体外定向诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞向许旺细胞样细胞分化的研究

目的  探讨体外定向诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)向许旺细胞样细胞转化的有效方法。 方法  分别进行成年大鼠许旺细胞原代培养和BMSC分离培养。根据诱导方法不同, 分为化学诱导组和共培养诱导组。采用显微镜观察许旺细胞和BMSC的生长情况, 分别采用免疫荧光化学染色法[检测神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体和S-100抗体等许旺细胞标志蛋白]和流式细胞术鉴定两种细胞; 显微镜下动态观察两组细胞的形态和生长情况; 共培养诱导组共培养3 d后, 化学诱导组诱导作用4 h、1 d后分别采用免疫荧光化学染色的方法评估两组细胞的诱导分化情况。 结果  化学诱导组诱导后的细胞发生了明显的许旺细胞样细胞形态改变, 预诱导4 h后即出现GFAP抗体表达阳性, 维持诱导1 d后, GFAP抗体阳性表达率为(80.9±3.5)%, S-100抗体阳性表达率为(59.0±1.1)%。诱导2 d后分化细胞开始出现脱落死亡, 3 d后大部分分化细胞脱落死亡。共培养诱导组共培养3 d后, 被诱导的BMSC未出现类似化学诱导组明显的细胞形态改变, GFAP抗体阳性表达率为(89.8±2.4)%, S-100抗体阳性表达率为(80.9±1.7)%。共培养诱导组S-100、GFAP抗体阳性表达率均高于化学诱导组, 差异均有统计学意义(均为P < 0.01)。 结论  共培养诱导法不仅对BMSC向许旺细胞样细胞定向分化具有明确的效果, 而且对BMSC的存活和增殖均有促进作用, 因此该法相对于化学诱导法更加安全和有效。     

人嗅鞘细胞与骨髓间充质干细胞体外共培养的实验研究

[目的]通过体外共培养观察人嗅鞘细胞(OECs)对骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖分化的影响.[方法]取5个月以上引产胎儿嗅球及骨髓,分离培养及鉴定OECs及MSCs,携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的腺相关病毒转染标记OECs,双苯亚甲胺荧光染料标记MSCs,将两种细胞按1∶1比例进行共培养,MSCs单独培养组为阴性对照组,免疫细胞化学方法检测MSCs表达巢蛋白(nestin)、神经元特异性核蛋白(NeuN)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF-M)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)情况.[结果]MOI值为1×106时OECs表达GFP阳性率为84.89％,对细胞生长活性无明显影响.共培养时两种细胞生长良好,共培养7d未见形态学改变,经复方丹参注射液诱导后部分MSCs呈现神经元样改变,表达nestin、NSE、NeuN、NF-M、GFAP特异性标志,且共培养组的分化率明显高于单独MSCs培养组,有显著性差异.[结论]OECs可通过分泌可溶性物质及细胞之间的相互作用启动MSCs分化程序,提高MSCs向神经细胞分化率.     

同种异体共培养大鼠骨髓间充质干细胞的神经分化诱导鉴定

目的：探讨同种异体大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）在体外的共培养方法，并行神经分化诱导。方法：分别通过全骨髓直接培养法及密度梯度法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，各传至第3代后。取等量细胞混合后共培养，共培养的细胞再次传代后进行神经方向诱导，并行Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色鉴定。结果：共培养的大鼠骨髓间充质干细胞经诱导分化后出现神经元和胶质细胞形态，经Nestin、NSE、GFAP免疫细胞化学染色证实为神经细胞。结论：同种异体共培养的骨髓间充质干细胞可在体外定向诱导为神经元和胶质细胞等神经细胞。     

成人骨髓基质干细胞的体外培养及初步诱导分化研究

目的:探讨体外培养人骨髓基质干细胞(BMSC)的方法和初步诱导BMSC向神经细胞方向分化的方法。方法:采用正常成人献髓者骨髓,分离扩增BMSC,原代培养后将传1～4代细胞按1×104/ml种于24孔板,绘制生长曲线、贴壁率,观察细胞生长及不同浓度的碱性成纤维生长因子(bFGF)对BMSC的作用。以全反式维甲酸(RA)和bFGF为诱导剂,观察诱导前后BMSC的变化。结果:原代BMSC生长状态良好,传至第5代仍保持干细胞特性,bFGF可明显促进BMSC增殖,且呈剂量依赖关系。RA和bFGF诱导12h,BMSC逐渐向神经样细胞转化,胞体收缩成锥形、三角形或不规则形,细胞伸出细长突起,免疫细胞化学鉴定呈Nestin阴性,NSE阳性,GFAP阳性,且NSE阳性细胞数较GFAP阳性为少。结论:BMSC可在体外稳定扩增,且能保持干细胞特性,RA和bFGF可诱导其分化为神经细胞。     

