hTERT启动子特异驱动IL-24重组腺病毒的包装及鉴定

目的 包装并鉴定人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子特异驱动白介素-24（IL-24）的重组复制缺陷型腺病毒.方法 全基因合成优化后的hTERT启动子,插入质粒pGL3-basic的多克隆位点（pGL3-phTERT）;从人外周血单核细胞扩增IL-24,插入pGL3-phTERT质粒的hTERT启动子下游获得pGL3-phTERT-IL24;随后将phTERT-IL24插入pShuttle中间质粒,使用AdEasy^TM Adenoviral Vector System包装Ad-phTERT-IL24重组腺病毒;同时包装CMV启动子驱动IL-24的腺病毒载体为阴性对照（Ad-CMV-IL24）,以空载腺病毒Ad作为空白对照.用20 MOI重组腺病毒感染SGC-7901、MKN-45、HF细胞,采用PCR及Western blot检测IL-24在RNA及蛋白水平的表达.结果 成功包装Ad-hTERT-IL24重组腺病毒.感染Ad-hTERT-IL24后,hTERT阳性肿瘤细胞内IL-24表达显著上调,但hTERT阴性的HF细胞则无IL-24表达;感染阴性对照Ad-CMV-IL24后,hTERT阳性或阴性细胞内均有IL-24表达,感染空白对照Ad后,hTERT阳性或阴性细胞内均无IL-24表达.结论 Ad-hTERT-IL24腺病毒载体可有效介导IL-24特异表达于hTERT阳性肿瘤细胞内.     

mda-7/IL-24腺病毒对小细胞肺癌NCI-H446细胞增殖的抑制作用研究

目的构建mda-7/IL-24腺病毒,检测其对小细胞肺癌NCI-H446细胞增殖的影响。方法将mda-7/IL-24cDNA亚克隆至腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack-CMV中,在大肠杆菌BJ5183中将重组病毒穿梭质粒和骨架质粒重组。在HEK293细胞中进行病毒包装和扩增,用PCR方法鉴定后,通过TCID50法测定病毒滴度。用滴度为50pfu/细胞的重组腺病毒Ad·mda-7/IL-24感染NCI-H446细胞72h后,经MTT实验检测其对细胞增殖的影响,并用Westernblot方法检测mda-7/IL-24在NCI-446中的表达。结果核酸序列测定和PCR鉴定表明成功构建Ad·mda-7/IL-24;TCID50法测定扩增的腺病毒滴度为2×1010pfu/ml。Ad·mda-7/IL-24在NCI-H446细胞中表达MDA-7/IL-24,MTT检测表明Ad·mda-7/IL-24明显抑制NCI-H446细胞生长,抑制率为21·37%。结论重组腺病毒Ad·mda-7/IL-24能显著抑制NCI-H446细胞增殖,为研究mda-7/IL-24的作用机制及将其用于小细胞肺癌的基因治疗提供了条件。     

热应激通过激活NLRP3/IL-1β/IL-6途径介导肝脏炎症损伤效应

目的 探究热应激致肝炎症损伤的分子机制.方法 雌性SD大鼠随机分为对照组和热应激组,38℃暴露建立热应激动物模型,每天暴露2 h,连续3 d,分离肝组织;体外培养的L-02细胞分为对照组、热应激组、热应激+二甲基亚砜(DMSO)组及热应激+白藜芦醇组(100μmol/L),采用5％CO2,41℃暴露建立热应激细胞模型,...     

重组腺病毒介导mIL-12 基因转染的 EL-4细胞生物学特性的研究

目的：观察 ｍ Ｉ Ｌ１２ 基因转染的小鼠 Ｅ Ｌ４ 细胞（ Ｃ５７ Ｂ Ｌ／６ 小鼠 Ｔ 淋巴瘤细胞株）体外生物学特性的改变。方法：阳离子脂质体协同 Ｉ Ｌ１２ 重组腺病毒感染 Ｅ Ｌ４ 细胞。结果及结论：基因转染的 Ｅ Ｌ４ 细胞有 ｍ Ｉ Ｌ１２ 的 ｍ Ｒ Ｎ Ａ 表达,培养上清中可以检测到 ｍ Ｉ Ｌ１２ 的生物学活性。与野生型 Ｅ Ｌ４ 细胞相比,ｍ Ｉ Ｌ１２ 重组腺病毒感染的 Ｅ Ｌ４ 细胞形态及体外增殖能力无明显改变, 转染细胞的成瘤性降低。此外,研究结果还表明,阳离子脂质体能显著提高腺病毒的感染效率。     

