结核多肽特异性细胞内因子多色流式分析

目的建立能同时检测CD3、CD4、CD8表型及胞内因子IFN-γ、IL-4、TNF-α的多色胞内细胞因子染色流式细胞术;评价六条结核特异性多肽的性能。方法将结核患者组及健康对照组的PBMC,用结核特异性多肽或PMA刺激培养后,通过胞内细胞因子流式检测术,收集荧光标记阳性的淋巴细胞等;从而确定各亚群IFN-γ、IL-4、TNF-α阳性细胞的数量及百分率,得出两组间及各多肽间的性能差异。结果 1.各多肽均能刺激活化结核患者PB-MC产生IFN-γ等细胞因子,但百分率较低;IFN-γ及IL-4多数小于1%,而TNF-α则在大约10%左右。与对照组比较,IFN-γ及TNF-α的均值分别高1-12倍或1-3倍,IL-4＋/CD4＋T淋巴细胞活化率的倍数较小,而IL-4＋/CD8＋的倍数则较大;2.不同多肽刺激产生细胞内因子的比较：除多肽H256与H210活性能刺激CD4＋亚群分泌更多IFN-γ外,其余各多肽刺激产生因子的性能无统计学差异;3.对于IFN-γ及IL-4因子,各多肽均无CD4＋或CD8＋亚群差异,但各多肽均可刺激CD8＋细胞亚群产生更多TNF-α;4.双阳性（IFN-γ及TNF-α阳性）多功能T细胞分析,经多克隆刺激剂（PMA）活化后,IFN-γ＋/CD4＋及IFN-γ＋/CD8＋T细胞分别有83.0%及79.9%（均值）为双阳性细胞,而经多肽刺激后则为68.1%及65.7%（均值）。结论多色流式胞内因子染色能很好地检测特异性多功能细胞;所用的6条多肽均能活化结核特异性淋巴细胞产生细胞因子,但细胞因子的活化率较低。     

输血前后CD3/28双抗体活化外周血单个核细胞后细胞因子的变化

目的 研究单独CD3抗体或联合CD28抗体作用于输血前后患者外周血单个核细胞（PBMC）后细胞因子的变化。方法 体外T细胞培养与活化,采用酶联免疫法测定细胞因子IL-2、γ干扰索（IFN-γ）和IL-4的分泌水平。结果 输血前患者PBMC单独应用CD3抗体与联用CD28抗体后。PBMC细胞因子分泌水平的变化元显著性,但输血后差异有显著性。结论 CD28抗体可明显增强输血后体外活化T细胞功能,输血导致的免疫抑制作用可能与抗原提呈细胞的功能受到影响有关。     

