α粒子诱发 BEP2D细胞转化过程中肺癌相关基因表达的 cDNA Microarray研究

目的：探讨辐射诱发人支气管上皮细胞（BEP2D）转化过程中肺癌相关基因的表达。方法：用Cartesian PixSys5500cDNA Microarray点样仪将60个肺癌相关基因以微阵列形式点布于醛基化的玻璃片上。提取α离子辐射前BEP2D细胞（原代）和α粒子辐射后20代、35代细胞总RNA,经长片段反转录和线性扩增标记成荧光探针后与微阵列中cDNA进行杂交。结果：原代细胞中检测到40个基因表达;20代检测到47个基因表达;35代检测到20个基因表达。所检测的基因中,抑癌基因的mRNA丰度的原代和20代后细胞中急剧下降;大多数癌基因的表达丰度在20代以后细胞中仅轻微下降;生长因子类基因大都在20代细胞表达。结论：在辐射诱发的人支气管上皮转化细胞中,抑癌基因的失活可能与细胞恶化有关,癌基因及生长因子类基因可能促进了细胞的转化。     

α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达基因cDNA文库的构建

目的: 建立α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达基因的文库.方法:抑制消减杂交法(SSH).结果:建立了3个人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达基因的cDNA文库.其中,A差减文库(永生化人支气管上皮细胞BEP2D的cDNA为tester,α粒子照射BEP2D细胞后35代恶性转化细胞R15Hp35的cDNA为driver)有416个克隆,B差减文库(α粒子照射BEP2D细胞后20代转化细胞R15Hp20的cDNA为tester,BEP2D和R15Hp35细胞的cDNA混合后为driver) 有301个克隆,C差减文库(R15Hp35细胞的cDNA为tester,BEP2D细胞的cDNA为driver)有586个克隆.,对文库中70个cDNA克隆单向测序后发现:61个cDNA为己知基因,9个cDNA在GenBank中无法查到对应的同源序列,可能代表了新基因.结论:3个差减文库的cDNA可能代表了α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化不同时期差异表达的基因,此为进一步研究α粒子诱导肺癌发生的分子机制奠定了基础.     

支气管上皮细胞系BEP2D恶性转化过程中p16基因甲基化改变研究

目的 研究人支气管上皮细胞系BEP2D恶性转化过程中pl6基因甲基化改变以及pl6基因mRNA转录情况。方法 选取正常人支气管上皮细胞系BEP2D及其经α粒子照射20周(R-20)、21周(R-21)、35周(T-35)和54周(T-54)的BEP2D细胞株作为研究对象(其中R-20、R-21末发生恶性转化，而T-35、T-54已发生恶性转化)．采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR，MSP)检测各细胞株中pl6基因的甲基化改变情况，再运用半定量反转录PCR(retro-translation PCR，RT-PCR)检测pl6基因mRNA在各细胞株中的表达情况。结果 ①正常BEP2D细胞株pl6基因未发生甲基化，而R-20、R-21、T-35和T-54细胞的pl6基因均发生了甲基化改变。②与正常BEP2D细胞相比，R-20、R-21、T-35和T-54细胞p16基因mRNA转录水平均降低。结论 pl6基因甲基化改变发生在肺癌形成的早期阶段。p16基因甲基化可导致p16基因mRNA转录水平降低。     

在BEP2D细胞恶性转化过程中TGF-β1对Smad7表达的调节

背景与目的:细胞逃避转化生长因子-β(TGF-β)诱导的对细胞生长、增殖的抑制是许多肿瘤发生的一个重要机制.Smad7是TGF-β信号转导通路的抑制型Smads,它可阻断TGF-β信号在胞浆内的传导,其紊乱是TGF-β信号转导通路紊乱的机制之一.本研究旨在分析在细胞恶性转化过程中,Smad7基因表达是否发生紊乱,TGF-β1对Smad7基因的调控功能有无发生变化,以探索细胞发生恶性转化的原因.方法:培养BEP2D细胞及BERP35T-2细胞,于收获前60min和90min加入不同剂量的TGF-β1,提取细胞总RNA,分别以未加TGF-β1的细胞组作为对照,用Northernblot杂交比较两组细胞Smad7mRNA表达的差异以及细胞对TGF-β1细胞因子刺激的反应性.同时提取BEP2D及BERP35T-2细胞蛋白,用Westernblot方法比较两组细胞内源性TGF-β1表达的差异.结果:Smad7mRNA表达水平恶性转化细胞高于永生化细胞;加了TGF-β1细胞因子后,BEP2D细胞Smad7mRNA表达增高,BERP35T-2细胞表达水平改变不明显.而内源性TGF-β1的表达水平,BERP35T-2细胞稍高于BEP2D细胞.结论:Smad7在辐射致肺癌细胞系中的过表达及对TGF-β1应答的降低可能是辐射诱发肺癌发生的机制之一.     

