回转器模拟失重对人胃癌SGC-7901细胞形态和生物学特征的影响

目的 探讨模拟失重对人胃癌SGC-7901细胞形态、增殖、周期和凋亡的影响.方法采用回转器模拟失重,用图像分析系统软件分析HE染色后SGC-7901细胞形态的改变,用免疫组化法观察细胞增殖细胞核抗原（PCNA）表达的变化,用流式细胞仪测定细胞周期,并用TUNEL法检测细胞凋亡.结果 回转器模拟失重后,回转组SGC-7901细胞12 h、24 h、36 h、48 h及72 h各时间段的细胞面积均较对照组缩小（P＜0.01）;在36 h时,其长短径之比较对照组增大（P＜0.01）,其余时间段无明显差异.12 h、24 h和36 h回转组SGC-7901细胞PCNA抗体阳性细胞比率与对照组相比无明显差异,48 h、72 h回转组的PCNA抗体阳性细胞明显减少（P＜0.05或P＜0.01）.12 h、24 h和36 h回转组SGC-7901细胞的细胞周期与对照组相比无明显差异,48 h、72 h回转后G0＋G1期细胞显著增多（P＜0.01或P＜0.05）,S＋G2＋M期细胞则显著减少（P＜0.01或P＜0.05）.12 h、24 h、36 h和48 h回转组SGC-7901细胞凋亡比例与对照组相比无明显差异,72h回转组细胞凋亡比例较对照组明显增多（P＜0.01）.结论 回转器模拟失重使胃癌SGC-7901细胞的形态发生了变化,48 h、72 h时出现细胞周期阻滞、增殖抑制,72 h时凋亡增加.     

miR-29a抑制胃癌细胞内靶基因VEGF-A的表达及意义

目的 验证胃癌细胞株SGC-7901内miR-29a对靶基因VEGF-A的直接调控作用.方法 采用负载miR-29a的腺病毒载体（Ad-miR29a）感染人胃癌细胞株SGC-7901,上调SGC-7901细胞内miR-29a的表达丰度后,采用RT-qPCR及Western blot法分别检测SGC-7901细胞内VEGF-A在mRNA及蛋白水平的表达;进一步采用双荧光素酶实验及突变实验,验证miR-29a是否通过结合在VEGF-A 3＇UTR而直接抑制靶基因表达.结果 与感染阴性对照Ad-LacZ的SGC-7901细胞相比,感染Ad-miR29a的SGC-7901细胞内VEGF-A蛋白表达下降（0.42±0.02 vs.0.91±0.03,P＜0.01）,且VEGF-A mRNA水平亦下调（0.75±0.21 vs.1.15±0.25,P＜0.05）;荧光素酶实验显示,与阴性对照相比,转染miR-29a mimic后,HEK293细胞萤火虫荧光素酶活性明显下降（0.56±0.13 vs.0.93±0.06,P＜0.05）;而在VEGF-A 3＇UTR与miR-29a的结合位点被突变之后,HEK293细胞萤火虫荧光素酶活性得以恢复.结论 miR-29a通过结合于VEGF-A 3＇UTR相应位点,直接抑制VEGF-A在mRNA及蛋白水平的表达.miR-29a可能成为胃癌基因治疗的有效靶标.     

MS-275对胃腺癌细胞抑制作用及其机制研究

目的采用分子靶向药物治疗胃癌是近年研究热点。探讨组蛋白去乙酰化酶抑制因子MS-275通过多种途径选择性杀伤人胃低分化腺癌细胞株SGC-7901的机制。方法10～100μmol/L 药物浓度梯度的MS-275分别与SGC-7901、人正常胃黏膜上皮细胞株GES-1共培养24 h后,采用WST-1法检测SGC-7901及GES-1细胞存活率,流式细胞仪检测分析SGC-7901细胞线粒体膜电位变化,Western blot、实时荧光定量聚合酶链反应（RTQ-PCR）分别检测处理后胃癌细胞中p21、p27、p57、cyclin B1、cyclin D1基因及相应蛋白表达情况。结果 MS-275可使SGC-7901细胞存活率降低（P＜0.05）,其作用随药物浓度增大更明显,对GES-1细胞无显著影响;MS-275可降低SGC-7901细胞线粒体膜电位（P＜0.05）;MS-275显著提升p21、p27、p57基因及相应蛋白相对含量,同时降低cyclin B1、cyclin D1基因及其蛋白相对含量（P＜0.05）。结论 MS-275可选择性杀伤胃腺癌细胞SGC-7901,这一作用可能是通过线粒体凋亡途径及调控细胞周期相关基因和蛋白表达实现的。     

