加味当归贝母苦参丸对H22肝癌荷瘤小鼠抑瘤及T细胞免疫调节作用

目的 探讨加味当归贝母苦参丸对H22肝癌荷瘤小鼠抑瘤及T细胞免疫调节作用,为加味当归贝母苦参丸联合免疫检查点抗体治疗肝癌提供依据。方法 建立H22肝癌荷瘤小鼠模型,随机分为模型组、顺铂组、加味当归贝母苦参丸低、中、高剂量组（4、8、16 g·kg^-1·d^-1）,连续给药14 d,第15天处死小鼠。给药第0、4、8、12、15天测量肿瘤体积;称取瘤重、计算胸腺指数和脾指数;将脾脏淋巴细胞与H22肝癌细胞共培养,细胞增殖与活性检测（CCK-8）法检测肿瘤细胞增殖抑制率;实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测脾脏和肿瘤组织中程序性细胞死亡蛋白-1（PD-1）、淋巴细胞活化基因-3（LAG-3） mRNA的表达情况;免疫组织化学法（IHC）检测脾脏和肿瘤组织中CD4⁺、CD8⁺ T细胞数量及PD-1、LAG-3蛋白的表达情况。结果 给药后第8天,各给药组肿瘤体积较模型组均有不同程度下降,第15天肿瘤体积和瘤重均较模型组显著降低（P<0.01）,其中顺铂组下降最为明显。与模型组、顺铂组比较,加味当归贝母苦参丸中、高剂量组胸腺指数显著升高（P<0.01）;与模型组比较,各用药组脾脏指数均明显升高（P<0.05,P<0.01）,其中顺铂组升高最为显著;与模型组、顺铂组比较,加味当归贝母苦参丸各组脾脏、肿瘤组织中CD4⁺、CD8⁺ T细胞数量和肿瘤细胞杀伤率均显著增高（P<0.01）,LAG-3 mRNA和蛋白表达均明显降低（P<0.05,P<0.01）;加味当归贝母苦参丸高剂量组肿瘤组织中PD-1 mRNA表达较模型组、顺铂组显著降低（P<0.01）。结论 加味当归贝母苦参丸可能通过下调LAG-3表达,促进H22肝癌荷瘤小鼠CD4⁺、CD8⁺ T细胞的增殖并向肿瘤微环境浸润,从而改善T细胞免疫活性、抑制肿瘤生长,为加味当归贝母苦参丸与免疫检查点抗体联用治疗肝癌提供实验依据。     

肝豆汤对Wilson病模型TX小鼠脾脏免疫功能调节的作用

目的：探讨肝豆汤对Wilson病模型TX小鼠脾脏免疫功能的调节作用,并探讨相关的作用机制。方法：将小鼠分为正常组、模型组、四硫钼酸铵组、肝豆汤低、中、高剂量组,每组20只。正常组选取DL小鼠常规饲养30 d;模型组和肝豆汤低、中、高剂量组选取TX小鼠分别予生理盐水、肝豆汤（22,44,66 g·kg^-1）各2 mL·kg^-1·d^-1灌胃,四硫钼酸铵组予四硫钼酸铵2 mg·kg^-1·d^-1灌胃,每日2次,连续30 d。上述4组采用电感耦合等离子体-质谱法（ICP-MS）测脾组织微量元素,流式细胞术检测小鼠脾组织T淋巴细胞亚群CD4⁺,CD8⁺,CD4⁺/CD8⁺;蛋白免疫印迹法（Western blot）检测白细胞介素-2（interleukin-2,IL-2）,白细胞介素-8（interleukin-8,IL-8）,白细胞介素-17（interleukin-17,IL-17）,白细胞介素-18（interleukin-18,IL-18）,γ-干扰素（interferon-γ,IFN-γ）,肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）的蛋白表达量。结果：ICP-MS结果显示：与模型组比较,肝豆汤可以降低TX小鼠脾组织铜含量（P<0.01）,流式细胞术检测显示,与正常组比较,模型组脾组织内CD4⁺,CD8⁺增高（P<0.01）,CD4⁺/CD8⁺降低（P<0.01）,与模型组比较,肝豆汤中、高剂量组脾组织内CD4⁺,CD8⁺降低（P<0.05）,CD4⁺/CD8⁺增高,但差异无统计学意义,肝豆汤低剂量组与模型组比较CD4⁺,CD8⁺降低,CD4⁺/CD8⁺增高,但差异均无统计学意义;Western blot检测显示,与正常组比较,模型组脾组织内IL-2,IL-8,IL-17,IL-18,TNF-α,IFN-γ的蛋白表达量增高（P<0.01）,与模型组比较,肝豆汤中、高剂量组及四硫钼酸铵组IL-2,IL-8,IL-17,IL-18,TNF-α,IFN-γ蛋白表达量均降低（P<0.05,P<0.01）;与模型组比较,低剂量肝豆汤组IL-2,IL-8,IL-17,TNF-α相对表达量降低（P<0.05）。结论：TX小鼠脾脏存在免疫功能紊乱,且以负向免疫调节为主。肝豆汤对TX小鼠脾脏免疫功能紊乱具有一定的改善作用。     