SAGE方法分析永生化BEP2D细胞及α粒子诱发恶性转化BEP2D细胞的基因表达

目的：采用基因表达系列分析（serial analysis of gene expression,SAGE)方法,分析永生化BEP2D细胞及α粒子诱发恶性转化BEP2D细胞的基因表达。方法：细胞培养,收获永生化BEP2D细胞及α粒子诱发恶性转化BEP2D细胞;提取细胞总RNA,分离mRNA,合成生物素标记的双链cDNA;采用SAGE方法获取标签序列,结合UniGene文库分析标签代表的转录本,最终通过SAGE软件分析标签丰度,比较两组细胞基因表达差异。选取SAGE实验得到的在两组细胞中表达的已知基因Smad7和CCR11,以RT-PCR方法制备探针,用两组细胞等量总RNA为样本,做Northernblot杂交。结果：建立了2个独立的SAGE文库。一个是1.5Gyα粒子照射诱发恶性转化BGEP2D细胞的SAGE文库,一个是永生化BEP2D细胞SAGE文库。从2具文库中分别挑取克隆53个、50个,进行测序,测序一共得到总标签2331个,代表单一转录本252个,有70%的SAGE标签可找到与之一一对应的基因,有84个核糖体蛋白基因,约占33%;有12个转录本（4.8%)找不到与之理想匹配的已知基因;2个SAGE文库间,大多数基因表达丰度相近,对2个SAGE文库进行比较发现有在永生化细胞中高表达的基因,也有在恶转细胞中高表达的基因。Northernblot杂交证实SAGE方法得到的TGF-β诱导的Smad7基因在恶转BEP2D细胞中表达略高,化学激活物受体CCR11基因在永生化BEP2D细胞高表达。结论：（1）现有SAGE结果给出两组细胞基因表达丰度及表达差异的趋势。（2）SAGE方法结合Northernblot杂交,证实TGF-βr诱导的Smad7基因在恶转BEP2D细胞中表达略高,化学激活物受体CCR11基因在永生化BEP2D细胞高表达,提示Smad7基因在恶转BEP2D细胞中表达略高,化学激活物受体CCR11基因在永生化BEP2D细胞高表达。结论：（1）现有SAGE结果给出两组细胞基因表达丰度及表达差异的趋势。（2）SAGE方法结合Northernblot杂交,证实TGF-β诱导的Smad7基因在恶转BEP2D细胞中表达略高,化学激活物受体CCR11基因在永生化BEP2D细胞高表达,提示Smad7基因参与细胞恶转,CCR11基因对维持细胞正常生长有作用。（3）SAGE方法同时定量比较两组或两组以上mRNA间基因表达水平,简便、快捷,尤其适于筛查已知基因的新功能。     

α-粒子诱发人BEP2D恶性转化细胞的亚克隆及DNA链断裂修复研究

目的:建立α-粒子诱发人支气管上皮细胞(BEP2D)恶性转化细胞的克隆细胞系,研究其核型和DNA链断裂修复能力.方法:1.5 Gy α-粒子照射的BEP2D细胞传35代后接种裸鼠成瘤,取出瘤细胞进行亚克隆,挑出单个克隆扩大培养,G带显示分析细胞核型,脉冲电场凝胶电泳法检测DNA双链断裂.结果:亚克隆了5个恶性转化细胞系(RP35T-1,-2,-4,-5,-6),核型基本与BEP2D细胞相近,但有着不同的染色体缺失,其中2株细胞(RP35T-2和RP35T-4)多倍体高达40%,明显高于BEP2D细胞.恶性转化细胞RP35T-1和RP35T-4的DNA双链断裂重接修复缺陷.结论:建立了α-粒子诱发人BEP2D恶性转化细胞的克隆细胞系,DNA链断裂修复缺陷可能是α-粒子致癌的一个重要特点.     