IL-15与IL-21细胞因子组合优化临床级人NK细胞培养体系

目的探讨IL-15、IL-21细胞因子组合建立的临床级人NK细胞培养体系对NK细胞增殖、免疫细胞表型和细胞毒作用的影响。方法分离9例健康志愿者外周血单个核细胞(PBMCs),根据以下3组进行扩增培养:(1)对照组(我科临床级人NK细胞培养体系),(2)IL-15组(对照组+IL-15),(3)IL-15/IL-21组(对照组+IL-15+IL-21)。台盼蓝拒染法计数细胞总数和活力;流式细胞术分析免疫细胞表型和NK细胞活化受体表达;乳酸脱氢酶释放法检测细胞毒活性。结果培养至14 d,IL-15/L-21组细胞总数明显升高,NK细胞增殖倍数达到(761.68±449.30)倍,明显高于IL-15组,差异有统计学意义(P<0.05);IL-15/IL-21组明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。3组培养物中CD3~-/CD56~+细胞百分率比较,IL-15/IL-21组和IL-15组明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),但IL-15/IL-21组和IL-15组比较,差异无统计学意义(P>0.05);3组中CD3~+/CD4~+细胞百分率均呈下降趋势,且IL-15/IL-21组和IL-15组明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),但IL-15/IL-21组和IL-15组比较,差异无统计学意义(P>0.05);3组中总CD3~+细胞百分率比较,IL-15组明显低于对照组(P<0.05),但IL-15/IL-21组和IL-15组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。IL-15/IL-21组NKG2D活化受体表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),但与IL-15组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3组中CD3~+/CD56~+细胞百分率、CD3~+/CD8~+细胞百分率以及NKp46活化受体的表达水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。相同的效靶比,3组细胞的细胞毒作用比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论采用IL-15/IL-21组合优化人NK细胞培养体系,可以选择性地扩增NK细胞,提高培养物中NK细胞数量和细胞总数,以及活化受体NKG2D的表达水平,这将为优化临床级人NK细胞制备体系提供科学依据。     

天花粉蛋白对IL-1β介导下的人牙周膜细胞MMP-1表达的影响

目的 观察天花粉蛋白(TCS)对白细胞介素-1β(IL-1β)介导下人牙周膜细胞基质金属蛋白酶-1(MMP-1)表达的影响,为进一步研究对抗牙根吸收的可能途径提供实验依据.方法 用IL-1β 10 ng/ml作用于体外培养的人牙周膜细胞(hPDLCs),通过噻唑蓝比色测定法(MTT)及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),观察IL-1β对hPDLCs生长状态及MMP-1表达影响;将TCS 0.05 ng/ml作用于IL-1β介导状态下的hPDLCs,观察hPDLCs生长状态及MMP-1表达的变化.结果 在IL-1β及IL-1β复合TCS作用下,hPDLCs的增殖状况无明显改变(P＞0.05);IL-1β介导下,hPDLCs中MMP-1的mRNA表达呈上升趋势.相对于IL-1β单独作用,IL-1β复合TCS作用下,hPDLCs中MMP-1的mRNA表达下调.结论 IL-1β介导下的hPDLCs 的MMP-1表达增高;TCS有抑制IL-1β介导下的hPDLCs MMP-1表达增高作用.     

环孢素A抑制大鼠轴索损伤后血清IL-1β的表达

目的 观察大鼠轴索损伤后血清IL-1β的表达规律,以及环孢素A(CsA)对其表达的影响,探讨CsA的神经保护机制.方法 75只健康雄性SD大鼠随机分为3组:正常对照组(A组)5只、单纯视神经牵拉伤组(B组)35只、CsA处理组(C组)35只,B、C组又分为牵拉伤后或CsA治疗后1,3,6,12 h、1,3,7 d共7个观察时相点,不同时相点各5只大鼠.光镜下观察视网膜神经节细胞(RGCs)和轴索形态学变化,并采用放射免疫方法(平衡法)检测大鼠血清中IL-1β的含量.结果 (1)B组大鼠右侧视神经牵拉伤后3 d,RGCs明显稀疏;伤后7 d,神经纤维排列紊乱,分布稀疏.C组相应的病理变化明显减轻.(2)B组大鼠伤后3,6,12 h、1 d血清中IL-1β浓度明显高于A组,6 h达到高峰,随后逐渐下降,3 d后降至A组水平.C组大鼠血清IL-1β浓度变化规律与B组相似,3,6,12 h、l d血清中IL-1β浓度明显低于B组,但6,12 h、1 d仍高于A组.结论 IL-1β长时间过度表达可能参与了轴索损伤后的继发性病理变化;CsA可能通过减轻轴索损伤后的炎症反应对轴索损伤起保护作用.     