云芝黄芪有效组分对荷瘤小鼠免疫功能的影响

目的:应用云芝黄芪有效组分单方及复方治疗肿瘤小鼠,以此来验证云芝黄芪有效组分单方及复方抗肿瘤的免疫调节活性。方法:建立艾氏腹水癌(EAC)实体型荷瘤小鼠动物模型,随机分为6组,每组10只:生理盐水组(NS,0.1 mL.kg^-1.d^-1)、阿霉素单纯化疗组(AMD,4 mg.kg^-1.d^-1,0.2 mL,连续3 d)、云芝糖肽组(PSP,250 mg.kg^-1.d^-1,0.2 mL)、黄芪多糖组(APS,250 mg.kg^-1.d^-1,0.2 mL)、云芝黄芪复方组(PSP+APS,250 mg.kg^-1.d^-1,0.1 mL)和阿霉素云芝黄芪综合治疗组(AMD+PSP+APS,用量同上)。分别治疗30 d后采用免疫细胞化学法检测荷瘤小鼠外周血T淋巴细胞亚群的变化情况,计算脏器指数、抑瘤率,并与对照组及化疗组进行比较。结果:云芝糖肽组和云芝黄芪复方组小鼠的CD3⁺,CD4⁺T细胞百分率以及CD4⁺/CD8⁺均显著高于对照组(P<0.05),CD8⁺T细胞的百分率较阿霉素化疗组显著降低(P<0.05);综合治疗组CD3⁺,CD4⁺T细胞百分率显著高于单纯化疗组(P<0.05);单纯化疗组小鼠胸腺指数较对照组明显降低(P<0.05),而综合治疗组的胸腺指数显著高于单纯化疗组(P<0.01);并且各给药组肿瘤质量均显著低于NS对照组(P<0.05)。结论:云芝糖肽、云芝黄芪复方对荷瘤小鼠及经化疗后的荷瘤小鼠均具有免疫增强作用。     

加味龟鹿二仙胶汤联合顺铂对Lewis肺癌小鼠耐药相关基因及IL-7介导的Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的 通过建立气阴两虚型Lewis肺癌小鼠模型,观察加味龟鹿二仙胶汤联合顺铂对Lewis肺癌小鼠免疫功能、耐药相关基因及白细胞介素-7（IL-7）介导的Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路的影响,阐明加味龟鹿二仙胶汤的抗癌机制,为其临床应用提供依据。方法 建立气阴两虚型Lewis肺癌小鼠模型,分为正常组（不造模）,模型组（等体积生理盐水）,顺铂组（顺铂,2 mg·kg^-1）,中药组（加味龟鹿二仙胶汤,19.63 g·kg^-1·d^-1）,联合组（加味龟鹿二仙胶汤,19.63 g·kg^-1·d^-1+顺铂,2 mg·kg^-1）,每组10只,分别给药,干预21 d。观察小鼠一般情况、脏器指数,计算抑瘤率,流式细胞仪检测CD4⁺CD25⁺调节性T细胞（CD4⁺ CD25⁺Treg）,酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血清中细胞因子水平IL-7,实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）检测肿瘤组织中耐药相关基因P-糖蛋白（P-gp）,多药耐药相关蛋白1（MRP1）mRNA的表达水平,蛋白免疫印迹法（Western blot）检测肿瘤组织中Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达。结果 与模型组比较,中药组及联合组摄食量增加,精神状态较好,反应灵敏,体质量增加。与顺铂组比较,联合组胸腺指数、脾脏指数显著升高（P<0.01）,联合组抑瘤率明显升高（P<0.01）。与顺铂组比较,中药组、联合组CD4⁺ CD25⁺Treg /CD4⁺明显降低（P<0.05,P<0.01）,中药组、联合组IL-7水平显著升高（P<0.01）。与顺铂组比较,中药组、联合组P-gp,MRP1 mRNA表达明显降低（P<0.05,P<0.01）,中药组、联合组Wnt1,β-catenin蛋白表达显著降低（P<0.01）。结论 加味龟鹿二仙胶汤与顺铂联用可明显抑制Lewis肺癌小鼠体内肿瘤的生长,其作用机制可能与其能够解除机体免疫抑制状态,促进机体产生IL-7,调节IL-7介导的Wnt/β-catenin信号通路,减少肺癌组织中耐药相关基因的表达有关。     