α-粒子诱发人BEP2D恶性转化细胞的亚克隆及DNA链断裂修复研究

目的:建立α-粒子诱发人支气管上皮细胞(BEP2D)恶性转化细胞的克隆细胞系,研究其核型和DNA链断裂修复能力.方法:1.5 Gy α-粒子照射的BEP2D细胞传35代后接种裸鼠成瘤,取出瘤细胞进行亚克隆,挑出单个克隆扩大培养,G带显示分析细胞核型,脉冲电场凝胶电泳法检测DNA双链断裂.结果:亚克隆了5个恶性转化细胞系(RP35T-1,-2,-4,-5,-6),核型基本与BEP2D细胞相近,但有着不同的染色体缺失,其中2株细胞(RP35T-2和RP35T-4)多倍体高达40%,明显高于BEP2D细胞.恶性转化细胞RP35T-1和RP35T-4的DNA双链断裂重接修复缺陷.结论:建立了α-粒子诱发人BEP2D恶性转化细胞的克隆细胞系,DNA链断裂修复缺陷可能是α-粒子致癌的一个重要特点.     

在BEP2D细胞恶性转化过程中TGF—β1对Smad7事件的调节

背景与目的：细胞逃避转化生长因子－β（TGF－β）诱导的对细胞生长,增殖的抑制是许多肿瘤发生的一个重要机制。Smad7是TGF－β信号转导通路的抑制型Smads,它可阻断TGF－β信号在胞浆内的传导,其紊乱是TGF－β信号转导通路紊乱的机制之一。本研究旨在分析在细胞恶性转化过程中,Smad7基因表达是否发生紊乱,TGF－β1对Smad7基因的调控功能有无发生变化,以探索细胞发生恶性转化的原因。方法：培养BEP2D细胞及BERP35T－2细胞,于收获前60min和90min加入不同剂量的TGF－β1,提取细胞总RNA,分别以未加TGF－β1的细胞组作为对照,用Northern blot杂交比较两组细胞Smad7 mRNA表达的差异以及细胞对TGF－β1细胞因子刺激的反应性。同时提取BEP2D及BERP35T－2细胞蛋白,用Western blot方法比较两组细胞内源性TGF－β1表达的差异。结果：Smad7 mRNA表达水平恶性转化细胞高于永生化细胞;加了TGF－β1细胞因子后,BEP2D细胞Smad7 mRNA表达增高,BERP35T－2细胞表达水平改变不明显。而内源性TGF－β1的表达水平,BERP35T－2细胞稍高于BEP2D细胞。结论：Smad7在辐射致肺癌细胞系中的过表达及对TGF－）1应答的降低可能是辐射诱发肺癌发生的机制之一。     

α粒子诱发BEP2D细胞恶性转化中细胞内抗氧化蛋白和活性氧水平研究

目的：研究α粒子诱发永生化人支气管上皮细胞BEP2D恶性转化过程中细胞内主要抗氧化蛋白的表达和活性氧（ROS）水平以及DNA双链断裂水平的变化。方法：选择BEP2D细胞、RH22细胞和BERP35T-1细胞,采用Western blot检测细胞内抗氧化蛋白过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPXs）以及铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）和锰-SOD（Mn-SOD）的表达;采用SOD测定试剂盒检测细胞内总SOD（T-SOD）、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD酶活力;荧光探针标记结合流式细胞仪检测细胞内基础H_2O_2和O_2~（？）水平;中性彗星电泳法检测细胞内DNA双链断裂水平。结果：与BEP2D细胞相比,RH22和BERP35T-1细胞内抗氧化蛋白CAT和GPX1表达下调（P〈0.05或P〈0.01）,GPX3、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD表达增强（P〈0.05或P〈0.01）;且T-SOD、Cu/Zn-SOD和Mn-SOD活力均显著升高（P〈0.05或P〈0.01）。RH22和BERP35T-1细胞内基础O_2~（？）水平低于BEP2D细胞,基础H_2O_2和DNA双链断裂水平则高于BEP2D细胞（P〈0.05）。结论：细胞内氧化/抗氧化失衡形成氧化压力,促进DNA氧化损伤和基因组不稳定性,可能是α粒子诱发BEP2D细胞恶性转化的机制之一。     