与雪旺细胞共培养诱导脂肪来源干细胞向神经元样细胞分化的实验研究

目的探讨非接触共培养条件下,大鼠SCs对脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的诱导分化效应,为神经组织工程寻找理想种子细胞提供参考。方法取新生1~2 d SD大鼠双侧坐骨神经,酶消化法分离培养SCs,并行S-100免疫荧光染色鉴定。取成年雄性SD大鼠腹股沟和腹膜后脂肪组织,差速贴壁法纯化获得ADSCs并传代,流式细胞仪检测第3代细胞表型CD29、CD34、CD45、CD73、CD90和CD105。取原代SCs和第3代ADSCs按2∶1比例于Transwell共培养系统共培养(实验组),以单纯培养ADSCs作为对照组。倒置相差显微镜下观察细胞形态学改变,培养14 d流式细胞仪检测神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)表达,免疫荧光染色观察微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP2)、神经元核蛋白(neuronal nuclei protein,Neu N)和胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)神经元特异性标志物表达情况,并计算阳性细胞率。结果成功分离培养ADSCs并能连续传代,流式细胞仪检测示其高表达CD29、CD90、CD73和CD105,低表达CD34和CD45。倒置相差显微镜下见,实验组共培养后原本呈梭形的ADSCs以胞核为中心收缩,胞体折光性增强,胞体伸出多个长而粗的突起;对照组ADSCs形态无显著变化。流式细胞仪及免疫荧光染色示,共培养后14 d实验组均表达神经元特异性标志物NSE、MAP2、Neu N、GFAP,且阳性细胞率显著高于对照组(P0.01)。结论 SCs与ADSCs非接触共培养,两者不仅能够共生,且SCs能显著促进ADSCs向神经元样细胞分化。     

大鼠雪旺细胞对脊髓源性神经干细胞生长及分化的影响

目的 观察雪旺细胞(SCs)在体外对脊髓来源的神经干细胞(NSCs)生长及分化的影响.方法 分别从胎鼠脊髓和出生24 h内的SD大鼠坐骨神经分离培养NSCs及SCs并鉴定.实验分成对照组:NSCs单独培养组;A组:脑源性神经营养因子(黼)与NSCs共培养组;B组:SCs与NSCs共培养组;C组:BDNF+SCs与NSC共培养组.观察NSCs的形态学变化,计数并测量细胞团的数量及直径.利用免疫细胞化学方法检测神经元样细胞的表达并计算其百分率及阳性细胞突起的平均长度.结果 来源于新生大鼠脊髓组织的NSCs能够表达NSCs的标志物神经巢蛋白(Nestin),NSCs可分化为神经元及星形胶质细胞;72 h,A、B、C组细胞团的数量及细胞团的平均直径,均大于对照组(P＜0.05);传代培养3 d、7 d、14 d的NAP-2染色阳性神经元样细胞所占的百分率及阳性细胞突起平均长度均大于对照组(P＜0.05).结论 大鼠SCs在体外能够促进脊髓来源的NSCs生长并诱导其定向分化.     

嗅鞘细胞移植调节星形细胞活性促进急性脊髓损伤大鼠神经功能恢复

[目的]探讨嗅鞘细胞(OECs)对急性脊髓损伤大鼠星形胶质细胞(AST)激活的影响。[方法]乳鼠嗅球制备嗅鞘细胞,制备急性脊髓损伤模型,随机分为3组,空白组:T_(9-11)椎板去除;对照组:T_(10)脊髓损伤,DMEM/F_(12)移植;实验组:T_(10)脊髓损伤,OEC移植。行BBB评分和体感诱发电位检测评价神经功能,Western Blot检测GFAP、CSPG、bFGF表达变化,观察脊髓损伤后星形胶质细胞激活情况及OEC移植对其影响。[结果](1)脊髓损伤后GFAP阳性细胞数目增加,实验组少于对照组,尼氏染色及NF-200阳性细胞数目实验组多于对照组,差异有统计学意义;(2)Western Blot:脊髓损伤后GFAP、CSPG表达增加,bFGF表达下降,OEC干预后,GFAP、CSPG表达较对照组下降。bFGF表达增加;(3)神经功能:脊髓损伤BBB评分及SEP显示治疗组大鼠神经功能得到改善。[结论]嗅鞘细胞移植可抑制星形胶质细胞增殖,调节因子分泌,促进大鼠脊髓损伤恢复。     

