骨髓间充质干细胞与胶质瘤细胞非接触共培养后相关生物学特性分析

目的在体外通过大鼠胶质瘤C6细胞与大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)非接触共培养,以探明BMSCs是否受到肿瘤微环境的作用获得肿瘤细胞的相关生物学特性。方法通过6孔板结合Transwell小室建立BMSCs和C6胶质瘤细胞的共培养体系,以共培养组为实验组,设单独培养的BMSCs为对照组;相差显微镜下观察培养后2组细胞形态学的改变;核干细胞因子(nucleostemin,NS)检测细胞增殖力的变化;荧光定量PCR和Western blot检测细胞中mdm2、p53mRNA水平及其蛋白的变化;免疫荧光法检测神经胶质细胞特异的胶质纤维酸蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)在细胞中的定位及表达。结果共培养后实验组细胞呈现类似胶质瘤细胞样的形态,表达神经胶质细胞特异的GFAP蛋白;NS蛋白反映的细胞增殖能力未发生改变;共培养后实验组p53mRNA水平明显低于对照组(P<0.01),而p53蛋白的表达水平显著高于对照组[(1.63±0.31)vs(0.85±0.12),P<0.05];实验组mdm2mRNA及...     

骨髓间充质干细胞对大鼠胶质瘤细胞的趋化性实验

目的用Transwell细胞迁移实验观察骨髓间充质干细胞是否具有对C6大鼠胶质瘤细胞的趋向性。方法在Transwell培养板的Transwell上室中放置一定量的用B rdU标记的骨髓间充质干细胞,Transwell培养板的培养孔中分别放置:IMDM培养基、C6细胞条件培养液、MRC-5细胞、C6鼠胶质瘤细胞。将以上Transwell培养板在CO2恒温培养箱中培养2h后,然后取胰酶加入培养孔中消化细胞5min,拿掉Transwell上室,取适量细胞悬液滴加在载玻片上,然后将4%多聚甲醛滴加在载玻片上的细胞上将其固定30min,然后对载玻片上的细胞进行B rdU免疫组化染色(S-ABC法)。免疫组化染色处理后,用显微图像分析仪计数载玻片上的阳性细胞数。结果迁移到C6及其条件培养液组的骨髓间充质干细胞明显多于IMDM和MRC-5组,并有统计学意义上的差异,且C6及其条件培养液组之间也有统计学意义上的差异,IMDM和MRC-5组两组之间差异无统计学意义。结论实验表明骨髓间充质干细胞对C6细胞及其分泌的各种因子具有趋向性。     

骨髓间充质干细胞的生物学特性

近年来干细胞治疗是一个热门话题,而骨髓间充质干细胞由于其获取简便,体外扩增简单,低免疫源性,组织修复能力强等特点成为干细胞领域的研究热点之一,也是理想的组织工程种子细胞之一,本文主要对骨髓间充质干细胞的生物学特性做一简单综述.     

清脑灵诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化成神经元样细胞

目的观察清脑灵煎剂是否能诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化成神经元样细胞。方法通过贴壁法分离获得大鼠骨使髓间充质干细胞,体外扩增培养,用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达。用浓度为1mg/mL的清脑灵煎剂诱导MSCs,分别于5h、12h、1d、3d、7d在倒置显微镜下观察细胞形态变化,用免疫细胞化学方法观察被诱导细胞巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果流式细胞仪检示MSCs不表达CD11b、CD45,诱导后细胞的免疫细胞化学示nestin阳性细胞、NSE阳性细胞和GFAP阴性细胞。结论清脑灵能诱导MSCs分化神经元样细胞。     

