携带增强型绿色荧光蛋白的慢病毒在大鼠卵巢中的定位及表达

目的研究携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的慢病毒在活体大鼠卵巢中感染定位及表达情况。方法将携带EGFP的慢病毒注射至实验组大鼠双侧卵巢部位,另设对照组和空白对照组,每天观察大鼠一般情况;分别于注射后第7,14,21和28天处死大鼠（每个时间点每组各2只）,取出双侧卵巢分别称重,行石蜡切片HE染色后光学显微镜下观察卵巢组织结构的变化和卵泡总数量;实验组卵巢行冰冻切片后在荧光显微镜下观察EG—FP的表达。结果3组大鼠一般情况及卵巢重量均无明显变化;行石蜡切片HE染色后,显微镜下见慢病毒注射的卵巢均未见明显的变性、坏死等病理形态学异常;实验组大鼠卵巢行冰冻切片后在荧光显微镜下观察,第7,14,21天EGFP的表达逐渐增强,至第28天开始稳定表达,感染效率可达90％以上。结论慢病毒载体能有效地转染活体大鼠卵巢而无明显毒不良反应。     

慢病毒介导Bcl-2基因保护化疗大鼠卵巢损伤的作用及机制

目的探讨携带Bcl-2基因的慢病毒局部注射保护环磷酰胺(CTX)损伤大鼠卵巢的作用及机制。方法将Wistar大鼠分为7组,每组16只,分别为空白对照组;CTX组(仅腹腔注射CTX);Bcl-2组;增强型绿色荧光蛋白(EGFP)组;盐水+CTX组;空载+CTX组;实验组(注射pGC-FU-Bcl-2+CTX);将纯化的慢病毒悬液经开腹注射入双侧卵巢内,部分动物采用CTX经腹腔注射的方式建立卵巢早衰动物模型。采用HE病理切片计数各级卵泡数量,Tunnel法检测卵巢组织中颗粒细胞凋亡情况,Western blot检测Bcl-2蛋白定量。结果卵巢内直接注射慢病毒后,实验组各级卵泡数比空载+CTX组、盐水+CTX组及CTX组均明显增加,抗凋亡蛋白Bcl-2明显增加,卵巢颗粒细胞凋亡率明显下降。结论携带Bcl-2基因的慢病毒可防护CTX对卵巢组织结构的损伤,其发挥作用的途径之一则是上调Bcl-2蛋白,抑制卵巢颗粒细胞凋亡。     

慢病毒介导的Bcl-2基因对磷酰胺氮芥诱导人原代卵巢颗粒细胞凋亡的保护作用

目的探讨携带Bcl-2基因的慢病毒对磷酰胺氮芥诱导体外培养的原代人卵巢颗粒细胞凋亡的保护作用。方法利用分子生物学技术,成功构建携带Bcl-2基因慢病毒载体,包装成高滴度慢病毒,将重组慢病毒体外感染人卵巢原代颗粒细胞,再加入浓度30μmol/L的磷酰胺氮芥诱导细胞凋亡。分为4组进行实验:(a)实验组:pGC-FU-Bcl-2+磷酰胺氮芥(PM);(b)空载对照组:pGC-FU-EGFP+PM;(c)实验对照组:只加PM;(d)空白对照组:不加PM及病毒。采用流式细胞仪、Hoechst 33258染色检测卵巢颗粒细胞凋亡情况;利用Western blot检测Bcl-2蛋白的表达情况。结果空白对照组(GCs),凋亡峰不明显,颗粒细胞凋亡率为(1.93±0.28)%,实验组(GCs+PM+pGC-FU-Bcl-2)出现微弱的凋亡峰,颗粒细胞凋亡率为(6.99±0.55)%,比实验对照组(GCs+PM)及空载对照组(GCs+PM+pGC-FU-EGFP)显著低,但显著高于空白对照组(P<0.05)。实验组Bcl-2蛋白的表达明显增高,显著高于其余各对照组(P<0.05)。结论携带Bcl-2基因的慢病毒感染靶细胞后可以过度分泌Bcl-2蛋白,显著抑制卵巢颗粒细胞的凋亡,保护PM对颗粒细胞的理化损伤。     

