Fas基因转导大肠癌细胞株的表达

目的建立表达外源性Fas基因的大肠癌细胞株,观察Fas基因在转导前后的表达。方法采用分子克隆技术将Fas基因插入真核表达载体pBK-CMV的多克隆位点之间,以脂质体介导法将Fas基因导入受体细胞LoVo,用G418筛选克隆细胞。以dot blotting,Western blotting检测转导细胞Fas基因的表达。结果成功建立了Fas基因表达株。转导株在RNA及其蛋白水平表达均明显高于非转导株,转导细胞增殖速度、倍增时间、对数生长期等均比非转导株更为缓慢,但无显著性差异,在Fas抗体作用下,转导株细胞生长明显受到抑制,有非常显著性差异。结论Fas基因在大肠癌细胞中处于低表达状态;通过真核表达载体介导,Fas基因在RNA及其蛋白水平能有效表达。Fas表达株在Fas抗体作用下可明显抑制体外培养的大肠癌细胞的生长增殖。     

腺病毒介导的LacZ基因在乳腺癌细胞中的表达

观察腺病毒介导的基因转移在乳腺癌细胞的转导效率及腺病毒转导对细胞生长的影响。方法：腺病毒介导的基因转导。结果：在病毒的重复感染率为５００时细胞的转导效率达到１００％；不同数量的病毒转导乳腺癌细胞对癌细胞的生长没有明显影响。低温冻存可使病毒的感染性明显下降。结论：腺病毒介导的基因转移在乳腺癌细胞中有高的转导效率，而病毒载体本身对细胞的生长没有影响，可用作乳癌特异物前体酶激活基因治疗的基因转移方法。     

外源性Rb基因转染对头颈肿瘤的抑制作用

目的 探讨外源性Rb基因对头颈肿瘤的抑制作用。方法 运用携带Rb基因的复制缺陷型腺病毒转染口腔鳞癌细胞株012，观察其体内和体外的抑癌效果。结果 腺病毒表达载体可有效地将外源性Rb基因转染012细胞并使其表达。体内、体外抑瘤实验表明：导入Ad-Rb基因的肿瘤细胞，其细胞生长曲线明显受抑制，Ad-Rb基因治疗组裸鼠肿瘤生长最为缓慢，与DL312和PBS对照组比较有显著性差异（P＜0．05）。结论 腺病毒介导的外源性Rb基因可有效地转染入口腔鳞癌细胞株，并抑制其生长。     

Fas转导大肠癌细胞诱导其凋亡的实验研究

目的：观察Fas转导大肠癌细胞株诱导大肠癌细胞凋亡效应，可望为进一步研究大肠癌的Fas基因治疗提供实验依据。方法：以流式细胞术(FCM)及琼脂糖凝胶电泳法捡测Fas转导大肠癌细胞调亡效应。实验分四组：a.LoVo细胞组b．LoVo细胞 Fas抗体组c.LOVo转导细胞组dLoVo转导细胞 Fas抗体组。结果：Fas转导大肠癌细胞株 Fas抗体组(d)细胞凋亡率明显高于a,b,c组。结论：Fas表达细胞株在Fas抗体作用下能够有效启动Fas介导的细胞凋亡途径。     

腺病毒介导的LacZ基因在乳腺癌细胞中的表达

目的：观察腺病毒介导的基因转移在乳腺癌细胞的转导效率及腺病毒转导对细胞生长的影响。方法：腺病毒介导的基因转导。结果：在病毒的重复感染率（MOI）为500时细胞的转导效率达到100％；不同数量的病毒转导乳腺癌细胞对癌细胞的生长没有明显影响。低温冻存可使病毒的感染性明显下降。结论：腺病毒介导的基因转移在乳腺癌细胞中有高的转导效率，而病毒载体本身对细胞的生长没有影响，可用作乳癌特异药物前体酶激活基因治疗的基因转移方法。     