洛铂抑制胃癌SGC-7901细胞增殖及其机制的初步研究

目的观察洛铂对胃癌细胞SGC-7901细胞增殖的影响,并探讨其作用机制。方法将对数生长期的SGC-7901细胞分阴性对照组（不加药物）和实验组（加入不同浓度洛铂）,采用倒置显微镜观察不同浓度下细胞生长状态;MTT法观察对细胞的增殖抑制;Western印迹方法分析不同浓度洛铂对SGC-7901细胞内Bcl-2蛋白表达水平的影响。结果倒置显微镜下观察,洛铂能抑制细胞增殖,出现明显的凋亡学形态特征。MTT法显示洛铂能抑制细胞增殖,并呈浓度及时间依赖关系。Western印迹结果显示洛铂能使SGC-7901细胞Bcl-2蛋白表达水平下降。结论洛铂能明显抑制胃癌SGC-7901细胞增殖,诱导凋亡,可能与调节SGC-7901细胞Bcl-2蛋白表达水平相关。     

端粒植入对胃癌SGC-7901细胞生物学行为的影响

目的研究外源端粒片段植入对胃癌细胞生物学行为的影响，初步探讨端粒影响细胞生物学活性的作用机制。方法大规模制备含有端粒片段的质粒pSXneo-1．6-T2AG3，采用LipofectAMIN^TM2000介导的转染方式，将质粒转染胃癌细胞SGC-7901，检测细胞周期、细胞形态、细胞生长曲线和细胞周期相关基因表达的改变。结果端粒片段能够成功导入SGC-7901细胞，获得稳定的细胞株。端粒片段植入后细胞生长变慢，异型性减少，S期细胞减少，G0／G1和G2M期细胞比例增加，增殖指数减小，P21mRNA表达明显高于SGC-7901细胞（P〈0．05），caspase-3 mRNA在各组细胞的表达无显著差异（P〉0．05）。结论携带了1600bp端粒TTAGGG重复序列的真核表达载体pSXneo-1．6-T2AG3能够稳定转染至人胃癌SGC-7901细胞中，使细胞增殖减慢，P21 mRNA表达上调，但对caspase-3 mRNA表达无明显影响。     

共转染沉默5-LOX/COX-2基因对胃癌细胞SGC-7901生长的影响

目的 观察沉默环氧合酶2(COX-2)基因和5-脂氧合酶(5-LOX)基因对胃癌细胞SGC-7901生长的影响.方法 分别构建5-LOX/COX-2基因的靶向短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒,共同转染胃癌细胞SGC-7901.将细胞分为空白对照组、空质粒组、单独转染组(P-sh5-LOX或P-shCOX-2)及共同转染组(P-sh5-LOX+P-shCOX-2).分别采用RT-PCR及Western blotting检测COX-2/5-LOX的mRNA及蛋白表达情况,MTT法检测细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡率.结果 与空白对照组及空质粒组比较,5-LOX和COX-2基因单独转染组及共同转染组的mRNA和蛋白表达量均受到显著抑制(P＜0.05).P-sh5-LOX组(27.38％±0.64％)、P-shCOX-2组(29.05％±0.61％)及共同转染组(50.23％±1.73％)细胞增殖抑制率均显著高于空质粒组(3.78％±0.39％,P＜0.05),共同转染组细胞增殖抑制率显著高于单独转染组(p＜0.05).P-sh5-LOX组、P-shCOX-2组及共同转染组的细胞凋亡率(分别为15.31％±1.53％、16.69％±1.28％、27.27％±1.18％)均显著高于空质粒组(0.99％±0.46％,P＜0.05),且共同转染组显著高于单独转染组(P＜0.05).结论 同时沉默胃癌细胞SGC-7901的5-LOX及COX-2基因,可显著抑制胃癌细胞增殖,促进其凋亡,其效果优于单独沉默其中一个基因.     