骨髓间充质干细胞抑制小胶质细胞介导的炎症反应

目的 研究骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMMSCs）对小胶质细胞介导的炎症反应的抑制作用。方法：实验分为四组：组一：小胶质细胞（BV-2)生长于DMEM(High Glucose)培养液中;组二：BV-2细胞生长于加入脂多糖（LPS）的上述培养液中;组三：BV-2细胞、BMMSCs共培养于加入LPS的上述培养液中;组四：骨髓间充质干细胞（BMMSCs）生长于加入LPS的上述培养液中。观察BV-2细胞的生长状态、电镜超微结构变化及其分泌的炎症因子TNF-α表达量的变化。结果：光镜下BV-2细胞密度依次为：组一>组三>组二,组四中BMMSCs生长状态良好;电镜下可见组二BV-2细胞内出现大量肿胀及空泡化的线粒体、内质网等细胞器,少见生长活跃多核仁细胞,同时可见大量崩解细胞,组三细胞状态明显好于组二;BV-2细胞分泌的炎症因子TNF-α表达量依次为组二>组三>组一>组四。结论 BM-MSCs抑制小胶质细胞介导的炎症反应,进而发挥神经保护作用。     

原代培养猴骨髓基质细胞与骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的 :原代培养猴骨髓基质细胞与骨髓间充质干细胞 ,比较两种原代培养细胞形态、生长状况的差异性 .方法 :以骨髓悬液直接贴壁培养的方法获取骨髓基质细胞 ,以Per coll细胞分离介质 (质量浓度 10 73g·L-1)分离出骨髓悬液中的骨髓间充质干细胞 ,用含 10 0mL·L-1胎牛血清的DMEM培养液分别进行培养 ,观察细胞的生长状况 .结果 :原代培养的骨髓基质细胞增殖迅速 ,扩增细胞基本都呈形态均一成纤维样细胞 ,接种 1wk后细胞已长满 ,3wk后可形成钙化结节 .原代培养的骨髓间充质干细胞增殖缓慢 ,细胞增殖情况和增殖细胞形态不均一 ;有一些细胞在 4wk的培养时间内未见明显增殖 ,这些增殖不明显的细胞有的未见明显的伸张 ,呈圆形 ,有的伸展充分 ,成片状 ,偶见有神经元样的细胞出现 ;在培养 2wk后也可见一些出现明显增殖的细胞 ,分别形成克隆团状或条带状的细胞群 .结论 :非诱导条件下原代培养扩增的骨髓基质细胞与骨髓间充质干细胞不同 ,前者种类均一 ,可自发向成骨方向发展 ;后者则表现出间充质干细胞的多向分化潜能 .     

骨髓间充质干细胞的分离培养和生物学性状

目的建立一种体外分离纯化和培养扩增人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的方法,并探讨其生物学特性,为MSCs的进一步应用研究提供数据.方法抽取人骨髓后用Percoll分离液经密度梯度离心法分离得到单个核细胞,以105个细胞/cm2密度接种,培养液为含10%胎牛血清的L-DMEM.倒置相差显微镜及吉姆萨-瑞氏染色观察其形态,MTT法测其生长曲线、流式细胞仪检测细胞周期及表面标记物.结果培养的MSCs 12h后换液,有部分细胞贴壁生长,4～5d可见有集落形成,14～20d左右可达到80%～90%融合,倒置相差显微镜及吉姆萨-瑞氏染色可见细胞形态为梭形、多角形及纺锤状等,生长曲线图显示MSCs增殖活跃,流式细胞仪检测显示约有86%的细胞处于G0、G1期,表面标记物中CD14、CD34、VLA-1、CD45和HLA-DR阴性,而CD44、CD105和CD29阳性.结论成功地建立了一种分离培养人骨髓MSCs的方法,获得的细胞形态多样、增殖稳定.     