真核表达质粒pBK-Fas的构建及转染舌鳞癌Tca8113细胞的体外抑瘤效应

目的 研究Fas基因转染对舌鳞癌Tca8113细胞的体外抑制作用,构建Fas基因真核表达质粒pBK-Fas并将其转导入舌鳞癌Tca8113细胞,为舌鳞癌的Fas基因治疗提供实验基础.方法 采用RT-PCR反转录成cDNA扩增Fas基因全长,亚克隆到真核表达载体pBK-CMV内,构建出重组真核表达质粒pBK-Fas,酶切鉴定并测序.脂质体法将pBK-Fas转染入Tca8113细胞,RT-PCR检测Fas mRNA表达及半定量分析,琼脂糖凝胶电泳检测Fas转染细胞凋亡,流式细胞仪检测Fas蛋白表达.通过细胞生长曲线描记和软琼脂集落形成实验研究Fas基因的体外抑瘤效应.结果 PCR扩增后的产物在约1 008 bp处出现明显的特异性条带,重组质粒pBK-Fas经酶切和测序鉴定,表明均含有大小正确的Fas基因片段.经检测Fas基因转染能提高Fas mRNA 表达水平、Fas 蛋白表达强度,以及细胞凋亡指数.Fas基因转染能提高Fas蛋白的表达强度,由转染前的34.01±4.76上升到转染后的55.72±7.33,差异有统计学意义(P<0.01).Fas转染细胞株在Fas抗体作用下能够有效启动Fas介导的细胞凋亡途径.MTT法检测细胞增殖抑制率的结果显示PBK-Fas转染组 Tca8113细胞的增殖抑制作用最明显,表明Fas基因转染能增加舌鳞癌Tca8113细胞的增殖抑制率,结果与细胞生长曲线测定(计数法)结果具有一致性.软琼脂集落形成实验结果显示,与未转染细胞相比,重组质粒转染的Tca8113细胞群体倍增时间延长,克隆形成能力降低.结论 Fas基因片段被成功插入真核表达载体pBK-Fas质粒的多克隆位点.Fas基因转染能有效的抑制体外培养的舌鳞癌Tca8113细胞的生长.     

人bax真核表达载体的构建及其在人胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR中的表达

目的：构建人ｂａｘ真核表达载体,经脂质体导入人胃癌耐药细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ,并检测ｂａｘ基因在转导株的表达．方法：采用分子克隆技术将ｂａｘ基因插入真核表达载体ｐＢＫ－ＣＭＶ的多克隆位点之间,以脂质体介导法将目的基因导入受体细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ,Ｇ４１８筛选克隆细胞,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ｂａｘ基因的表达．结果：成功地构建了重组质粒ｐＢＫ－ｂａｘ,将之转入细胞后,经Ｇ４１８筛选３０ｄ获得了稳定的细胞克隆,即ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ－ｂａｘｃｅｌｓ．Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹证实了ｂａｘ基因转导株具有明显的Ｂａｘ蛋白表达．结论：ｂａｘ真核表达载体的构建,为胃癌耐药的临床治疗打下了基础．     

基因转移FasL诱导人黑色素瘤细胞凋亡的体外实验

目的 探讨体外基因转移Fas配体（Fas-ligand,FasL)对人恶性黑色素瘤细胞凋亡的影响。方法 用携带人FasL,cDNA的缺陷型重组腺病毒载体（Ad-FL)，在体外转导两株黑色素瘤细胞，并使其表达；通过流式细胞仪，RT－PCR法进行Fas/FasL表达检测，TUNEL法及荧显微镜相关凋亡检测，分析，结果 流式细胞仪和RT－PCR检测两株黑色素瘤细胞表面均表达Fas，不表达FasL，而Ad-FL转导的两株黑色素瘤细胞均能表达FasL，Ad-FL能显著诱导两株黑色素瘤细胞在体外凋亡或抑制其生长。结论 重组腺病毒FasL在体外诱导人黑色素瘤凋亡效果显著。     