shRNA抑制GC-C基因表达对人胃癌SGC-7901细胞生物学功能的影响

目的 研究靶向鸟苷酸环化酶C(GC-C)的短发夹RNA(shRNA)对人胃癌SGC-7901细胞增殖、凋亡和细胞周期等生物学功能的影响.方法 构建针对人GC-C基因的shRNA真核表达载体,将其转染人人胃癌SGC-7901细胞,采用半定量RT-PCR和Westem blotting法检测细胞中GC-C在mRNA和蛋白水平的变化.以CCK-8法、流式细胞术和原位末端标记法检测转染GC-CshRNA真核表达载体的SGC-7901细胞增殖、凋亡及细胞周期等生物学指标的变化.结果 经DNA测序鉴定,所得到的表达载体插入片段序列与GenBank中的序列一致.shRNA-GC-C真核表达载体转染能有效抑制GC-C基因的表达,以shRNA-GC-CⅢ序列的抑制效果最佳.转染GC-C shRNA真核表达载体后SGC-7901细胞的增殖能力受到抑制(P<0.05);细胞形态发生改变,细胞体积缩小,核固缩,染色质浓缩聚集于核膜;流式细胞术检测显示G7峰前出现亚二倍体峰,转染48、72h后凋亡率分别为5.47%和5.63%(P<0.05).结论 靶向GC-C基因的shRNA可有效抑制人胃癌SGC-7901细胞生长,并促进细胞凋亡,该作用与下调靶基因GC-C的表达有关;GC-C可能是胃癌治疗的一个潜在靶点.     

白花蛇舌草多糖诱导人胃癌细胞凋亡作用的研究

目的研究白花蛇舌草多糖对体外培养人胃癌7901细胞增殖抑制的影响及其作用机理。方法采用MTT法测定不同浓度白花蛇舌草多糖对人胃癌7901细胞增殖的影响;流式细胞技术检测药物作用后的细胞周期和凋亡率;RT-PCR方法检测药物对人胃癌7901细胞P53和Bcl-2基因表达的影响。结果白花蛇舌草多糖能明显抑制人胃癌7901细胞的增殖,其作用48 h的IC50约为116.52 mg·L-1;流式细胞检测显示40 mg·L-1白花蛇舌草多糖联合5.0 mg·L-1顺铂组总凋亡率为69.42%,明显优于顺铂组的50.85%（P〈0.01）和40 mg·L-1白花蛇舌草多糖组的26.41%（P〈0.01）;PCR结果显示高、中浓度白花蛇舌草多糖可使人胃癌7901细胞的bcl-2 mRNA表达量降低,P53 mRNA表达量增加。结论白花蛇舌草多糖能明显诱导人胃癌7901细胞的凋亡,与顺铂联合可产生协同作用,其作用机制可能与降低细胞bcl-2和增加P53基因表达量有关。     