微环境诱导骨髓间充质干细胞分化为内皮样细胞

目的通过观察人骨髓间充质干细胞（hMSCs）与成熟内皮细胞非接触共培养表达特异性内皮细胞标志物的情况,探讨微环境依赖性的、体外非接触共培养方法对MSCs向内皮样细胞分化的影响。方法密度梯度离心法分离纯化培养的hMSCs与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在Transwell内共培养,通过流式细胞术检测hMSCs表型,RT—PCR鉴定诱导后hMSCs的CD31、VWF、VE—CadherinmRNA的表达,免疫组化鉴定诱导后hMSCs特异性内皮细胞标志物VCAM1和CD31的表达,透射电镜观察诱导后hMSCs的超微结构。结果细胞培养第2周,开始出现形态学改变,胞体回缩,呈多角形改变。细胞培养第3周,细胞增生速度明显加快,形态学上呈卵圆形或“铺路石”样改变;在基因水平上,RT—PCR显示经典内皮细胞标志物CD31、VWF、VE—cadherin mRNA的高表达;在蛋白水平上,免疫荧光染色CD31、和VCAMl表达阳性;透射电镜下诱导后细胞显示内皮细胞特有的Weibel—Palade小体。结论hMSCs在共培养的微环境中,可以分化成内皮细胞表型,其机制是通过内皮细胞的旁分泌作用,而不需要hMSCs与内皮细胞的直接接触。转化的内皮细胞在形态上、基因、蛋白表达、超微结构等方面均显示了内皮细胞的特征。     

人工模拟胰腺微环境诱导骨髓间充质干细胞分化为胰岛素产生细胞

目的:探讨人工模拟胰腺微环境诱导下骨髓间充质干细胞是否可以转分化为胰岛素产生细胞,并评价其功能.方法:采集兔骨髓间充质干细胞,分为2组.实验组将胰腺碎片整合到镍包被的微载体中,重建胰腺微环境,进行细胞培养,对照组为同期培养的未经诱导的细胞.骨髓间充质干细胞在微环境中培养3～4周后,观察是否有胰岛样细胞团形成.ELISA法检测细胞悬液中胰岛素含量,荧光免疫组化检测细胞团胰岛素和C-肽蛋白的表达,荧光原位杂交(FISH)检测胰岛素和C-肽mRNA的表达,流式细胞仪检测分化的细胞在高糖环境下继续培养3周是否发生凋亡.结果:培养3～4周后倒置显微镜下观察到胰岛样细胞团.实验组基础相胰岛素分泌量为(308.50±14.54)mIU/L,在高糖刺激下为(414.30±28.94)mIU/L,2者相比,差异有统计学意义(t=5.68,P＜0.01);高糖刺激下实验组的胰岛素分泌量高于对照组的(5.21±1.04)mIU/L(t=34.60,P＜0.01).分化的胰岛样细胞团表达C-肽和胰岛素mRNA与蛋白.分化的细胞在高糖环境下继续培养3周未发生凋亡.结论:人工模拟胰腺微环境可以诱导骨髓间充质干细胞转分化为有功能的胰岛素产生细胞,有望替代胰岛细胞治疗糖尿病.     

大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性研究

目的 建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分离和培养扩增的方法。研究MSCs的生物学特性，为利用MSCs作为种子细胞治疗多种疾病提供实验基础。方法通过密度梯度离心、贴壁筛选法分离培养大鼠MSCs，测定其接种贴壁率；在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化，利用MTT法测定MSCs生长曲线；并应用流式细胞术测定细胞周期和表面标记物。结果MSCs体外培养生长状况良好，具有活跃的增殖能力，接种10h后贴壁率为96％以上；细胞周期显示有91．4％处于G0／Gl期；培养的MSCs阳性表达CD29、CD44，阴性表达CD34、CD45。结论在实验条件下，体外培养8代以前的MSCs生长稳定，增殖较快，细胞周期表现出较早期细胞特点，可作为组织工程的种子细胞。     

Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin 4 induce the malignant transformation of the bone marrow-derived human adult mesenchymal stem cells

Background  The purpose of the study was to examine the effects of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and interleukin 4 (IL-4) on the bone-marrow-derived human adult mesenchymal stem cells (hMSCs).