原发性胆汁性肝硬化患者外周血NKT细胞体外活化及相关细胞因子表达分析

目的 分析与评价PBC患者外周血TCRVα24+Vβ11+NKT数量和功能状态及其与PBC发生的关系.方法 制备60例PBC患者(PBC组)和60名年龄及性别匹配健康人(健康对照组)PBMC,以FACS检测TCRVα24+Vβ11+NKT数量;以α半乳糖酰基鞘胺醇(α-galcer)和IL-2诱导PBMC中NKT的扩增活化,用ICS-FC检测细胞内表达IL-4和IFN-γ的NKT比值;用ELISpot和ELISA定量检测细胞内及上清液IL4和IFN-γ的表达量.结果 FACS检测PBC组和健康对照组TCRVα24+Vβ11+NKT扩增前后的比率分别为[0.16(0.11～0.26)]%、[0.82(0.61～0.89)]%、[0.33(0.27～0.38)]%、[27.40(23.52～33.87)]%,前组显著低于后组(Z值分别为6.563、7.707,P＜均0.01).扩增活化后PBC组和健康对照组TCRVα24+Vβ11+NKT的扩增倍数分别为扩增活化前的[96.05(80.50～100.27)]倍和[134.65(121.60～142.13)]倍,PBC组明显低于健康对照组(Z=6.462,P＜0.01).同时于活化后用ICS-FC检测细胞内细胞因子,PBC组和健康对照组IFN-γ+与TCRVα24+Vβ11+NKT比分别为[38.98(36.73～42.98)]%、[34.56(30.12～36.78)]%,前组显著高于后组(Z=3.158,P＜0.05);PBC组和健康对照组IL-4+与TCRVα24+Vβ11+NKT细胞比分别为[0.193(0.179～0.218)]%和[34.36(30.93～38.77)]%,前组显著低于后组(Z=6.476,P＜0.01).ELISpot和ELISA定量检测扩增活化后PBC组分泌IFN-γ的斑点形成细胞数(SFC)和上清液IFN-γ分泌量分别为[410(380～500)]SFC/1×106 PBMC、(67.21±11.27)ng/L,健康对照组[340(280～390)]SFC/1×106PBMC、(31.45±8.17)ng/L,前组的IFN-γ斑点形成细胞数及分泌量显著高于后组(Z=4.312,P＜0.05、t=27.25,P＜0.01);PBC组的IL-4斑点形成细胞数和分泌量分别为[73(60～100)]SFC/1×106PBMC、(12.65±4.17)μg/L,健康对照组[245(230～280)]SFC/1×106PBMC、(28.31±6.31)μg/L,PBC组IL-4却显著低于健康对照组(Z=5.112,P＜0.01、t=25.34,P＜0.01).结论 PBC组外周血TCRVα24+Vβ11+NKT数量较健康对照组明显减少,经α-galcer及IL-2体外活化后扩增倍数及分泌细胞因子IL-4的功能较健康对照组显著降低,而分泌IFN-γ能力却显著高于健康对照组,NKT数量的减少及免疫调节功能的紊乱可能是PBC发病的重要因素之一.     

湿疹患者外周血白介素4、干扰素γ和调节性T细胞的检测及临床意义

目的 通过对湿疹患者血清白介素4(IL-4)、干扰素γ(IFN-γ)水平及外周血单个核细胞(PBMC)中转录调节因子3(FOXP3)阳性的天然调节性T细胞(Tn,CD4+CD25+Foxp3+)、NKT细胞(CD3-/ CD16+CD56+)数量的检测并与对照组进行对比分析,探讨IL-4、IFN-γ水平变化以及Tn、NKT细胞数量与湿疹发病的关系,分析其在湿疹发病过程中的作用及患者发病的可能机制.方法 采用ELISA法和流式细胞术(flow cytometry,FCM)对湿疹患者、对照组血清IL-4、IFN-γ等细胞因子水平及PBMC中Tn、NKT细胞数量分别进行检测.结果 湿疹患者血清IL-4、IFN-r水平较对照组显著升高;PBMC中Tn细胞数量降低、NKT细胞数量升高,与对照组比较,均有显著性差异(P＜0.01).结论 湿疹患者Th1/Th2细胞因子分泌异常在疾病的发生发展中起重要作用,Tn数量降低减弱了对Th2细胞的抑制作用,成为湿疹发病的重要原因,患者体内同时存在较强烈的NKT细胞激活和免疫应答.     

流式微珠阵列法检测IFN-γ诱导的Jurkat细胞Th1/Th2细胞因子表达

本研究旨在探讨流式微珠阵列法检测Th1／Th2细胞因子表达及IFN-1应用于T淋巴细胞白血病治疗的临床价值。以不同浓度IFN-γ诱导培养Jurkat细胞48小时，用流式微珠阵列法检测培养上清液中IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ表达，并采用流式细胞术检测膜上IL-2受体（CD25）的表达。结果表明：IFN-γ诱导Jurkat细胞IL-2和TNF-α的表达呈浓度依赖性升高，未检测到IL-6表达，CD25表达明显升高。结论：Jurkat细胞能被IFN-γ诱导高表达Th1细胞因子和CD25，流式微珠阵列法能准确客观地反映Th1／Th2细胞因子表达的动态变化。     

