次证明,NICD激活Notch通路对BMP9诱导的C3H10T1/2细胞成骨分化的抑制作用可能是通过抑制JunB基因发挥作用,而非调控BMP9/Smad（bonemorphogenetic protein 9/drosophila mothers against decapentaplegic）信号通路。     

DLL1在骨形态形成蛋白9诱导骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用

目的 探讨Notch配体Delta-like1(DLL1)在骨形态形成蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)诱导的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化中的作用及机制.方法 利用DLL1重组腺病毒上调永生化小鼠胚胎成纤维细胞(immortalized mouse embryonic fibroblasts,iMEF)中DLL1 mRNA的表达,分别采用细胞化学染色、活性测定对早期成骨指标碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和晚期成骨指标钙盐沉积的影响;其次裸鼠皮下异位成骨实验进一步了解DLL1的体内成骨作用;最后用qRT-PCR、Western blot和荧光素酶检测DLL1对BMP9经典信号通路中Ⅰ型受体、Smad1/5/8磷酸化和Smad结合元件(smad-binding element,SBE)转录活性影响.结果 与对照组相比,DLL1在体外能明显促进BMP9诱导的MSCs早期成骨指标ALP活性和晚期成骨指标钙盐沉积的生成;同时也能明显促进BMP9诱导的MSCs裸鼠皮下异位成骨作用;BMP9信号通路中ALK2表达明显增加,而对ALK1则没有影响;Smad1/5/8蛋白量没有明显变化,而p-Smad1/5/8蛋白及SBE活性明显增加(P＜0.05).结论 DLL1可以促进BMP9诱导的MSCs成骨分化,可能通过影响BMP9信号通路来实现其促成骨作用.     

BMP9和VEGF联合诱导小鼠间充质干细胞成骨分化的体外研究

目的:探讨重组腺病毒介导的骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)和血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)共感染对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的影响。方法:将重组腺病毒介导的BMP9和VEGF分5组感染小鼠间充质干细胞C3H10T1/2,Ad-BMP9组、Ad-VEGF组、AdVEGF+Ad-BMP9组、空载体腺病毒组和空白组,感染7 d后,real-time PCR检测BMP9和VEGF的m RNA水平,real-time PCR检测成骨指标骨钙蛋白(osteocalcin,OC)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的m RNA水平,Western blot检测OPN蛋白的表达,各组细胞行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的定量检测、ALP染色和钙盐沉积的检测。结果:BMP9和VEGF在Ad-VEGF+Ad-BMP9组高效共表达,OC、OPG、OPN m RNA水平和OPN蛋白水平在Ad-BMP9组和Ad-VEGF+Ad-BMP9组的表达明显高于其他各组(P﹤0.05),且在Ad-VEGF+Ad-BMP9组表达最高(P﹤0.05)。Ad-VEGF+AdBMP9组的ALP活性、ALP染色和钙盐沉积明显高于其他各组(P﹤0.05)。结论:联合VEGF可明显增强BMP9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化能力。     

Smad信号通路在骨形成蛋白9促进牙囊干细胞成骨向分化中的研究

目的 探索骨形成蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)在诱导大鼠牙囊干细胞(rat dental follicle stem cells,rDFCs)成骨向分化过程中的Smad信号通路调控机制.方法 重组腺病毒骨形成蛋白9 (recombinant adenoviruses expressing BMP9,Ad-BMP9)转染纯化的第3代rDFCs后,Realtime qPCR、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及活性检测观察BMP9调节rDFCs早期及中晚期成骨能力,茜素红S染色检测钙盐沉积,Western blot检测Smad1/5/8磷酸化水平.结果 BMP9促进rDFCs成骨因子表达:成骨转录因子Runx2、成骨细胞特异性转录因子Osterix、ALP及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)在BMP9刺激组较空白组均明显升高(P＜0.05),钙盐沉积及钙结节形成也明显多于空白组,且BMP9促进了Smad1/5/8蛋白磷酸化水平升高.结论 BMP9通过激活Smad信号通路,提高Smad1/5/8蛋白磷酸化水平从而促进早中晚期成骨因子及碱性磷酸酶表达,促进了rDFCs成骨向分化.     

联合表达BMP2和Sox9促进体外培养间充质干细胞成软骨分化

目的探讨联合表达骨形态发生蛋白2（BMP2）和Sox9对间充质干细胞（MSCs）成软骨分化的影响,为构建组织工程软骨
提供实验依据。方法以小鼠胚胎骨髓MSCs（C3H10T1/2）为种子细胞,重组腺病毒BMP2诱导其分化,联用重组腺病毒Sox9
过表达Sox9信号,重组腺病毒GFP作为对照。Real-Time PCR检测成软骨标志物Ⅱ型胶原（Col2a1）、蛋白聚糖（Aggrecan）、X
型胶原（Col10a1）表达变化;Alcian blue染色了解细胞基质糖胺聚糖合成情况;免疫组化和Western blotting检测Col2a1合成情
况。结果BMP2 能诱导C3H10T1/2 细胞成软骨分化,当与Sox9 联合作用时,Sox9 可促进BMP2 诱导的（Col2a1、Aggrecan、
Col10a1）基因表达上调;促进细胞基质糖胺聚糖、Col2a1蛋白合成。结论BMP2与Sox9联合作用可以促进体外培养MSCs成
软骨分化,可能为组织工程软骨提供新的方法。
     

全反式维甲酸增强骨形态蛋白9诱导间充质干细胞成骨分化作用

目的研究全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)对骨形态蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导间充质干细胞成骨分化的影响及可能机制。方法采用组织化学染色检测各组第5、7天碱性磷酸酶活性变化。Western blot检测各组第9、11天骨桥素蛋白表达水平。茜素红染色检测各组第14、20天钙盐沉积水平。采用Western blot检测各组Smad-1/5/8蛋白磷酸化水平,以及用荧光素酶报告质粒检测BMPR-Smad信号通路的活化程度。结果 ATRA及BMP9均诱导C3H10T1/2细胞碱性磷酸酶活性升高,但ATRA合并BMP9组碱性磷酸酶活性明显强于单用ATRA或BMP9组;BMP9合并ATRA组骨桥素蛋白表达水平高于BMP9组;BMP9合并ATRA较单用BMP9能明显促进钙盐沉积。BMP9合并ATRA组Samd1/5/8磷酸化水平明显强于单用BMP9组,BMPR-Smad报告质粒荧光素酶活性也呈相同变化趋势(P<0.01)。结论 ATRA能增强BMP9诱导间充质干细胞成骨分化的作用,其机制可能与促进Smads信号转导活性有关。