Methods  The hMSCs were isolated and cultured with GM-CSF and IL-4 for a period of one month. A single colony of transformed cells was then isoloated and their phenotype was characterized by morphology, surface marker expression, and in vivo tumorigenesis.

Results  After one month culture, the transformed mesenchymal cells exhibited the morphology and phenotype similar to those of tumor cells, and also caused multiple fast growing lung deposits when it was injected into immunodeficient mice.

Conclusion  Cytokines-driven malignant transformation of hMSCs may be a useful model for studying signaling pathways initiating malignant transformation of hMSC.

     

EphB6在小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中的初步研究

目的探讨EphB6在小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSC)成骨分化中的作用及其可能机制。方法将BMSC通过双相接种法接种于脱钙骨基质,分为4组:成骨诱导5、14 d(A、B组),普通培养5、14 d(C、D组),茜素红染色检测钙结节,定量检测各组碱性磷酸酶活性,Runx2、Osterix和EphB6的mRNA表达,采用游离态配体ephrinB1-Fc激活EphB6并重复检测上述指标。结果 ALP活性、Runx2和Osterix在A、B组增高,且B组检测到最高的ALP活性[(7.32±2.02)金氏单位/100 ml]、Runx2(3.442 6±0.258 5)倍和Osterix(2.482 3±0.329 2)倍。EphB6的表达水平在A、B组降低,且在B组最低(0.754 3±0.023 5)倍。以ephrinB1-Fc激活EphB6后,茜素红染色显示钙结节明显减少,ALP活性显著下降(P<0.05),在高浓度配体作用后ALP活性[(12.20±1.30)金氏单位/100 ml]较低浓度配体[(15.40±1.03)金氏单位/100 ml]有进一步下降(P=0.008)。配体作用后,BMSC成骨分化中Runx2和Osterix的表达显著下降。结论 EphB6通过调控Runx2和Osterix抑制BMSC成骨分化。     

Effect of EphB6 on osteogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells

目的 探讨EphB6在小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSC)成骨分化中的作用及其可能机制.方法 将BMSC通过双相接种法接种于脱钙骨基质,分为4组:成骨诱导5、14 d(A、B组),普通培养5、14 d(C、D组),茜素红染色检测钙结节,定量检测各组碱性磷酸酶活性,Runx2、Osterix和EphB6的mRNA表达,采用游离态配体ephrinB1-Fc激活EphB6并重复检测上述指标.结果 ALP活性、Runx2和Osterix在A、B组增高,且B组检测到最高的ALP活性[(7.32±2.02)金氏单位/100 ml]、Runx2( 3.442 6±0.2585)倍和Osterix(2.4823±0.329 2)倍.EphB6的表达水平在A、B组降低,且在B组最低(0.754 3±0.023 5)倍.以ephrinB1-Fc激活EphB6后,茜素红染色显示钙结节明显减少,ALP活性显著下降(P＜0.05),在高浓度配体作用后ALP活性[(12.20±1.30)金氏单位/100 ml]较低浓度配体[(15.40±1.03)金氏单位/100ml]有进一步下降(P＝0.008).配体作用后,BMSC成骨分化中Runx2和Osterix 的表达显著下降.结论 EphB6通过调控Runx2和Osterix抑制 BMSC成骨分化.     

GM-CSF in combination with IL-4 induce the malignant transformation of the bone marrow-derived human adult mesenchymal stem cell

Objective: In this study we examined the effect of GM-CSF in combination with IL-4 on the bone marrow derived human adult mesenchymal stem cells (hMSCs). Method: The hMSCs were isolated and cultured with GM-CSF and IL-4 for one month, and then we isolated the single colony of transformed cells and characterized the phenotype of them by morphology, surface marker expression and in vivo tumorigenesis. Result: After one month culture, the transformed mesenchymal cells exhibited the morphology and phenotype similar to tumor cells, causing multiple fast growing lung deposits when injected into immunodeficient mice. Conclusion: Cytokines-driven malignant transformation of hMSCs may be a useful model for studying signaling pathways initiating malignant transformation of hMSC.     