嗅鞘细胞条件培养液对骨髓基质干细胞的诱导分化作用研究

[目的]探讨大鼠嗅神经鞘细胞条件培养液对同种大鼠骨髓基质干细胞的诱导分化作用。[方法]通过差速贴壁法获得较高纯度的嗅鞘细胞，在接种培养后的9～12d，收集并制备嗅鞘细胞条件培养液，与纯化培养第3代的骨髓基质干细胞共培养，观察其诱导分化后的形态学变化，免疫荧光染色鉴定诱导分化结果。[结果]发现大鼠嗅鞘细胞条件培养液对同种大鼠骨髓基质干细胞有明显的诱导分化作用，在72h时荧光显微镜下观察并计算MAP-2和GFAP阳性细胞的比率分别为55％、23％。[结论]大鼠嗅鞘细胞条件培养液有明显的诱导同种大鼠骨髓基质干细胞向神经样细胞分化的作用。     

SPIO标记骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养的研究

[目的]探讨SPIO标记骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养的可行性,为临床修复关节软骨损伤寻找新途径.[方法] 分离、扩增新西兰大白兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)和软骨细胞,根据SPIO标记(50μg/ml)和不同培养环境(共培养、单独培养)分4组,每天在倒置显微镜观察共培养后BMSCs的形态变化,共培养14 d后,免疫组化检测Ⅱ型胶原表达情况,阿利新蓝法检测蛋白多糖(GAG)表达水平.[结果] 共培养7 d后标记的部分BMSCs变圆,14 d时BMSCs形态高度分化与成熟软骨细胞相似,其蛋白多糖和Ⅱ型胶原的基因转录和蛋白表达均增高,明显优于对照组,差异具有显著性意义(P<0.01).[结论]1.软骨细胞微环境能有效诱导BMSCs向软骨细胞分化;2.SPIO可以安全、有效地标记BMSCs.     

嗅鞘细胞体外诱导神经干细胞分化的实验研究

目的:研究嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)体外诱导神经干细胞(neuron stell cells,NSCs)分化的作用.方法:分别从3月龄SD大鼠的嗅球和新牛SD大鼠的海马中分离OECs及NSCs.进行体外分离、培养及免疫荧光鉴定.构建OECs与NSCs共培养体系,分为3组,纯化培养的OECs+NSCs组,末纯化培养的OECs+NSCs组,单纯NSCs组.共培养后4、8、12d行神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫荧光鉴定,统计NSCs分化为神经元的百分率.结果:经P75和S100双重免疫荧光鉴定所培养的细胞为OECs,经巢蛋白抗体(Nestin)免疫荧光鉴定所培养的细胞为NSCs.荧光显微镜观察可见被特异件烯醇化酶一异硫氰酸荧光素(NSE-FITC)荧光标记的神经元大多为多极神经元,少部分为双极神经元或假单极神经元,带有较长的轴突.在各时时间点,共培养组中可见到多个神经元聚集生长,神经元数目明显多于单纯NSCs培养组,而共培养组之间无明显差别.共培养后12d,共培养组中NSCs分化为神经元的百分率大约为23%,而单纯NSCs培养组约为4%.在各时间点,共培养组神经元的转化率与单纯NSCs培养组神经元的转化率之间有显著性差异(P<0.001),而共培养组之间的差异无统计学意义(P>0.05).结论:OECs在体外能够有效诱导NSCs向神经元转化.     

活化的肝星状细胞促进调节性T细胞的表达

目的 越来越多的研究证实,活化的肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)具有免疫抑制功能.本研究观察了HSCs对T细胞介导的适应性免疫应答的影响及其与调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)的关系.方法 分离培养小鼠HSCs,运用混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR),体外观察活化的HSCs对T细胞增殖和Treg细胞的影响.结果 活化的HSCs能导致树突状细胞(dendritic cells,DCs)介导的适应性免疫应答中T细胞的低反应性:抑制T细胞的增殖,同时诱导Treg细胞的表达.结论 活化的HSCs能通过促进Treg细胞表达而诱导适应性免疫应答中T细胞的活化无能,促进免疫耐受.     