hTERT启动子特异驱动IL-24重组腺病毒的包装及鉴定

目的 包装并鉴定人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子特异驱动白介素-24（IL-24）的重组复制缺陷型腺病毒.方法 全基因合成优化后的hTERT启动子,插入质粒pGL3-basic的多克隆位点（pGL3-phTERT）;从人外周血单核细胞扩增IL-24,插入pGL3-phTERT质粒的hTERT启动子下游获得pGL3-phTERT-IL24;随后将phTERT-IL24插入pShuttle中间质粒,使用AdEasy^TM Adenoviral Vector System包装Ad-phTERT-IL24重组腺病毒;同时包装CMV启动子驱动IL-24的腺病毒载体为阴性对照（Ad-CMV-IL24）,以空载腺病毒Ad作为空白对照.用20 MOI重组腺病毒感染SGC-7901、MKN-45、HF细胞,采用PCR及Western blot检测IL-24在RNA及蛋白水平的表达.结果 成功包装Ad-hTERT-IL24重组腺病毒.感染Ad-hTERT-IL24后,hTERT阳性肿瘤细胞内IL-24表达显著上调,但hTERT阴性的HF细胞则无IL-24表达;感染阴性对照Ad-CMV-IL24后,hTERT阳性或阴性细胞内均有IL-24表达,感染空白对照Ad后,hTERT阳性或阴性细胞内均无IL-24表达.结论 Ad-hTERT-IL24腺病毒载体可有效介导IL-24特异表达于hTERT阳性肿瘤细胞内.     

姜黄素对人食管癌EC9706细胞增殖及侵袭的影响

目的探讨姜黄素（Curcumin）对人食管癌EC9706细胞增殖、细胞凋亡及侵袭的影响及其分子机制。方法应用0、40、80、120、160μmol/L姜黄素处理EC9706细胞24~72h后,采用四甲基偶氮唑蓝法（MTT）检测细胞增殖抑制率;RT-PCR检测转录因子Ets-1及MMP9（基质金属蛋白酶）mRNA的表达。结果姜黄素作用后,EC9706细胞生长明显减慢,抑制率5.5%~76.2%（P〈0.05）,呈时间-剂量效应关系;Ets-1及MMP9 mRNA表达降低,且两者之间有相关性,有统计学意义（P〈0.01）。结论姜黄素能明显抑制EC9706细胞的增殖及侵袭能力,其机制可能与抑制Ets-1及MMP9表达相关,这可能是姜黄素抑制肿瘤细胞增殖及侵袭的机制之一。     

NOD2和TLR9激动剂诱导胃癌细胞SGC-7901合成IL-8的研究

目的探讨TLR9和NOD2在胃癌细胞SGC-7901中表达及诱导IL-8合成过程中的相互作用及意义。方法用不同浓度的NOD2激动剂（MDP）和TLR9激动剂（未甲基化的CpG ODN）以不同时间间隔单独或联合作用于体外培养的胃癌细胞SGC-7901,用ELISA法测定上清中的IL-8,用RT-PCR和Western Blot测定TLR9和NOD2的表达。数据采用SPSS13.0进行统计分析。结果相对于未刺激组,MDP和未甲基化CpG ODN能使SGC-7901NOD2和TLR9mRNA和蛋白的表达增强;细胞培养上清中IL-8的分泌增强,并呈现时间依赖性和浓度依赖性,差异具有统计学意义（P〈0.05）,8h浓度差异无统计学意义,二者共同作用还能协同诱导SGC-7901合成IL-8,也呈现时间和浓度依赖性,差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论 NOD2和TLR9在胃癌细胞SGC-7901中有所表达,二者在诱导SGC-7901分泌炎性因子的过程中有协同作用。     

树突状细胞诱导抗胃癌效应的实验研究

目的探讨树突状细胞（DC）抗胃癌效应的作用。方法分离正常人外周血单个核细胞（PBMC），加入GM－CSF和IL－4培养，于第5d加入TNF—α继续培养，诱导分离DC。将淋巴细胞与DC混合培养4d后，加入胃癌细胞MKN45、MKN28及SGC7901抗原培养至10d，诱导产生肿瘤特异性的CTL。ELISA检测IL－12和IFN－γ的水平，MTF法检测DC诱导的CTL对MKN45、MKN28、SGC7901和A549体外杀伤效应，流式细胞术检测CTL对肿瘤细胞周期、凋亡的影响。结果培养10d后，IL－12、IFN－γ的分泌量明显提高，DC对同种不同分化类型的胃癌细胞株MKN45、MNK28和SGC7901均有强烈的杀伤效应，杀伤活性显著高于A549（P〈0．01）。与A549比较，MKN45、MKN28和SGC7901的细胞周期显著抑制、凋亡率增加（P〈0．01）。结论DC体外可诱导出高效而特异的抗胃癌效应，显著抑制胃癌细胞分裂增殖，促进其凋亡。     