KDR启动子驱动双自杀基因诱导胃癌细胞凋亡的实验研究

目的探讨KDR启动子驱动双自杀基因体系对胃癌细胞凋亡的诱导作用。方法以重组腺病毒AdEasy-KDR-CDglyTK体外感染表达KDR的SCG7901细胞株和不表达KDR的HepG2细胞株,并给予不同浓度的前药GCV和（或）5-FC,观察该体系对SCG7901细胞的杀伤效应。分别应用透射电镜、Hoechest33258／PI染色、流式细胞仪观察细胞超微结构、细胞凋亡率和细胞周期的变化。结果携带双自杀基因（CDglyTK）和报告基因（GFP）的重组腺病毒载体转染后,95％以上SCG7901和HepG2细胞中有GFP表达。表达KDR的SCG7901细胞对前药具有较高的敏感性,不表达KDR的HepG2细胞对前药不敏感（P〈0．01）。两种前药联合应用优于任一前药单独应用的疗效（P〈0．01）。流式细胞术检测表明该体系可抑制SCG7901细胞DNA的合成,表现为s期细胞比例增高及G2期细胞减少。同时,Hoechest33258／PI染色和电镜下可见SCG7901有凋亡改变。结论KDR启动子可以调控融合基因体系选择性地杀伤人胃癌SCG7901细胞,并且该体系可以诱导胃癌细胞凋亡。     

hTERT基因修饰对人外周血树突状细胞生物学行为的影响

目的观察人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因修饰对树突状细胞生物学行为的影响。方法用负载hTERT目的基因的复制缺陷型腺病毒（rAd—hTERT）感染原代培养的人树突状细胞（DC）以获取hTERT基因修饰的DC（DC—hTERT）,采用免疫组化及Westem blot法检测DC-hTERT内hTERT及增殖细胞核抗原（PCNA）的表达;采用流式细胞术检测DC-hTERT表面成熟标志的变化;采用MTT法检测DC-hTERT的增殖能力。结果rAd-hTERT感染DC后hTERT蛋白表达明显增加;流式细胞术检测显示,感染Ad-hTERT后DC表面成熟指标CD83及CD86无明显变化;成熟1312经hTERT修饰后的生长曲线显示,DC-hTERT在前2周数量稍有增加,但DC/PBS及DC/rAd-LacZ数量明显下降,在第3周三者数量均有下降趋势,但DC-hTERT组细胞数量仍明显多于其他两组;Western blot检测显示DC-hTERT内PCNA的表达明显增强。结论hTERT基因表达上调后,DC增殖能力明显增强,衰老速度延缓。     

放射诱导的肿瘤特异性嵌合启动子研究

目的 将放射敏感性的CArG元件与肿瘤特异性的人端粒酶反转录酶(hTERT)基因启动子相结合,构建新的嵌合启动子。方法 构建含不同CArG元件数量的嵌合hTERT启动子,在放射线诱导下(单剂量或分割照射),利用荧光素酶报告基因检测其在肿瘤细胞(HeLa、A549、MHCC97细胞)及正常细胞(hEL细胞)中的活性。结果 包含6个CArG元件的hTERT嵌合启动子较含其他数量CArG的嵌合启动子显示了更好的放射诱导性,并在4～6 Gy时达到顶峰,而构建的嵌合启动子在正常的hEL细胞中活性很低。在肿瘤细胞中,3次2 Gy与单次6 Gy剂量照射相比较,报告基因的表达相当。结论 包含6个CArG元件的肿瘤特异性嵌合启动子具备良好的放射诱导性,这种嵌合的启动子系统具有肿瘤基因治疗的潜力。     