小鼠骨髓间充质干细胞的体外培养和鉴定

目的建立一种实用高效的小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的体外分离培养方法,并进行初步表型鉴定。方法采取贴壁细胞分离法分离和培养MSCs。倒置显微镜观察原代及传代细胞的形态及生长过程,使用免疫细胞化学方法进行MSCs的初步表型鉴定。结果 MSCs贴壁生长,形态均一,呈成纤维缓胞样,生长状态良好。免疫细胞化学检测CD44、CD105、CD34阳性率分别为94.3%、82.3%、3.3%。结论采用贴壁培养法可分离培养出高纯度的MSCs。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养和鉴定

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离培养方法及其生物学特性。方法采用全骨髓贴壁培养法获得大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞,通过成骨、成脂肪诱导分化以及流式细胞仪分析其表面标记（CD29、CD34、CD45、CD90）等鉴定BMSCs特征。结果全骨髓贴壁培养法获得的BMSCs,原代和传代培养具有活跃的增殖能力;BMSCs经诱导后可分别向成骨、成脂转化;流式分析表面标志分子高表达CD90（96.5%）、CD29（92.3%）,低表达CD34（0.89%）、CD45（1.41%）。结论全骨髓贴壁培养法可有效地分离和扩增BMSCs,分离培养的BMSCs具有潜在的多向分化能力。     

间充质干细胞定向成骨细胞分化的蛋白质组学分析

目的:探讨用蛋白质组学方法分析人骨髓间充质干细胞(MSCs)定向成骨细胞诱导分化中细胞蛋白表达谱的改变. 方法: 从人骨髓细胞中分离获得MSCs,经细胞表型及多向分化能力测定鉴定MSCs的纯度和功能后,采用定向成骨细胞分化诱导培养体系,于分化后14 d分别提取未分化细胞及分化后细胞的总蛋白,双向电泳分析,确定蛋白差异点,经酶切后行蛋白肽质量指纹谱鉴定差异蛋白表达. 结果: 双向电泳找到38个蛋白差异点,质谱分析鉴定出23个差异蛋白分子表达. 结论: 用蛋白质组学方法可高通量筛选与MSCs定向诱导成骨细胞分化相关的重要蛋白.     

BrdU体外标记大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的 探讨连续培养的骨髓间充质干细胞(MSCs)的5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)最佳标记时间、剂量。方法 差速贴壁法对SD鼠MSCs进行体外传代培养;第6代细胞行流式细胞仪鉴定细胞的表面抗原;以终浓度分别为5、10、15μmol/L的BrdU检测最佳标记剂量;在细胞生长融合前72、48、36、24、12、3h加入BrdU,使终浓度为10μmol/L,并分别孵育至细胞融合,测定BrdU的标记率,找出最佳标记时间;免疫组化分析BrdU标记率。结果 流式细胞仪检测所标记的细胞表达CD29和CD44,不表达CD11b和CD45;终浓度为10μmol/L和孵育48hBrdU标记率均>98%,并且连续传5代均可检测到。结论 传代后贴壁生长的梭形细胞为MSCs,终浓度为10μmol/L和孵育48hBrdU标记率均>98%,且可以连续检测到,提示BrdU标记可用于MSCs移植入体内后存活、生长和分化的动态观察。     

SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的 建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法,研究BMSCs的生物学特性,为后续细胞移植和基因治疗提供理想的种子细胞.方法 全骨髓贴壁培养法分离大鼠BMSCs,体外培养和连续传代,在倒置相差显微镜下连续观察细胞的形态变化,利用MTT法测定其生长曲线,流式细胞仪鉴定其表面抗原,成...