α粒子诱发人支气管上皮细胞癌变的DNA修复基因表达谱研究

背景与目的 :DNA修复系统在细胞基因组完整性维持中发挥重要作用 ,本研究探讨α粒子辐射诱发人支气管上皮细胞癌变的DNA修复基因表达谱变化。 材料与方法 :采用Cy5和Cy3分别标记的癌变细胞BERP35T4和亲本细胞BEP2D的cDNA探针与DNA修复基因cDNA微矩阵杂交、ScanArray3000扫描仪扫描和ImaGene3.0软件分析比较基因表达差异。 结果 :分析比较了人支气管上皮细胞癌变前(BEP2D)和后(BERP35T4)126个DNA修复相关基因的表达谱 ,发现细胞癌变后有10个修复基因的表达降低 ,这些基因分别参与DNA链断裂修复、核苷酸切除修复和碱基切除修复反应 ,3个基因(DNA_PKcs、SMUG和RAD18)表达上调。结论 :细胞DNA修复表达改变是辐射诱发细胞恶性转化的机制之一。     

EXPRESSION PATTERN OF LUNG CANCER RELATED GENES IN MALIGNANT TRANSFORMATION OF BEP2D

Expression changes of certain critical genes play an important role in the development of tumorigenesis, for example, if the gene encoding a tumor suppressor is depressed. Identification of the expression changed genes in the malignant transformed cells can provide some useful information to elucidate the mechanism of tumorigenesis. BEP2D is a HPV18 immortalized human bronchial epithelial cell line. The transformation cell model was generated from BEP2D by 1.5 Gy of alpha-particles exposu…     

Differentially expressed genes in asbestos-induced tumorigenic human bronchial epithelial cells: implication for mechanism

Although exposure to asbestos fibers is associated with the development of lung cancer, the underlying mechanism(s) remains unclear. Using human papillomavirus-immortalized human bronchial epithelial (BEP2D) cells, we previously showed that UICC chrysotiles can malignantly transform these cells in a stepwise fashion before they become tumorigenic in nude mice. In the present study we used cDNA expression arrays to screen differentially expressed genes among the tumorigenic cells. A total of 15 genes were identified, 11 of which were further confirmed by northern blot. Expression levels of these genes were then determined among transformed BEP2D cells at different stages of the neoplastic process, including non-tumorigenic cells that were resistant to serum-induced terminal differentiation, early and late passage transformed BEP2D cells, five representative tumor cell lines and fused tumorigenic-control cell lines which were no longer tumorigenic. A consistent 2- to 3-fold down-regulation of the DCC (deleted in colon cancer), Ku70 and heat shock protein 27 genes were detected in all the independently generated tumor cell lines while expression levels in early transformants as well as in the fusion cell lines remained normal. In contrast, all the tumor cell lines examined demonstrated 2- to 4-fold overexpression of the insulin receptor and its signal transduction genes. Differential expression of these genes was completely restored in the fusion cell lines examined. No alteration in c-jun or EGF receptor expression was found in any of the cell lines. Our data suggest that activation of the insulin receptor pathway and inactivation of DCC and Ku70 may cooperate in malignant transformation of BEP2D cells induced by asbestos.     

DNA依赖蛋白激酶在人支气管上皮细胞癌变株和肺癌组织中的异常表达

目的:探讨辐射诱发人支气管上皮细胞癌变株和肺癌组织中DNA依赖蛋白激酶(DNA dependent protein kinase, DNA-PK)的激酶活性或表达变化。方法:用Western blot和p53蛋白为特异性底物的磷酸化反应分别检测癌变细胞中DNA-PKcs表达和激酶活性,用免疫组化结合病理图像定量分析技术检测肺癌组织和癌旁组织中DNA-PKcs蛋白的表达情况。结果:a粒子辐射诱发的人支气管上皮细胞癌变株BERP35T-1的DNA-PKcs表达水平比亲本细胞BEP2D提高30%,激酶活性显著提高。所检测的14例非小细胞肺癌组织中DNA-PKcs蛋白表达水平普遍高于相对应的癌旁组织,两组之间有显著性差异(P < 0.05)。结论:非小细胞肺癌组织中DNA-PKcs表达增加,可能成为肺癌的一个生物标记物。     

Absence of the microsatellite mutator phenotype in human bronchial epithelial cells transformed by alpha particles