大鼠FasL基因重组慢病毒载体介导大鼠肾脏转染的实验研究

目的:使用FasL重组慢病毒载体通过大鼠肾动脉转染SD大鼠肾脏,观察转染后目的基因表达,为进一步进行移植实验奠定基础。方法:SD大鼠30只随机均分为实验组和对照组,实验组大鼠经肾动脉注入10 ng FasL重组慢病毒载体,对照组注入10 ng空白慢病毒载体,于转染后第3、7、15、25、40天分别采集标本,HE和IHC染色,观察组织形态、测定灰度值,并进行统计学分析。结果:各时段HE染色未见细胞形态改变及炎细胞浸润。IHC染色示转染后表达高峰出现于转染后第15天组。15天组与空白对照组差异有统计学意义(P0.05)。结论:大鼠FasL基因重组慢病毒载体成功转染大鼠肾脏并表达目的基因。     

骨髓间充质干细胞移植对环磷酰胺诱导卵巢损伤大鼠Bax及Bcl-2蛋白表达的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)对环磷酰胺(CTX)所致卵巢损伤的保护作用。方法 30只Sprague Dawley大鼠随机分为空白对照组、模型组及细胞移植组,每组10只,空白对照组大鼠腹腔注射生理盐水,模型组及细胞移植组大鼠腹腔注射CTX制备卵巢早衰模型,细胞移植组于第1天注射CTX后24 h经尾静脉移植BMSCs。停药1周后处死所有大鼠,剖腹取卵巢测质量,观察卵泡数量变化,用免疫组织化学法及Western blot法测定卵巢组织中Bax、Bcl-2蛋白表达。结果模型组、细胞移植组大鼠总卵泡数、中大卵泡数及卵巢湿质量低于空白对照组(P<0.05),但细胞移植组大鼠总卵泡数、中大卵泡数及卵巢湿质量高于模型组(P<0.05)。空白对照组Bax主要表达于黄体细胞,卵泡颗粒细胞仅见散在Bax表达;模型组Bax主要表达于颗粒细胞的细胞质,尤其在闭锁卵泡、生长卵泡及窦状卵泡中表达明显;细胞移植组卵泡颗粒细胞中Bax表达范围明显小于模型组。空白对照组Bcl-2在各级卵泡颗粒细胞及黄体细胞中表达量均多,模型组Bcl-2在卵泡颗粒细胞仅散在表达,细胞移植组Bcl-2表达范围明显大于模型组。与空白对照组比较,模型组、细胞移植组大鼠卵巢组织中Bax蛋白表达量明显升高(P<0.05),Bcl-2蛋白表达量明显下降(P<0.05);但与模型组比较,细胞移植组大鼠卵巢组织中Bax表达量明显下降(P<0.05),Bcl-2表达量明显升高(P<0.05)。结论 BMSCs移植能通过调整卵巢组织中Bax、Bcl-2表达水平减少CTX对卵巢功能的损伤。     