特应性皮炎患者外周血Th17细胞比例及不同细胞因子微环境对其分化的影响

目的探讨Th17细胞在特应性皮炎(AD)发病机制中的作用。方法采用流式细胞术检测39例AD患者外周血单一核细胞(PBMC)中Th17细胞的比例,实时定量RT-PCR(real-timeRT-PCR)检测PB-MC中Th17细胞相关细胞因子IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23和TGF-βmRNA的表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中上述细胞因子的含量;同时以34例性别、年龄匹配的健康儿童做对照。分离AD患者PBMC体外培养,加入不同细胞因子微环境,观察其对Th17细胞数量及特异性转录因子RORγt表达的影响。结果 AD患者外周血Th17细胞比例(CD4+IL17+T细胞/CD4+T细胞%)显著高于正常对照者(P<0.01)。PBMC中IL-1β、IL-6、IL-17和IL-23mRNA表达水平及血清中相应细胞因子含量均显著高于正常对照者(P<0.01),PBMC中TGF-βmRNA表达水平及其血清中含量与正常对照者比较,差异无统计学意义(P>0.05)。AD患者PBMC在不同细胞因子微环境中培养,IL-1β+IL-23+IL-6处理组Th17细胞比例及RORγtmRNA表达最高,TGF-β处理组表达最低,与其余处理组比较差异均具有统计学意义(P均<0.05)。IL-1β+IL-6、IL-1β+IL-23、IL-6+IL-23处理组Th17细胞比例及RORγtmRNA表达水平低于IL-1β+IL-23+IL-6处理组,高于TGF-β处理组和未处理组,差异均具有统计学意义(P均<0.05)。IL-1β+IL-6、IL-1β+IL-23、IL-6+IL-23处理组间差异无统计学意义(P均>0.05)。结论 AD患者外周血Th17细胞比例及相应促分化细胞因子表达水平升高,IL-1β+IL-23+IL-6对Th17细胞具有明显的促分化作用,Th17细胞在AD发病机制中发挥作用。     

细胞因子诱导的杀伤细胞体外培养技术的评价

目的:评价采用抗CD3单抗I、L-2、IFN-γ和IL-1α四因子培养体系体外培养细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)的效果。方法:采集8例难治性淋巴瘤患者外周血单个核细胞培养,于培养第1天加入抗人CD3单抗、人重组IL-1α、人重组IFN-γ,第2天加入人重组IL-2,每3天换培养液并添加人重组IL-2和人重组IFN-γ以维持其浓度,培养12~14 d收获CIK细胞。于培养第1、4、7、10、13天进行细胞计数,于培养前及培养第13天测定细胞免疫表型。结果:细胞因子共刺激3 d即出现细胞集落,13 d后CIK细胞总数达(7~18)×109(平均12.7×109),较培养前扩增44~140倍(平均98倍),细胞存活率超过90%;具有免疫表型CD3+、CD4+、CD8+和CD3+CD56+细胞的平均值分别从培养前的(50.9±3.5)%、(29.9±1.7)%、(41.3±3.2)%(、1.6±0.2)%增加到培养第13天的(90.2±1.6)%、(40.6±5.5)%(、52.8±4.9)%、(33.1±4.0)%。结论:培养当日加抗人CD3单抗I、L-1α、IFN-γ,24 h后加IL-2,培养过程中维持IL-2和IFN-γ浓度,这种四因子培养体系制备的CIK细胞的体外扩增率高、杀瘤活性强,并综合了外周血易获得、操作简便和自体来源等优点,可以临床推广应用。     