人外周血单个核细胞体外诱导成为破骨细胞样细胞阳性率研究

目的研究人外周血单个核细胞体外诱导成为破骨细胞样细胞阳性率。方法将人外周血以密度梯度离心方法分离出单个核细胞，实验组在地塞米松、1，25（OH）2D3和M—CSF的存在下，在盖玻片和骨磨片上与UMR106细胞共同培养20天，对照组除不与UMR106共培养外，其余条件与实验组相同。结果在培养20天后，实验组电镜检查发现有多核巨噬细胞形成，有伪足，骨磨片上有骨吸收陷窝形成，盖玻片上有TRAP染色阳性细胞形成，其细胞阳性率约为3％，对照组没有TRAP阳性细胞形成。结论人外周血单个核细胞在地塞米松、1，25（OH）2D3和M-CSF的存在下，与UMR106细胞共同培养有TRAP阳性细胞形成，其细胞阳性率约为3％，提示可能在单核，巨噬细胞分化较早阶段就决定了哪些细胞能被诱导成为OLC。     

骨髓基质细胞转化为神经细胞的研究

目的 探讨骨髓基质细胞体外转化为神经细胞的可能性。方法 骨髓基质细胞原代培养、传代后使用3种不同方法诱导。行大体观察，免疫组织化学，及细胞电生理检查和长期培养研究。结果 骨髓基质细胞体外可诱导为突触明确的神经细胞。诱导率分别为80％、10％和40％；诱导后细胞表面有神经特异性抗原NSE、GFAP表达；同时具有早期神经细胞电流特性。结论 骨髓基质细胞可横向转化为早期神经细胞。     

Sertoli细胞与成人胰岛细胞共同培养的研究

目的观察塞尔托利（Sertoli）细胞对体外培养的成人胰岛细胞形态、存活率及功能的影响。方法胰腺、睾丸取自志愿捐赠的成年男性尸体多器官供者,共12例。分离纯化后的成人胰岛细胞分为单独培养组和共同培养组,单独培养组取成人胰岛细胞单独培养,共同培养组为成人胰岛细胞＋Sertoli细胞共同培养,均在RPMI1640培养液培养14d,采用倒置相差显微镜观察胰岛细胞形态,比较两组的胰岛细胞存活率、胰岛素分泌量和胰岛素刺激指数。结果培养14d后,共同培养组胰岛细胞存活率为（90±3）%,较单独培养组的（57±4）%明显提高（P〈0.01）,胰岛细胞的形态亦较单独培养组完整。共同培养组胰岛细胞始终对葡萄糖刺激保持较高的敏感度,而单独培养组胰岛细胞对葡萄糖刺激的敏感度随时间的延长明显降低（P〈0.05）。培养14d后,共同培养组的胰岛素分泌量为（249±12）mIU/L、胰岛素刺激指数为8.15±0.64,而单独培养组则分别为（47±7）mIU/L和1.68±0.34,两组比较差异有统计学意义（均为P〈0.01）。结论成人胰岛细胞与Sertoli细胞共同培养可以提高胰岛细胞的存活率,改善胰岛细胞的功能。     

骨细胞及干细胞分泌的外泌体在骨重塑中的作用

外泌体是由多泡体与细胞膜融合后,以外分泌的形式释放到细胞外的直径为30~100 nm的细胞外囊泡,目前大量研究发现其广泛参与骨相关疾病及骨重塑过程,具有较好的生物学活性。由于成骨细胞和破骨细胞之间的动态平衡在骨重塑过程中起关键作用,而且干细胞在骨重塑方面已显示了巨大的前景,因此,本文就骨细胞及干细胞分泌的外泌体在骨重塑中的作用进行综述,希望能为骨科相关疾病的防治提供研究思路。     

常用免疫抑制剂对Tfr细胞和Breg细胞的作用研究

目的  探讨常用免疫抑制剂对滤泡调节性T细胞(Tfr细胞)和调节性B细胞(Breg细胞)的作用。 方法  收集6例健康志愿者的外周血(每例5 mL), 采用人淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞进行培养, 将细胞分为对照组(未加入免疫抑制剂)、环孢素组(250 ng/mL)、他克莫司组(10 ng/mL)和西罗莫司组(10 ng/mL), 分别用相应免疫抑制剂刺激48 h。用流式细胞仪检测各组淋巴细胞中Breg细胞和Tfr细胞的比例; 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组上清液中白细胞介素(IL)-21的含量。结果  与对照组比较, 环孢素组、他克莫司组和西罗莫司组淋巴细胞中Breg细胞的比例均升高, 差异均有统计学意义(均为P < 0.05);环孢素组和他克莫司组淋巴细胞中Tfr细胞比例均升高, 差异均有统计学意义(均为P < 0.05);西罗莫司组淋巴细胞中Tfr细胞比例下降, 差异亦有统计学意义(P < 0.05)。ELISA检测结果显示, 与对照组比较, 环孢素组和他克莫司组上清液中IL-21含量均下降, 差异均有统计学意义(均为P < 0.05);西罗莫司对IL-21分泌的影响不大, 差异无统计学意义(P > 0.05)。结论 环孢素和他克莫司具有抑制B细胞免疫反应的作用。     