miR-204-5p对卵巢早衰大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的调控机制

【摘要】目的 探讨微小RNA（miR）-204-5p对卵巢早衰（POF）大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响及调控机制。方法 体外分离大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,将含有miR-204-5p基因反义寡核苷酸序列的重组慢病毒载体转入BMSCs,获得稳定转染LV-rno-ASO-miR-204-5p的BMSCs细胞。选取动情周期正常的75只SPF级雌性Wistar大鼠,随机分为对照组、POF组、BMSCs组、shRNA组、shRNA-BMSCs组,每组各15只。除对照组外,均采用腹腔注射顺铂法制备POF模型。shRNA组、BMSCs组及shRNA-BMSCs组分别双侧卵巢注射慢病毒载体、BMSCs细胞及稳定转染慢病毒载体的BMSCs细胞,对照组和POF组注射生理盐水。观察各组动情周期恢复情况,比较各组干预前、干预28 d后血清促卵泡生成素（FSH）、雌二醇（E2）水平,观察卵巢组织形态、卵泡颗粒细胞凋亡率,检测卵巢组织miR-204-5p mRNA及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、B细胞淋巴瘤-2基因（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）mRNA和蛋白表达。结果 干预后,POF组大鼠动情周期未恢复;BMSCs组、shRNA组及shRNA-BMSCs组动情周期均有所恢复,其中shRNA-BMSCs组动情周期恢复率均高于BMSCs组及shRNA组（P＜0.05）。病理染色显示,BMSCs组、shRNA组及shRNA-BMSCs组始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡及窦卵泡数量均多于POF组,但仍少于对照组（P＜0.05）;shRNA-BMSCs组上述各级卵泡数量多于BMSCs组和shRNA组（P＜0.05）。BMSCs组、shRNA组及shRNA-BMSCs组血清FSH水平、卵巢颗粒细胞凋亡率、卵巢组织中miR-204-5p mRNA及MAPK、Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白相对表达量均低于POF组,且shRNA-BMSCs组低于BMSCs组和shRNA组,但仍高于对照组（P＜0.05）;BMSCs组、shRNA组及shRNA-BMSCs组血清E2水平及卵巢组织Bcl-2 mRNA和蛋白相对表达量均高于POF组,且shRNA-BMSCs组高于BMSCs组和shRNA组,但仍低于对照组（P＜0.05）。shRNA组与BMSCs组比较,卵巢组织miR-204-5p mRNA相对表达量较低（P＜0.05）,各级卵泡数量、血清FSH、E2水平、卵巢颗粒细胞凋亡率及卵巢组织MAPK、Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白相对表达量差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论 下调miR-204-5p表达可增强BMSCs对POF大鼠卵巢结构和功能的改善作用,抑制卵巢颗粒细胞凋亡,可能与下调MAPK、Bcl-2、Bax、Caspase-3基因和蛋白表达有关。     

ALR基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建及其在肝癌细胞中对ALR表达的抑制

目的：构建肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration,ALR）基因RNA干扰（RNA interference,RNAi）慢病毒载体,并检测其对人肝癌细胞株HepG2和QGY中ALR基因表达的干扰效率。方法：针对ALR基因RNAi的有效靶序列,合成靶序列的OligoDNA,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ双酶切线性化的GV118慢病毒载体连接产生LV-ALR-shRNA重组慢病毒载体,经转化感受态细胞后筛选出阳性克隆,并进行测序鉴定。用293T细胞包装产生慢病毒,逐孔稀释法测定病毒滴度。再将包装浓缩后的慢病毒转染人肝癌细胞株HepG2和QGY,应用Real-time PCR和Western blot方法检测HepG2和QGY细胞中ALR基因mRNA和蛋白的表达情况。结果：酶切鉴定证实成功构建了针对人ALR基因的RNAi慢病毒载体,包装并浓缩慢病毒,病毒滴度为 8E+8TU/ml。将病毒感染人肝癌细胞株HepG2和QGY后,2种细胞的干扰组ALR的mRNA表达水平较阴性对照组及空白对照组均明显下降（HepG2细胞,P干扰组vs. 阴性病毒对照组=0.004,P干扰组vs. 空白对照组=0.001;QGY细胞,P干扰组vs. 阴性病毒对照组=0.005,P干扰组vs. 空白对照组=0.001）,同样,干扰组ALR在蛋白水平的表达也明显减降低。结论：成功构建ALR基因RNAi慢病毒载体,该载体能有效干扰人肝癌细胞株HepG2和QGY中ALR基因的表达。     