解毒通络生津方对干燥综合征NOD小鼠PD-1/PD-L1信号通路的影响＊

目的 观察解毒通络生津方对干燥综合征（SS）模型NOD小鼠PD-1/PD-L1通路的影响，探讨其作用机制。方法 将24只8周龄雌性NOD小鼠随机分为3组，即模型组（Model）、解毒通络生津方组（TCM）、解毒通络生津方加抗PD-L1单抗阻断组（TCM＋α-PD-L1），每组8只。另选8只8周龄雌性ICR小鼠作为正常对照组（Ctrl）。12周龄时开始中药干预，TCM组按照每天24.4 g·kg^-1解毒通络生津方灌胃，TCM＋α-PD-L1组在每天给予24.4 g·kg^-1解毒通络生津方灌胃的基础上，腹腔注射抗PD-L1抗体，1周2次，每次100 μg，Ctrl组和Model组给予同等剂量的生理盐水灌胃，实验期间记录各组小鼠第9、12、16、20周龄时的日均饮水量，干预8周后，小鼠统一麻醉下摘取颌下腺。HE染色观察各组小鼠颌下腺中炎症细胞浸润情况；流式细胞仪检测小鼠颌下腺CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺PD-1⁺Treg细胞的表达；Western Blot检测小鼠颌下腺中PD-1、PD-L1和Foxp3蛋白的表达。结果 随着小鼠周龄的增长，Ctrl组小鼠日均饮水量基本不变，Model组小鼠的日均饮水量有明显上升趋势，TCM组小鼠日均饮水量下降，TCM＋α-PD-L1组小鼠日均饮水量上升；与Model组比较，TCM组炎症细胞浸润灶明显减少（P<0.001）；与TCM组比较，TCM＋α-PD-L1组炎症细胞浸润增多（P<0.001）；与Ctrl组比较，Model组CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺PD-1⁺Treg的表达降低（P<0.001），与Model组比较，TCM组CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺PD-1⁺Treg表达升高（P<0.01）；与TCM组比较，TCM＋α-PD-L1组CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺PD-1⁺Treg的表达降低（P<0.01）；与Ctrl组比较，Model组小鼠颌下腺中PD-1、PD-L1和Foxp3蛋白的表达降低（P<0.01）；与Model组比较，TCM组小鼠颌下腺中PD-1、PD-L1和Foxp3蛋白的表达升高（P<0.01）；与TCM组比较，TCM＋α-PD-L1组小鼠颌下腺中PD-1、PD-L1和Foxp3蛋白的表达降低（P<0.001）。结论 解毒通络生津方可能通过PD-1/PD-L1信号通路促进SS模型小鼠Treg细胞活化，上调Foxp3的表达，增强Treg细胞抑制免疫炎症的作用，PD-1/PD-L1可能是解毒通络生津方治疗SS的一个作用靶点。     