肌源性干细胞分离培养及诱导分化为平滑肌细胞的研究

目的探讨兔肌源性干细胞分离、鉴定及诱导分化为平滑肌细胞的方法。方法取1．5个月龄新西兰兔大腿肌肉，采用Preplate技术分离培养肌源性细胞，并进行流式细胞仪（FCM）、免疫细胞化学、Western blot等确定细胞表型。采用添加血管内皮生长因子（VEGF）和与兔阴茎海绵体平滑肌细胞（CCSMC）共培养的方法诱导分离而得的细胞分化为平滑肌细胞并运用免疫细胞化学和Western blot检测特异性α-平滑肌肌动蛋白（α—SMA）的表达。结果经过连续6d的差速贴壁分离得小圆形或短梭形的小体积细胞，FCM结果显示这些细胞〉80％为desmin＋，〉70％为bcl-2^＋，〉95％为CD45^-。免疫细胞化学定性结果显示desmin＋。高汇合度（〉50％）或低血清培养时容易融合形成肌管或肌细胞核链。诱导处理后分离的细胞表达α—SMA。结论采用Preplate技术能很好地分离出肌源性干细胞，并能在体外诱导分化为平滑肌细胞，为组织工程提供种子细胞。     

兔雪旺细胞的培养方法及形态学研究

利用兔坐骨神经组织进行体外细胞培养研究，获得了雪旺细胞。兔雪旺细胞的形态与其他文献报道的鼠或人的外周神经培养获得的雪旺细胞形态基本相似，典型的雪旺细胞形态特征为胞体较小、梭形、两侧突起纤长、核窄长。倒置显微镜下看，胞体四周常有亮边，细胞成极性生长排列。通过免疫组织化学染色证实具有典型形态的梭状细胞为雪旺细胞，而扁平状形态不规则的细胞为成纤维细胞     

结缔组织生长因子对Kupffer细胞诱导的肝星状细胞激活的影响

目的 探讨肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)表达对Kupffer细胞(Kc)诱导的HSC激活的影响.方法 构建含CTGF的RNA干扰载体.将肝星状细胞系rHSC-99分为3组:对照组、空载体组和RNA干扰组.采用RT-PCR方法 检测HSC的CTGF表达.分离培养KC,建立各组HSC与KC的共培养体系,MTT检测HSC的增殖情况;RT-PCR检测HSC的TGF-β1、I型前胶原的表达;Western Blot检测HSC的TGF-β1表达,ELISA检测共培养上清中I型胶原的表达;免疫荧光化学检测HSC的α-SMA的表达. 结果 构建CTGF的RNA干扰载体Psilencer 3.1H1-Neo-CTGF.RNA干扰后CTGF表达降低22%.KC得率为5×107,活率＞98%.在HSC和KC共培养体系中,RNA干扰HSC的CTGF表达后,与KC共培养的HSC活化和增殖明显被抑制,与对照组相比,HSC的增殖降低29%(t:20.17,P＜0.01).Ⅰ型前胶原和α-SMA的表达下降38%,细胞培养上清中Ⅰ型胶原的分泌量下降48%(t=12.18,t=7.81,t=15.96,均P＜0.05).TGF-β表达则没有明显的变化.结论 阻断HSC的CTGF表达能抑制由KC诱导的HSC激活.     

髓源性抑制细胞在肿瘤进展过程中与相关免疫细胞的作用

髓源性抑制细胞是一群异质性细胞的统称,包括各种分化状态的骨髓祖细胞、未成熟粒细胞、巨噬细胞和树突细胞等.髓源性抑制细胞可以抑制肿瘤毒性自然杀伤细胞和自然杀伤T细胞介导的固有免疫,以及CD4+CD8+T细胞介导的适应性免疫,并与巨噬细胞、树突细胞、调节性T细胞等有着密切联系,在肿瘤的发生、发展过程中起着重要的作用.