慢病毒介导沉默SOCS3基因对糖尿病大鼠相关胰岛素通路蛋白表达的影响

目的构建糖尿病大鼠模型,探讨慢病毒介导沉默细胞因子信号转导抑制因子3(suppressors of cytokine signaling 3,SOCS3)基因对大鼠相关胰岛素通路蛋白表达的影响。方法选取SD大鼠40只,构建2型糖尿病大鼠模型成功后,随机分为空白对照组、空白载体组和观察组,各10只。空白对照组不进行其他处理,空白载体组通过大鼠尾部静脉注射空慢病毒载体,观察组通过大鼠尾部静脉注射SOCS3 RNAi慢病毒载体。注射载体4周后,测定3组大鼠血糖、血脂、胰岛素水平;采用实时荧光定量聚合酶链式反应法检测SOCS3、IRS1、IRS2、STAT5b、JAK2和STAT3 mRNA表达,Western blotting法检测SOCS3、IRS1、pIRS1、IRS2、pIRS2、STAT5b、pSTAT5b、JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3蛋白表达。结果注射载体4周后,观察组大鼠空腹血糖、胰岛素、三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平均明显低于空白对照组和空白载体组(P＜0.01),高密度脂蛋白胆固醇水平均明显高于空白对照组和空白载体组(P＜0.01);观察组SOCS3 mRNA和STAT5b mRNA表达均低于空白对照组和空白载体组(P＜0.01),IRS1 mRNA、IRS2 mRNA和JAK2 mRNA表达均高于空白对照组和空白载体组(P＜0.05～P＜0.01),3组STAT3 mRNA差异无统计学意义(P>0.05);观察组SOCS3、STAT5b、pSTAT5b表达均明显低于空白对照组和空白载体组(P＜0.01),IRS1、pIRS1、IRS2、pIRS2、JAK2、pJAK2、pSTAT3蛋白表达均明显高于空白对照组和空白载体组(P＜0.01),3组STAT3蛋白表达差异无统计学意义(P＞0.05)。结论沉默SOCS3基因可降低糖尿病大鼠血糖水平,SOCS3基因可能通过相关信号通路介导胰岛素抵抗。     

辛伐他汀通过上调动脉粥样硬化大鼠血管壁Bcl-2蛋白的表达而抑制细胞凋亡

目的 探讨辛伐他汀对动脉粥样硬化(AS)大鼠模型血管壁细胞凋亡、Bcl-2蛋白的表达干预作用.方法 高脂饲料及腹腔注射维生素D3复制大鼠AS模型,随机分为对照组(n=10)给予普通饲料喂养,实验组(n=13)给予高脂饲料喂养,干预组(n=13)给予高脂饲料喂养基础上加用辛伐他汀干预,11周后取胸主动脉,观察其斑块变化.采用免疫组化Elivision法测定AS血管壁中Bcl-2蛋白表达.通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡指数(AI),分析各组中Bcl-2表达及AI变化.结果 与对照组比较,Bcl-2蛋白的表达在实验组明显降低(P<0.05);而与实验组比较,干预组Bcl-2蛋白的表达明显升高(P<0.05),且与对照组比较无差异.同时,AI在各组中的变化比较则相反,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 辛伐他汀抗大鼠AS的作用可能与上调Bcl-2蛋白表达,进而抑制细胞凋亡相关.     

miRNA-34a对无血清培养诱导心肌细胞凋亡的影响及机制研究

目的：探讨miRNA-34a（miR-34a）对无血清培养诱导的大鼠心肌细胞凋亡及B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）表达水平的影响。方法体外培养大鼠心肌细胞H9C2,实验分实验组（转染miR-34a inhibitor）、空白对照组（无转染miR inhibitor）和阴性对照组（转染随机合成NC microRNA片段）。转染24h后无血清培养饥饿诱导细胞凋亡,Western bolt法检测Caspase-3及Bcl-2的表达。结果实验组细胞Caspase-3表达低于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05）。Bcl-2表达明显高于空白对照组和阴性对照组（P＜0.05）。结论转染miR-34a inhibitor可以下调miR-34a的表达,减少无血清培养诱导H9C2细胞的凋亡,Bcl-2的表达增加可能参与了其保护机制。     

Bcl-2shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的:应用分子克隆技术,针对人bcl-2目的基因设计3个siRNA靶点和一个阴性对照序列,构建4对shRNA重组慢病毒表达载体,并进行测序验证鉴定。方法:以设计的有效靶序列进行引物合成,将单链引物退火成双链oligo序列,连接入经Age I和EcoR I双酶切线性化的慢病毒RNA干扰载体中,经转化DH5α感受态细胞并筛选出阳性转化子,采用PCR扩增和DNA测序分别鉴定阳性克隆。结果:PCR扩增产物经凝胶电泳后阳性克隆得到335bp条带,阴性克隆得到298 bp条带,DNA测序结果证实其含有设计合成序列。结论:成功构建4对bcl-2shRNA重组慢病毒表达载体,为研究靶向bcl-2 siRNA对肿瘤细胞增殖抑制与诱导凋亡作用及基因治疗研究奠定了实验基础。     