慢性阻塞性肺疾病肺脾气虚证大鼠模型的建立及评价

目的 建立并评价慢性阻塞性肺疾病（COPD）肺脾气虚病证结合模型。方法 采用“香烟烟熏法+脂多糖（LPS）气管滴注联合番泻叶浸液灌胃”构建COPD肺脾气虚证大鼠模型。将40只SPF级SD雄性大鼠随机分成空白组、模型组、番泻叶低、中、高剂量病证结合模型组，共5组。除空白组外各组均每日烟熏，并于第1天、第14天气管内滴注LPS。番泻叶低、中、高剂量病证结合模型组在造模第28天予4 ℃不同剂量番泻叶浸液（5、10、20 g·kg^-1）灌胃3周，造模共49 d。采集宏观指标：一般情况（体质量、摄食量、粪便含水量、肛温）及行为学指标（抓力测试、鼠尾悬挂实验）。测定肺功能，肺组织病理，血清D-木糖、淀粉酶、胃泌素含量，肺泡灌洗液白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）水平，外周血T淋巴细胞亚群（CD4⁺、CD8⁺、CD4⁺/CD8⁺）水平，计算胸腺指数、脾指数。结果 一般情况方面，番泻叶高剂量组大鼠死亡2只。与空白组比较，番泻叶中、高剂量组体质量、摄食量均显著降低（P<0.01），粪便含水量显著升高（P<0.01），番泻叶高剂量组肛温较空白组显著降低（P<0.01）。行为学指标方面，与空白组比较，各造模组大鼠抓力均显著降低（P<0.01）；番泻叶中、高剂量组静止不动时间明显增加（P<0.05，P<0.01）。肺功能方面，与空白组比较，各造模组大鼠第0.3秒用力呼气容积（FEV_0.3）、FEV_0.3/用力肺活量（FVC）均显著降低（P<0.01）。肺组织苏木素-伊红（HE）染色可见各造模组大鼠支气管壁增厚，杯状细胞增生，部分肺泡融合呈肺气肿改变。胃肠功能指标方面，与空白组比较，番泻叶中、高剂量组D-木糖、胃泌素、α-淀粉酶水平均显著降低（P<0.01）。免疫炎症指标方面，与空白组比较，番泻叶中、高剂量组脾、胸腺指数均显著减小（P<0.01），各造模组大鼠外周血CD4⁺水平均显著降低（P<0.01），CD4⁺/CD8⁺明显下降（P<0.05，P<0.01），肺泡灌洗液IL-1β、IL-6显著升高（P<0.01）。结论 利用香烟烟熏加LPS气管滴注同时联合番泻叶灌胃能够成功建立COPD肺脾气虚病证结合模型。结合宏观及微观评价，推荐番泻叶浸液剂量10 g·kg^-1（番泻叶中剂量组）作为COPD肺脾气虚病证结合模型造模灌胃浓度。     

黄花倒水莲对辐射损伤小鼠防护作用的研究

目的: 初步探讨黄花倒水莲提取物对小鼠辐射损伤的防护作用。方法: 以辐射损伤小鼠作为研究对象,分别以黄花倒水莲提取物2,4,8 g·kg^-1·d^-1灌胃,阴性对照组、辐射模型组给予等量生理盐水。灌胃5 d后,除阴性对照组外各组小鼠接受6 Gy的⁶⁰Co γ射线一次性全身均匀照射,然后再继续灌胃10 d,最后1次灌胃24 h后,检测各组小鼠外周血中红细胞数(RBC)、白细胞数(WBC)、血小板数(PLT)、淋巴细胞数(Lymph),计算脾指数和胸腺指数,用单细胞凝胶电泳技术检测小鼠脾细胞、骨髓细胞的DNA损伤。结果: 与阴性对照组比,辐射模型组、黄花倒水莲各剂量组小鼠的RBC数、WBC数、PLT数、Lymph数、胸腺指数、脾指数明显减少(P<0.01或P<0.05),脾细胞、骨髓细胞的尾部DNA百分率(Tail DNA%)和尾矩(Tail Moment)明显增大(P<0.01或P<0.05);但与辐射模型组比, 黄花倒水莲各剂量组小鼠的RBC数、WBC数、PLT数、Lymph数、胸腺指数、脾指数明显增加(P<0.01或P<0.05),脾细胞、骨髓细胞的Tail DNA%和Tail Moment明显减少(P<0.01),存在剂量-反应关系。结论: 黄花倒水莲提取物对辐射所致小鼠造血系统和免疫器官损伤有一定的防护作用。     

藿香正气胶囊对菌群失调小鼠黏膜免疫的影响

目的：研究藿香正气双向胶囊对福氏痢疾杆菌和鼠伤寒沙门氏菌所致菌群失调腹泻小鼠(BSD小鼠)黏膜免疫的影响。方法：清洁级健康Balb/c雄性小鼠50只,将小鼠随机分成正常组、正常给药组、模型组、藿香正气高剂量组(藿高组)、藿香正气低剂量组(藿低组)5组,每组10只。正常组及模型组给予等体积生理盐水灌胃,正常给药组给予藿香正气药液5.21 g·kg^-1,藿高组5.21 g·kg^-1,藿低组0.52 g·kg^-1,各组于造模后当天给药,每日1次,连续3 d。流式法检测外周血和肠道peyer patches(PP结)淋巴细胞亚群；放免法检测外周血清和肠组织匀浆肿瘤坏死因子(TNF-α)。结果：BSD小鼠腹泻明显,外周血和PP结CD4⁺,CD8⁺T淋巴细胞紊乱,外周血和肠组织TNF-α升高。藿香正气双向胶囊可减少BSD小鼠腹泻次数,缩短病程,调节CD4⁺,CD8⁺T淋巴细胞平衡,降低TNF-α。结论：BSD小鼠表现出T淋巴细胞亚群紊乱,炎症反应增强,免疫功能异常,而藿香正气双向胶囊可改善腹泻症状及其伴随的免疫异常,这可能是藿香正气双向胶囊预防和治疗菌群失调腹泻的机制之一。     