维生素E琥珀酸酯对人大肠癌细胞的生长抑制和凋亡诱导作用

目的:检测维生素E琥珀酸酯(VES)对人大肠癌细胞的生长抑制和凋亡诱导作用并分析此种作用的可能机制.方法:VES分别以5、10和20 mg/L浓度作用于人大肠癌细胞株LS174T,12、24以及48 h后应用MTT法检测VES对大肠癌细胞的生长抑制作用.应用流式细胞仪分析不同浓度VES处理48 h后大肠癌细胞的细胞周期并计算凋亡率;以Western蛋白印迹法和流式细胞术检测VES处理后肿瘤细胞Fas蛋白水平和细胞表面Fas表达的变化.结果:VES能够显著抑制人大肠癌细胞的增殖并表现为剂量和时间依赖关系.以5、10和20 mg/L VES作用48 h后,肿瘤细胞的凋亡率由0.9%分别升高至15.9%、46.7%和64.5%.Fas中和性抗体能够明显阻断VES介导的凋亡.VES处理后,细胞Fas蛋白水平升高.流式细胞仪检测细胞表面Fas平均荧光强度由5.43升高至9.88、13.21和18.0.结论:VES能够诱导人大肠癌细胞的生长抑制和凋亡.调控凋亡诱导分子Fas的表达是主要机制之一.其作用主要与肿瘤细胞表面Fas分子表达的上调有关.     

野生型p53基因对胰腺癌细胞的抑制作用

目的：观察人类野生型p53（wtp53）基因对人胰腺癌细胞的抑制作用。方法：用逆转录病毒为载体将外源性wtp53基因导入人胰腺癌细胞系PC－2，通过体外及小鼠体内实验研究转入基因的表达及对肿瘤的抑制作用，结果：p53在转染细胞PC－2／p53中表达水平提高，外源性wtp53基因的导入和表达能使PC－2细胞的生长速率减低，软琼脂集落形成能力下降，G0＋G1期细胞比例增加，凋亡指数升高，裸鼠体内成瘤能力明显下降，结论：逆转录病毒载体介导的外源性野生型P53能抑制人胰腺癌细胞生长。     

c-FLIP mRNA在大肠癌细胞中的表达及其与Fas抗原表达的相关性

目的:探讨cFLIP(细胞型Fas相关死亡区域蛋白样白介素-1β转换酶抑制蛋白) mRNA在大肠癌细胞中的表达及其与Fas抗原(CD95)表达的相关性.方法:应用RT-PCR方法检测3株人大肠癌细胞株中c-FLIP mRNA的表达,采用间接免疫荧光标记流式细胞术检测大肠癌细胞Fas抗原表达.结果:SW1116及SW620细胞株 c-FLIP mRNA 表达阳性并相对高水平表达Fas抗原,而LoVo细胞株c-FLIP mRNA表达阴性并低水平表达Fas抗原.结论:在大肠癌细胞中,c-FLIP mRNA的表达趋势与Fas抗原一致,提示c-FLIP可能在抑制Fas抗原诱导的细胞凋亡中发挥重要作用.     

内皮素3基因对结直肠癌LoVo细胞迁移和侵袭能力的影响

目的 探讨内皮素3(endothelin 3,EDN3)基因对结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响及其相关机制.方法 实时荧光定量PCR检测EDN3 mRNA在人结直肠癌组织及对应癌旁组织中的表达情况,半定量PCR检测EDN3及内皮素受体B(endothelin receptor B,EDNRB) mRNA在结直肠癌细胞(CaC02、LoVo、HT-29)中的表达情况.将包装过载体pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro-EDN3的病毒感染至结直肠癌细胞LoVo,MTS、克隆形成法、划痕法、Transwell检测EDN3对细胞增殖、克隆、迁移和侵袭能力的改变.Western blot检测LoVo中p-ERK1/2和t-ERK 1/2蛋白改变.结果 EDN3在人结直肠癌组织和细胞中表达降低.表达EDN3基因的重组载体成功感染至LoVo细胞.MTS和克隆实验结果显示,实验组和对照组细胞增殖和克隆形成差异无统计学意义(P＞0.05),划痕实验和Transwell实验提示实验组细胞迁移和侵袭能力明显低于对照组(P＜0.01).Western blot检测结果显示磷酸化的ERK1/2蛋白表达下降(P＜0.01).结论 EDN3在结直肠癌组织和细胞中表达降低,过表达EDN3能抑制结直肠癌LoVo细胞的迁移和侵袭能力,其机制可能与ERK1/2信号通路有关.     