载体介导的siRNA对SGC-7901胃癌细胞中hPOT1表达的抑制作用

目的构建人端粒保护蛋白（hPOT1）基因的短链干扰核糖核酸（siRNA）表达载体，观察其在胃癌细胞中抑制hPOT1基因表达的作用，为进一步研究hPOT1在胃癌细胞生长增殖中的作用打下基础。方法设计并化学合成64nt编码hPOT1 siRNA基因片段的寡核苷酸，退火成双链后将其连接到pSUPER质粒的H1 RNA启动子下游，构建psiRNA-hPOT1重组质粒。经酶切、测序鉴定后，用脂质体介导的基因转染方法，转人SGC-7901胃癌细胞，用半定量RT-PCR检测hPOT1表达水平的变化。结果测序结果表明重组质粒psiRNA-hPOT1 64个碱基成功插人到预定位置，并且序列完全一致。hPOT1 siRNA表达载体psiRNA-hPOT1转入胃癌细胞后，可明显抑制SGC-7901细胞hPOT1的表达。结论构建的hPOT1基因的siRNA表达载体psiRNA-hPOT1重组质粒能显著抑制hPOT1基因在SGC-7901胃癌细胞中的表达。     

腹腔镜与开腹胃癌手术腹腔冲洗液中IL-1β浓度的变化及其对腹膜间皮细胞与胃癌细胞黏附的影响

目的比较腹腔镜与开腹胃癌手术腹腔冲洗液中白介素1β(IL-1β)浓度的变化,并于体外观察其对腹膜间皮细胞与胃腺癌细胞AGS、SGC-7901黏附的影响,初步探讨腹腔镜胃癌手术对腹膜种植转移的影响。方法将39例胃癌手术患者分为开腹组(n=19)及腹腔镜组(n=20),均行远端胃癌根治术。于术前及术后24、48h分三次采集腹腔冲洗液,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测腹腔冲洗液中IL-1β的浓度。同时以体外原代培养腹膜间皮细胞为实验对象,观察不同浓度IL-1β对腹膜间皮细胞与胃腺癌细胞黏附的影响。结果两组患者术后24、48h腹腔冲洗液中IL-1β水平较术前均升高,且开腹组高于腹腔镜组,差异有统计学意义(P<0.05)。在0～10ng/ml随IL-1β处理浓度的增加,人腹膜间皮细胞与胃癌细胞的黏附率逐渐升高,与未处理组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论IL-1β可特异性地增强腹膜间皮细胞的黏附能力,并促进其与胃癌细胞黏附。与传统开腹手术比较,腹腔镜胃癌手术对腹腔内免疫功能影响小,其微创优势可能在减少创伤性炎症因子介导的肿瘤腹膜转移中发挥作用。     

抑癌基因PTEN、血管内皮生长因子的表达在胃癌进展和预后中的相互关系

目的 评价胃癌组织中微血管密度（MVD）、血管内皮生长因子（VEGF）、抑癌基因PTEN的表达以及它们之间的相互关系,探讨它们与胃癌生物学行为及预后的关系,寻找判断预后和疗效的生物学指标。方法 用免疫组化法将我院1997年1月-2001年12月经病理诊断证实的胃癌手术标本进行微血管密度、VEGF、PTEN检测,并作临床随访和资料统计分析。结果 ①微血管密度、VEGF的表达与胃癌患者的性别、年龄无关;与肿瘤的大小、Borrmann分型、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、肿瘤分期呈正相关（P〈0.05,P〈0.01）;与患者的术后生存时间呈负相关。②胃癌组织中PTEN的阳性表达率为46.7%,与患者的术后生存时间呈正相关。③PTEN的表达与VEGF的表达无显著相关性（P〉0.05）;VEGF和PTEN双因素组合,对胃癌患者预后有不同的影响。结论 MVD、VEGF、PTEN的表达与胃癌的生物学行为及患者的预后有密切关系;VEGF、PTEN的共同作用影响胃癌患者的预后。