三氧化二砷对MRL/lpr狼疮鼠淋巴细胞亚群和细胞因子表达的影响

 目的探讨三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)对MRL/lpr狼疮鼠淋巴细胞亚群和细胞因子表达的影响。方法MRL/lpr狼疮鼠随机分为ATO组(0.4mg·kg^-1·d^-1,ip)、环磷酰胺(CTX)组(50mg·kg^-1每周1次,ip)和生理盐水(NS)组(按体重取量,ip),给药2个月。取脾脏制成脾细胞悬液,加入佛波醇酯(PMA)和ionomycin活化,同时加monensin抑制蛋白转运,于37℃,5%CO₂培养4h后,用四色流式细胞术测脾脏CD3⁺(T)细胞和CD3⁺CD4⁺(Th)细胞的百分率以及CD3⁺CD4⁺(Th)细胞内细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-12的水平;分离血清,用ELISA法测血清中抗ds-DNA抗体、IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-12的浓度。结果①给药后,ATO组小鼠血清的抗ds-DNA抗体水平较给药前明显下降(P<0.01),而NS对照组则明显升高(P<0.05)。②ATO组CD3⁺细胞和CD3⁺CD4⁺百分率均显著低于NS组(P<0.01);③ATO组的血清IFN-γ和IL-12浓度均低于NS组(前者P<0.01,后者P=0.018);④ATO组Th细胞内IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-12表达均显著低于NS组(P<0.01)。结论三氧化二砷能显著降低MRL/lpr狼疮鼠血清抗ds-DNA抗体的水平,抑制T细胞和Th细胞增生和活化功能,降低IFN-γ和IL-12的血清水平和Th细胞内IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-12的水平。     

补中益气汤通过Adipor1/AMPK/PGC-1α调节脂代谢治疗运动性疲劳

目的 探讨补中益气汤通过脂联素受体1（Adipor1）/磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）/过氧化物酶体增生物激活受体γ共激活因子-1α（PGC-1α）对运动性疲劳（EIF）小鼠骨骼肌中脂代谢的影响。方法 将C57BL/6J小鼠随机分为空白组、模型组、补中益气汤低、中、高剂量组、维生素C组。空白组不施加任何干预,其余组通过力竭游泳建立EIF模型。力竭游泳前1 h,空白组、模型组灌服0.2 mL蒸馏水,补中益气汤低、中、高剂量组分别灌胃4.1、8.2、16.4 g·kg^-1的补中益气汤,维生素C组灌胃0.04 g·kg^-1剂量维生素C,持续6周。实验6周后,计算小鼠体质量增长率、脏器指数、力竭游泳时间;酶比色法检测小鼠血清中尿素氮（BUN）、肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、乳酸（LD）的水平;苏木素-伊红（HE）染色观察骨骼肌组织病理变化;透射电镜（TEM）观察骨骼肌组织超微结构;微板法检测血清中游离脂肪酸（NEFA）、甘油三酯（TG）的含量;蛋白免疫印迹法（Western blot）测定骨骼肌中Adipor1、磷酸化（p）-AMPK/AMPK、PGC-1α和己糖激酶2（HK2）蛋白的表达。结果 与空白组比较,模型组小鼠的体质量增长率、胸腺指数降低,血清中BUN、CK、LD、LDH水平升高（P<0.01）,NEFA、TG含量下降（P<0.01）,骨骼肌组织Adipor1、p-AMPK/AMPK、PGC-1α、HK2蛋白表达下降（P<0.05,P<0.01）。与模型组比较,补中益气汤高剂量组体质量增长率、胸腺指数、力竭游泳时间显著升高（P<0.01）,BUN、CK、LD、LDH显著下降（P<0.01）,NEFA、TG显著升高（P<0.01）,骨骼肌组织Adipor1、p-AMPK/AMPK、PGC-1α、HK2蛋白表达明显升高（P<0.05,P<0.01）;维生素C组胸腺指数、力竭游泳时间明显提高,BUN、CK、LD明显下降（P<0.05,P<0.01）,NEFA、TG显著升高（P<0.01）,骨骼肌组织Adipor1蛋白表达显著升高（P<0.01）。结论 补中益气汤能够延缓EIF的发生,其机制可能与调节Adipor1/AMPK/PGC-1α信号通路,提高骨骼肌对脂肪的利用率有关。