稳定表达PLCγ1 siRNA慢病毒的构建及对人大肠癌细胞凋亡的影响

目的 制备在人大肠癌系LoVo中稳定抑制磷脂酶C(PLC)γ1的重组慢病毒,建立PLCγ1表达降低的细胞系,以便客观研究该基因的作用.方法 制备产生PLCγ1 siRNA分子的重组慢病毒,在慢病毒感染LoVo细胞后以杀稻瘟菌素筛选稳定表达细胞系.应用Westem-blot和RT-PCR对细胞中PLCγ1的蛋白和mRNA表达水平进行分析.应用流式细胞仪分析PLCγ1 siRNA对细胞凋亡的影响.结果和结论 PLCγ1 siRNA显著下调了LoVo细胞中PLCγ1的表达,所构建的重组慢病毒导入的siRNA有较高的沉默效率,显著增加了5-FU诱导的凋亡.     

恢复野生型PTEN基因表达对炎性乳腺癌MDA-MB-468体外生物学行为的影响

目的研究野生型PTEN基因转染对人炎性乳腺癌MDA—MB-468细胞体外生物学行为的影响及机制。方法应用基因重组技术构建重组质粒pcDNA3．1-PTEN，用脂质体转染乳腺癌细胞株MDA—MB-468，用RT—PCR、免疫组化及免疫印迹方法分析目的基因及其蛋白表达，并用免疫印迹方法检测转染后，在表皮生长因子的诱导下，磷酸化蛋白激酶B（PKB／Akt）的表达，四甲基唑蓝（MTT）法分析细胞增殖。Annexin V—FITC和PI双染流式细胞术检测细胞凋亡。结果RT—PCR、免疫组化及免疫印迹显示pcDNA3．1-PTEN转染组有PTEN mRNA及其蛋白表达，且显示转染组在表皮生长因子的诱导下，p-Akt蛋白表达下调。MTT检测表明pcDNA3．1-PTEN转染组活细胞数较其它各组均低（P〈0．01），流式细胞分析其凋亡率达21．68％。结论野生型PTEN基因依赖其磷酸酶活性可诱导乳腺癌MDA—MB-468细胞凋亡。     

靶向蛋白酪氨酸磷酸酶1B小分子干扰RNA对结肠癌LoVo细胞增殖和成瘤能力的影响

目的:探讨沉默蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)基因的RNA干扰对人结肠癌LoVo细胞增殖和成瘤能力的影响。方法:应用小分子干扰RNA(siRNA)技术沉默PTP1B的表达(shRNA-PTP1B),采用逆转录聚合酶链反应和Western Blot分别在mRNA和蛋白水平检测抑制效果。CCK-8被用于检测沉默PTP1B表达对肿瘤细胞增殖的影响。在体外实验的基础上建立裸鼠模型,建立稳定表达干扰RNA细胞系,观察干扰RNA稳定表达对人结肠癌裸鼠移植成瘤的影响。结果:shRNA-PTP1B有效沉默LoVo细胞PTP1B mRNA及蛋白的表达,成功筛选shRNA-PTP1B稳定表达细胞株LoVo/shRNA细胞。在体外试验中与对照组比较LoVo/shRNA细胞的增殖能力明显下降。LoVo/shRNA细胞裸鼠移植成瘤体积,明显减小(P均<0.05)。结论:shRNA-PTP1B可以沉默人结肠癌PTP1B基因的表达,显著抑制LoVo细胞的增殖,降低LoVo细胞的成瘤能力。     

抑癌基因KAI1对大肠癌细胞生物学特性的影响

目的研究抑癌基因KAI1对大肠癌细胞生物学特性的影响。方法用KAI1 cDNA质粒转染低表达KAI1基因的人大肠癌LoVo细胞。免疫组化和原位杂交检测转染后mRNA和蛋白的表达,利用体外肿瘤同质性粘附、异质性粘附实验和肿瘤侵袭模型等方法,检测KAI1/CD82对大肠癌粘附与侵袭的影响;以空白质粒转染组为对照组。结果体外实验发现转染KAI1质粒的LoVo细胞同质性粘附能力高于对照组,异质性粘附及侵袭能力明显低于对照组。抑癌基因KAI1对肿瘤的增殖能力没有影响。结论KAI1基因表达的减少可以导致大肠癌细胞同质性粘附降低,对基底膜粘附及侵袭转移的能力增加。因此,KAI1基因可以作为大肠癌的一种转移抑制基因。