纤维粘连蛋白EDA片段调控结肠癌SW480细胞的增殖、凋亡

目的研究纤维粘连蛋白EDA片段对结肠癌SW480细胞增殖、凋亡的影响。方法慢病毒感染结肠癌SW480细胞干扰纤维粘连蛋白EDA片段表达,建立纤维粘连蛋白EDA片段低表达的SW480细胞。利用MTT检测干扰前后细胞增殖的变化,并采用流式细胞术检测干扰前后细胞凋亡的变化。同时使用Western blot分别检测干扰前后凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达变化。结果慢病毒感染结肠癌SW480细胞后,纤维粘连蛋白EDA片段持续低表达。MTT法结果显示,干扰纤维粘连蛋白EDA片段24、48、72、96 h后细胞生长速度明显降低。转染组与未转染组及空载体组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术显示未转染组、空载体组及转染组的细胞凋亡率分别为(3.09±1.13)%、(3.71±0.42)%、(47.76±1.51)%,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot的结果显示干扰纤维粘连蛋白EDA片段后促凋亡因子Bax表达上调,同时,凋亡抑制因子Bcl-2表达降低。结论纤维粘连蛋白EDA片段对结肠癌SW480细胞具有促增殖、抗凋亡作用。     

SOX9基因慢病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

目的 构建SOX9基因的慢病毒载体并使其在兔骨髓间充质干细胞(MSCs)中表达.方法 通过RT-PCR获得人SOX9基因编码区(CDS)片段,将该片段克隆入质粒Pwpxl-MOD2中产生Pwpxl-MOD2/SOX9,将Pwpxl-MOD2/SOX9、pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G共转染293T细胞,获得携带目的基因SOX9基因的重组病毒.同时共转染Pwpxl-MOD2,pRsv-REV,pMDlg-pRRE,pMD2G进另一组293T细胞包装产生空载体慢病毒作为阴性对照.包装好的慢病毒体外感染MSCs,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法及免疫印迹检测SOX9的表达;四甲基噻唑蓝(MTT)法测定慢病毒对细胞增殖能力的影响.结果 酶切、PCR及测序鉴定证实慢病毒载体质粒Pwpxl-MOD中插入片段为基因SOX9.病毒感染MSCs后,经RT-PCR法和免疫印迹证实SOX9基因在MSCs中表达.MTT法检测示慢病毒感染对骨髓间克质干细胞的生长未产生显著影响.结论 成功构建SOX9基因的慢病毒载体并感染骨髓间充质干细胞后能够稳定表达SOX9.为研究椎间盘退变的基因及生物学治疗提供了实验依据.     

VEGF干扰慢病毒载体的构建及其在MHCC97L细胞中的表达

目的构建VEGF基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中表达。方法根据人VEGF基因序列,设计并合成包含靶序列的互补DNA链,连接线性化的plenti6.3-MIR载体,构建miRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5α,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒,测定其滴度。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用Real-time PCR检测RNAi组（MHCC97-200）、阴性对照组（MHCC97-NEGA）和空白对照组（MHCC97-空白）中VEGF的表达情况,确定其干扰VEGF表达的有效性。结果测序证实慢VEGF基因RNAi病毒载体质粒构建成功。慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒的滴度为3.23×109TU/mL。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L 48 h后,VEGF基因在mRNA水平抑制了72.2%。结论 VEGF基因RNAi慢病毒载体构建成功,并实现在人肝癌细胞MHCC97L中的表达。     