微小RNA-4804对人单核细胞株THP-1细胞增殖与分泌细胞因子的影响研究

目的探讨miRNA-4804对人单核细胞增殖和分泌细胞因子功能的影响。方法实时定量PCR检测人单核细胞株THP-1中miRNA-4804和细胞因子m RNA的表达,流式细胞仪与CCK8检测miRNA-4804对THP-1细胞增殖的影响,酶联免疫吸附测定THP-1细胞培养上清中细胞因子的表达。结果与对照组比较,加入miRNA-4804模拟剂,IFN-γ诱导的THP-1细胞增殖、HLA-DR、CD86分子的表达明显受到抑制,CD80表达无明显变化;而加入miRNA-4804抑制剂,THP-1细胞的增殖,HLA-DR、CD86分子的表达明显增加,CD80表达也明显增加。IFN-γ刺激后,THP-1细胞和培养上清中IL-6、TNF-α和IL-12的表达明显增强,IL-10的表达明显下降;miRNA-4804模拟剂处理后,能拮抗IFN-γ诱导THP-1细胞表达IL-6、TNF-α和IL-12的作用,且促进THP-1细胞表达IL-10。反之,miRNA-4804抑制剂处理后,能促进IFN-γ诱导THP-1细胞表达IL-6、TNF-α和IL-12的作用,而抑制THP-1细胞表达IL-10,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论 miRNA-4804能够影响单核细胞的增殖和分泌细胞因子的功能,可能在慢性乙型肝炎免疫稳态机制中发挥作用。     

脐血CIK细胞的体外增殖及对K562细胞的杀伤活性的实验研究

目的：探讨脐血CIK细胞体外增殖活性及时K562细胞的杀伤活性。方法：通过第1天在脐血淋巴细胞中加入IFN-γ，第2天再加入IL-2和CD3单抗进行细胞培养，就可获得名为多种细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induede killer cells)即脐血CIK细胞。用MTT法测定其抗肿瘤活性，台盼蓝拒染法计数细胞。结果：脐血CIK细胞及其培养上清抗K562细胞活性明显优于CD3AK细胞，短期培养后其增殖活性低于CD3AK细胞；但是G-CSF的加入可以提高CIK细胞的增殖活性。结论：脐血CIK细胞是一种有效的杀伤活化细胞，脐血在多种细胞因子适当组合的诱导下即可提高杀瘤活性，又能保留重建造血功能的作用。     

先兆子痫和正常孕妇外周血辅助性T细胞及其细胞因子的变化

目的 探讨先兆子痫、正常妊娠女性Th细胞亚群功能变化和外周血Th1、Th2细胞百分率与外周血单个核细胞（PBMC）培养上清液中IFN-γ、IL-4浓度的相关性。方法 应用流式细胞仪检测外周血Th1、Th2细胞百分率，ELISA法测定PBMC体外培养上清液中细胞因子IFN-γ和IL-4浓度。结果 与正常对照组相比，先兆子痫患者Th1细胞百分率、Th1/ Th2比值明显升高，差异非常显著；正常妊娠组Th1细胞百分率、Th1/ Th2比值明显下降，差异非常显著。与正常妊娠组相比，先兆子痫患者Th1细胞百分率、Th1/ Th2比值明显升高，差异非常显著。外周血Th1细胞百分率与PBMC培养上清液中IFN-γ浓度、Th2细胞百分率与PBMC培养上清液中IL-4浓度、Th1/Th2与PBMC培养上清液中IFN-γ／IL-4的比值均呈显著性正相关。结论 先兆子痫患者Th1细胞亚群功能增强，Th1/Th2细胞亚群功能失衡，导致病理妊娠。正常妊娠女性Th1细胞亚群功能明显减弱，对妊娠具有保护作用。流式细胞仪检测外周血Th1、Th2细胞百分率和ELISA法测定PBMC体外培养上清液中细胞因子IFN-γ和IL-4浓度具有良好的相关性。     

脂肪血制备悬浮红细胞的质量研究

目的研究脂肪血制备的悬浮红细胞的质量变化。方法按常规制备滤除白细胞悬浮红细胞的方法处理轻、中、重度脂肪血及正常血,检测其过滤前后红细胞渗透脆性,观察红细胞在储存期K+、Na+浓度、pH值、游离血红蛋白浓度的变化。结果中、重度组红细胞渗透脆性在过滤后明显增高,轻度组、正常组无明显变化。储存期中、重度组红细胞K+浓度、游离血红蛋白浓度明显高于轻度组和正常组(P0.05)。Na+浓度、pH值各组间比较差异无统计学意义(P0.05)。结论对于轻度脂肪血可采用弃其血浆,利用红细胞,而对于中、重度脂肪血应该选择报废。     