miR-29a抑制胃癌细胞内靶基因VEGF-A的表达及意义

目的 验证胃癌细胞株SGC-7901内miR-29a对靶基因VEGF-A的直接调控作用.方法 采用负载miR-29a的腺病毒载体（Ad-miR29a）感染人胃癌细胞株SGC-7901,上调SGC-7901细胞内miR-29a的表达丰度后,采用RT-qPCR及Western blot法分别检测SGC-7901细胞内VEGF-A在mRNA及蛋白水平的表达;进一步采用双荧光素酶实验及突变实验,验证miR-29a是否通过结合在VEGF-A 3＇UTR而直接抑制靶基因表达.结果 与感染阴性对照Ad-LacZ的SGC-7901细胞相比,感染Ad-miR29a的SGC-7901细胞内VEGF-A蛋白表达下降（0.42±0.02 vs.0.91±0.03,P＜0.01）,且VEGF-A mRNA水平亦下调（0.75±0.21 vs.1.15±0.25,P＜0.05）;荧光素酶实验显示,与阴性对照相比,转染miR-29a mimic后,HEK293细胞萤火虫荧光素酶活性明显下降（0.56±0.13 vs.0.93±0.06,P＜0.05）;而在VEGF-A 3＇UTR与miR-29a的结合位点被突变之后,HEK293细胞萤火虫荧光素酶活性得以恢复.结论 miR-29a通过结合于VEGF-A 3＇UTR相应位点,直接抑制VEGF-A在mRNA及蛋白水平的表达.miR-29a可能成为胃癌基因治疗的有效靶标.     

癌细胞株及胃癌组织端粒酶催化亚基基因表达研究

目的：建立人端普酶催化亚基蛋白质ＲＮＡ逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）,进行恶性肿瘤细胞和胃癌组织检测,探讨其在癌变中的作用,提供一种癌症检测的新方法。方法：制备癌细胞株和胃癌组织端粒酶提取液和总ＲＮＡ,运用端粒重复扩增法（ＴＲＡＰ）和ｈＴＲＴ ＲＮＡ ＲＴ－ＰＣＲ扩增法检测癌细胞株和胃癌组织端粒酶活性和ｈＴＲＴ ＴＮＡ表达。结果：８株癌细胞和６例胃癌组织均有端粒酶活性和ｈＴＲＴ ＲＮＡ表达;９     

载体介导的siRNA对SGC-7901胃癌细胞中hPOT1表达的抑制作用

目的构建人端粒保护蛋白（hPOT1）基因的短链干扰核糖核酸（siRNA）表达载体，观察其在胃癌细胞中抑制hPOT1基因表达的作用，为进一步研究hPOT1在胃癌细胞生长增殖中的作用打下基础。方法设计并化学合成64nt编码hPOT1 siRNA基因片段的寡核苷酸，退火成双链后将其连接到pSUPER质粒的H1 RNA启动子下游，构建psiRNA-hPOT1重组质粒。经酶切、测序鉴定后，用脂质体介导的基因转染方法，转人SGC-7901胃癌细胞，用半定量RT-PCR检测hPOT1表达水平的变化。结果测序结果表明重组质粒psiRNA-hPOT1 64个碱基成功插人到预定位置，并且序列完全一致。hPOT1 siRNA表达载体psiRNA-hPOT1转入胃癌细胞后，可明显抑制SGC-7901细胞hPOT1的表达。结论构建的hPOT1基因的siRNA表达载体psiRNA-hPOT1重组质粒能显著抑制hPOT1基因在SGC-7901胃癌细胞中的表达。     

胃癌细胞株hTERT基因启动子区甲基化分析

目的检测人端粒酶反转录酶(hTERT)基因启动子区甲基化状态。方法采用TRAP法检测细胞端粒酶活性,免疫荧光法观察hTERT表达;选择hTERT启动子中-692～-403bp共290bp为靶序列,采取亚硫酸氢钠修饰和测序法(BSP)检测2种胃癌细胞株中靶序列甲基化状态并作分析。结果端粒酶和hTERT在SGC-7901和BGC-823胃癌细胞株中都有表达;PCR扩增产物测序测出-634～-403bp共232bp,经比对与亚硫酸氢钠转化前源序列对应良好,此序列段26个CpG胞嘧啶中,BGC-823细胞株有25个发生甲基化,SGC-7901细胞株全部发生甲基化,经检索此序列段含2个MZF-2结合域即2个锌指基序,但仅可结合MZF-2一个转录调节因子。结论高甲基化改变了DNA的空间结构可能是hTERT启动子高甲基化上调hTERT表达的原因之一,从而阻断了MZF-2与锌指基序的结合。