The immortalized human bronchial epithelial cell line, BEP2D, can become malignantly transformed following its irradiation with alpha particles. Exposed cells progress through a latent period of eight to ten weeks prior to exhibiting malignant properties. The molecular basis for this delay is unclear, however it is thought to involve a manifestation of genomic instability brought on by ionizing radiation. In this study we addressed whether the microsatellite mutator phenotype which arises in cells that lack mismatch repair function could have played a role in the radiation-induced transformation of BEP2D cells. Three cell lines, including BEP2D and two transformed clonal derivatives, H2BT2L and R30T1L, were examined for the presence of the microsatellite mutator phenotype using a selectable reporter system developed in our laboratory. This reporter system is based on the ability of stably transduced cells to restore the reading frame of a hygromycin B phosphotransferase transferase gene rendered out of frame by the insertion of a (CA)(13) repeat tract immediately downstream of the ATG start codon. The parental BEP2D cell line had a relatively low hygromycin B resistant colony formation frequency of 2.36 x 10(-4). This value was similar to the frequencies of two malignantly transformed derivatives H2BT2L (0.996 x 10(-4)) and R30T1L (1.87 x 10(-4)). We therefore conclude that the H2BT2L and R30T1L cell lines are not deficient in their hMSH2, hMLH1, hPMS2 or hMSH3 mismatch repair gene functions, and that other factors orchestrated the alpha particle induced malignant transformation of H2BT2L and R30T1L cells.     

Smad7基因过表达的促增殖作用机制探讨

目的 研究Smad7过表达使人支气管上皮细胞系增殖能力增强的机制。方法 用Smad7真核表达载体PCISmad7．neo同携带有报告基因碱性磷酸酶的c-myc顺式增强子元件pMyc-SEAP共转染,检测Smad7基因对增殖信号通路的影响。用RT-PCR方法,检测稳定转染Smad7基因前后永生化及恶性化的人支气管上皮细胞系BEP2D和BERF35T2细胞内c-myc、p15、p21表达水平的变化,调查Smad7基因对TGF-β介导的抗增殖基因反应的调控。结果 报告基因检测结果表明,Smad7基因可使参与增殖信号通路的c-myc顺式增强子元件活性增强。RT-PCR结果表明,在稳定转染Smad7基因的细胞中,c-myc表达上调,p15表达降低,对TGV-β刺激的应答丧失,p21表达降低。结论 Smad7基因可通过调控TGF-β介导的抗增殖基因应答来影响细胞的生长、增殖能力。     

RESPONSIVENESS OF Smad7 GENE TO TGF-b1 IN THE TUMORIGENESIS

Transforming growth factor-b (TGF-b) is a potent natural antiproliferative agent that plays an important role in suppressing tumorigenicity. Disruption of TGF-b signaling is implicated in numerous cancers, such as colon-rectal cancer, pancreatic cancer, lung cancer, skin cancer, et al. TGF-b signaling occurs via ligand-initiated complex formation of a heteromeric serine-threonine kinase receptor complex, following which the TGF-b type I receptor is phosphorylated by the constitutively act…     

卷烟烟气诱发永生化人支气管上皮细胞恶性转化不同阶段的基因表达谱研究

背景与目的:应用基因芯片技术,分析卷烟烟气(cigarette smoke condense,CSC)诱发永生化人支气管上皮细胞BEP2D发生恶性转化不同阶段的基因表达谱变化.材料与方法:用CSC对不同代龄的永生化人支气管上皮细胞BEP2D进行染毒,用软琼脂克隆及流式细胞术对染毒细胞的恶性转化性状进行检测,分离培养已发生恶性转化的软琼脂克隆细胞.分别提取不同代龄染毒细胞的总RNA,选用人类全基因组寡核苷酸芯片Sentrix(R)Human-6 Expression Bead Chip,通过芯片的杂交、清洗及扫描,对染毒细胞的基因表达谱进行分析.结果:用CSC对BEP2D细胞染毒后,从第30代细胞(P30)开始,细胞获得了锚着独立生长特性,流式细胞术分析显示.P40细胞出现多倍体.我们从软琼脂克隆中分离出具有恶性转化特性的细胞C2,与烟气溶剂对照细胞相比,染毒后细胞P10、P20、P30、P40及C2中均表达下调的基因有269个,表达上调的基因有63个,这些基因的改变发生在CSC诱发BEP2D细胞恶性转化的早期阶段.与癌启动相关.CSC染毒后,P10、P20表达没有变化,而在P30、P40及C2中发生表达下调的基因有316个,表达上调的基因有147个,这些基因的改变发生在CSC诱发BEP2D细胞恶性转化的中期,与癌促进相关.结论:从CSC诱发BEP2D细胞恶性转化不同阶段的基因表达谱,筛选出一批与癌症的启动及发展阶段相关的基因,为深入了解吸烟致肺癌的发生、发展机制提供了有价值的信息,同时也为制备吸烟致肺癌相关基因的检测芯片奠定实验基础.