保存前后滤除WBC的RBC悬液质量的对比性研究

目的探讨保存前后滤除WBC(滤白)的RBC悬液质量的变化,为临床选择滤白时机提供参考依据。方法对4℃保存5d的悬浮RBC 20袋(每袋2U)用血库型滤器滤白作为保存后滤白组(A组),由血站滤白的少白悬浮RBC 20袋(每袋2U)作为保存前滤白组(B组);分别在第7天、第14天、第21天、第28天和第35天测定两组血细胞指标、炎性细胞因子水平。结果 B组血浆游离血红蛋白(FHb)在第14天明显升高,K+浓度在21d显著升高,且二者浓度随保存时间的延长而增加(P<0.05);A组炎性细胞因子(IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α)水平在滤白后第21天时才明显升高,与B组比较差异有统计学意义(P<0.05);A、B两组回收率差异无统计学意义(P>0.05)。结论保存前后滤白都能达到很好的滤除效果,但不同的滤白贮存方式对血液的质量产生不同的效果,为临床选择不同的滤白RBC提供了实验依据。     

Transfusion of fresh murine red blood cells reverses adverse effects of older stored red blood cells

BACKGROUND: Although a subset of recent studies have suggested that red blood cell (RBC) storage length is associated with adverse patient outcomes, others have shown no such relationship. Adults may be transfused with RBC units of different storage lengths, and existing studies do not take into consideration that fresh RBCs may alter responses to concurrently transfused stored RBCs. To test this possibility, we utilized a murine model and investigated transfusion outcomes of fresh, stored, or fresh‐plus‐stored RBCs. STUDY DESIGN AND METHODS: Fresh, 14‐day‐stored or fresh plus 14‐day‐stored leukoreduced RBCs from HOD‐transgenic donors (with RBC‐specific expression of hen egg lysozyme, ovalbumin, and human Duffy^b) were transfused into naïve C57BL/6 recipients. Serum cytokines and anti‐HOD alloimmunization were evaluated after transfusion. RESULTS: In six of six experiments (n = 90 mice total), a proinflammatory serum cytokine storm of interleukin‐6, keratinocyte‐derived chemokine/CXCL1, and monocyte chemoattractant protein‐1 was observed in transfusion recipients of stored but not fresh RBCs, along with high degrees of anti‐HOD alloimmunization. However, concurrent transfusion of fresh HOD RBCs along with stored HOD RBCs significantly decreased these adverse outcomes (p < 0.05). CONCLUSIONS: These results are consistent with fresh murine HOD RBCs losing protective properties during storage, and introduce a previously unrecognized variable in RBC storage studies. If translatable to humans, uniform “old blood” groups may be needed in future clinical studies to more accurately investigate the biologic effects of older RBC units.     

Magnesium content of mononuclear blood cells

The magnesium content of mononuclear blood cells may provide a better assessment of intracellular magnesium or total body magnesium status than does measurement of magnesium in plasma or erythrocytes. We describe a method for determining this, and report results for 20 normal volunteers. The mononuclear cells are separated with a discontinuous Ficoll-Hypaque gradient, washed, centrifuged at 400 X g, and lysed by sonication in 10 mmol/L NaCl. The magnesium in the cell lysate, with 2.93 g of added lanthanum oxide per liter, is determined by atomic absorption spectrometry. The mean mononuclear cell magnesium content in our volunteers was 70.7 (SD 14.1) fg per cell and 9.29 (SD 1.85) mg/g of DNA. The CVs for the determinations of magnesium, DNA, and cell count were 3.0%, 5.0%, and 8.7%, respectively. There was a significant correlation (r = 0.67, p less than 0.001) between results by the two methods of expressing magnesium content of mononuclear cells. However, by either method there were no significant correlations among results for magnesium concentration of mononuclear cells, plasma, or erythrocytes.