携带DREAM基因shRNA的慢病毒载体的构建及其对坐骨神经缩窄损伤大鼠的镇痛作用

目的：构建含下游调控元件的拮抗分子（downstream regulatory element antagonistic modulator,DREAM）基因有效短发夹RNA(shRNA)的慢病毒载体, 利用RNA干扰技术抑制DREAM基因表达,开展对神经病理性疼痛基因治疗的实验研究。方法：将靶向大鼠DREAM基因的shRNA重组到慢病毒穿梭质粒中,将重组质粒pKCSHR-puro/GFP-DREAM和慢病毒包装系统共转染293T细胞包装成慢病毒,收集病毒上清并进行载体病毒滴度的测定。将纯种健康清洁级成年雄性SD大鼠36只随机分为6组: 正常对照组(N)、假手术组(S),根据干预手段的不同将大鼠坐骨神经缩窄损伤（chronic constriction injury of sciatic nerve, CCI）模型组分为4组:CCI(C0)组, CCI疼痛模型建立后不给任何干预措施,生理盐水对照（C1）组,空白载体对照（C2）组,LV-shRNADREAM慢病毒载体治疗（C3）组。该3组大鼠于CCI后第7天分别于蛛网膜下腔注射生理盐水、空白载体、LV-shRNADREAM慢病毒载体。观察各组大鼠术后3,7,10,14,21 d的疼痛行为学的改变。实验结束取腰段脊髓荧光显微镜检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达,Realtime-PCR测定DREAM基因的mRNA 含量、Western印迹测定DREAM 蛋白含量。结果：测序分析证实载体构建成功,成功进行慢病毒包装,得到病毒液滴度为1.0×108 IFU/mL慢病毒载体。鞘内注射LV-shRNADREAM慢病毒载体后, CCI大鼠热痛阈和机械痛阈的异常明显得到改善（P<0.01）, 腰段脊髓神经细胞DREAM基因mRNA和 DREAM蛋白的表达均显著降低（P<0.01）。结论：成功构建了携带大鼠DREAM基因有效shRNA的慢病毒载体,慢病毒携带的短发夹干扰ＲＮＡ能干扰脊髓中DREAM的表达,为神经病理性疼痛的治疗提供了实验基础。     

携带人bcl-2基因的慢病毒表达载体的构建及其在人原代卵巢颗粒细胞中的表达

目的 构建及鉴定bcl-2基因慢病毒表达载体,并观察在体外人卵巢原代颗粒细胞中的表达.方法 采用PCR技术从含有人bcl-2基因的质粒克隆模板pCMV-SPORT6钓取bcl-2基因,并将基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU(含EGFP基因)中,构建慢病毒载体表达质粒pGC-FU-bcl-2,通过酶切、测序验证bcl-2基因后,将pGC-FU-bcl-2质粒和包装质粒pHelper1.0、pHelp-er2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞.获得携带bcl-2基因和EGFP基因的重组慢病毒GC-FU-bcl-2,并转染靶细胞人卵巢原代颗粒细胞.通过检测标志蛋白增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和目的 蛋白bcl-2进一步验证pGC-FU-bcl-2在靶细胞中的表达.结果 (1)pGC-FU-bcl-2中携有正确的bcl-2基因,并能在人类细胞中表达;pGC-FU-bcl-2共转染包装细胞293T能产生重组病毒GC-FU-bcl-2;(2)目的 基因bcl-2能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞人卵巢原代颗粒细胞,并达到稳定的表达,荧光显微镜下能直接观察到GFP,Western blotting能检测到bcl-2蛋白在靶细胞中的表达.结论 成功构建了携带bcl-2基因的重组慢病毒载体,转染人卵巢原代颗粒细胞后能够稳定表达bcl-2基因,为进一步研究bcl-2的功能和细胞凋亡相关疾病的治疗奠定基础.     

谷胱甘肽过氧化物酶2干涉慢病毒系统构建及对人肝癌细胞凋亡的影响

目的构建人谷胱甘肽过氧化物酶2（Glutathione peroxidase 2, GPX2）慢病毒干涉载体,获得稳定下调GPX2的高滴度慢
病毒,检测敲低GPX2对细胞凋亡的影响。方法通过筛选具有显著干涉效果的siRNA序列,构建pSicoR-GPX2慢病毒干涉载
体,包装病毒并感染人肝癌HepG2 细胞,分别用Western-blot 和RT-PCR方法检测GPX2 表达情况,应用流式细胞术分析敲低
GPX2对人肝癌细胞凋亡的影响。结果成功构建pSicoR-GPX2干涉慢病毒载体并获得高滴度慢病毒颗粒,GPX2蛋白表达水
平和RNA表达水平均有显著下调,且人肝癌细胞感染GPX2干涉慢病毒后对凋亡更加敏感,其原因可能是促凋亡蛋白Bax的活
化和抗凋亡蛋白Bcl-2活性的抑制。结论成功构建人GPX2基因干涉慢病毒,为肝癌靶标治疗提供新的线索,为后续GPX2功
能研究奠定基础。