牙龈卟啉单胞菌促进人脐静脉内皮细胞一氧化氮的生成

目的:观察牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelialcells,HUVEC)一氧化氮(NO)生成的影响,探讨Pg对内皮细胞功能损伤的途径,以期为牙周病在动脉粥样硬化发病机制中的作用提供依据.方法:用感染复数(multiplicity of infection,MOI)1∶10、1∶100Pg干预HUVEC,未受Pg干预的HUVEC作为阴性对照组,分别于4、8、12、24 h时收集细胞上清液,利用硝酸还原酶法测定细胞上清液中NO的浓度:Western.blot检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表达水平;透射电镜观察Pg对HUVEC的黏附和入侵方式.结果:在24 h内,PgMOI 1∶10、1∶100能促进HUVEC NO的生成,与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),PgMOII∶10,MOII∶100可以诱导HUVEC iNOS的蛋白表达,抑制eNOS的蛋白表达,与阴性对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05),透射电镜观察Pg能够利用其菌毛黏附于HUVEC细胞表面并入侵到HUVEC细胞胞质内,定植于细胞内.结论:Pg能够黏附于HUVEC并入侵到细胞胞质内,诱导iNOS蛋白表达,抑制eNOS的蛋白表达,最终促进HUVEC NO的生成.过量的NO可能发挥细胞毒性作用,导致内皮功能失调.     

异丙酚对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞内皮源型一氧化氮合酶基因启动子转录活性的影响

目的 探讨异丙酚对脂多糖(LPS)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)内皮源型一氧化氮合酶(heNOS)基因启动子转录活性的影响.方法 以基因重组技术构建heNOS基因启动子区(-1～-1600 bp)驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL2-Basic,得到质粒peNOS-Luc.采用脂质体介导的细胞基因共转染技术将peNOS-Luc、空载体pGL2-Basic和?-半乳糖苷酶表达质粒pCMV-?共转染HUVEC,用LPS、LPS 异丙酚和LPS 转移生长因子?1(TGFb1)分别刺激转染后的HUVEC,检测并比较荧光素酶/?-半乳糖苷酶活性,以确定LPS、异丙酚和TGF?1对heNOS基因启动子转录活性的影响.结果 (1)酶切和测序结果均证实重组载体peNOS-Luc构建正确;(2)重组载体peNOS-Luc在HUVEC中有效表达;(3)与未加刺激组比较,LPS刺激组heNOS启动子的转录活性降低.与LPS刺激组比较,LPS 异丙酚和LPS TGF?1组heNOS启动子的转录活性增强.结论 异丙酚能明显增强heNOS基因启动子的转录活性,可初步证实异丙酚在转录水平通过上调heNOS基因启动子的转录活性而影响NO的生成和释放,这可能是异丙酚防治LPS诱导引起炎症反应的机制之一.     

TNF-α对人脐静脉内皮细胞中NO和eNOS的影响

目的 讨论肿瘤坏死因子-α（TNF—α）对内皮细胞一氧化氮（NO）产生及内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性的影响。方法 以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）为实验材料，检测与不同浓度TNF—α作用不同时间后．细胞培养上清液和细胞中NO水平的变化，以及细胞eNOS活性的改变。结果 （1）随着TNF—α浓度的升高，eNOS的活性减弱，而细胞和上清液中NO的含量增加；（2）随着干预时间的延长，eNOS的活性减弱；而细胞和上清液中NO的含量在作用24h后升高，且明显高于对照组；（3）L一单甲基精氨酸（L—NMMA）和地塞米松（DXM）均能阻断TNF-α引起的细胞和细胞上清中NO的表达增加。结论 TNF-α降低eNOS活性，却在高浓度和长时间作用后增加NO的合成，可能与激活诱导型一氧化氮合酶有关，因为NO的变化可以被L—NMMA和DXM阻断。     

不同水平糖浓度对人脐静脉内皮细胞SOD、NOS及NO的影响

目的:观察体外培养条件下,不同水平的糖浓度对血管内皮细胞一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)的影响.方法:体外培养人脐静脉内皮细胞株ECV304,分对照组、高糖组和糖浓度递增组,使用分光光度比色法检测NOS、NO和SOD的吸光度,计算出活力或含量.结果:与对照组比较,高糖组NOS活力和NO含量增加,SOD活力下降;递增组NOS活力、NO含量增加及SOD活力下降幅度均较高糖组更加明显.结论:递增性高糖较持续的高糖对内皮细胞SOD的抑制作用和NOS、NO的诱导作用明显增强.     

不同浓度Hcy对培养的人脐静脉内皮细胞NO及eNOS转录水平的影响

目的 :通过培养的人脐静脉内皮细胞 (humanum blilicalveinendothelialcell,HUVEC) ,研究不同浓度的同型半胱氨酸 (homocysteine ,Hcy)对内皮细胞分泌一氧化氮 (NO)以及对内皮源性一氧化氮合酶 (eNOS)转录水平的影响 .方法 :收集HUVEC ,然后进行细胞培养 ,传至第 3代后 ,将其与不同浓度的Hcy(生理浓度 0 .0 1mmol·L -1、病理生理浓度 0 .5mmol·L -1、非毒性药理浓度 2 .0mmol·L -1、毒性药理浓度5 .0mmol·L-1)共同培养 2 4h ,分别在 4 ,6 ,8和 2 4h检测培养液中NO的含量 .2 4h后 ,收集HUVEC ,提取总的RNA ,利用eNOS特异性引物进行逆转录 ,从而探讨Hcy对eNOSmR NA水平的影响 .结果 :HUVEC与不同浓度的Hcy培养 2 4h后 ,其NO呈现剂量依赖性的下降 (2 4h时 ,各浓度Hcy的培养液中的NO的含量分别为 19.71± 3.88μmmol·L -1,14 .0 8± 4 .4 6 μmmol·L -1,8.71± 6 .6 3μmmol·L -1,7.0 1±3.6 3μmmol·L -1,2 .37± 0 .77μmmol·L -1,P <0 .0 1) ,但2 4h后 ,eNOS的RT PCR结果显示各组间的产物电泳带无明显的差异 .结论 :Hcy可以导致内皮细胞释放NO减少 ,但对eNOS的转录却没有明显的影响     

雌二醇对人脐静脉内皮细胞一氧化氮生成的作用

目的：观察17β－雌二醇（17β－E2）对原代培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）一氧化氮（NO）生成的影响,探讨雌激素影响体内NO水平的机制。方法：采用胰蛋白酶平铺消化法培养原代HUVEC,不同浓度17β－E2作用HUVEC不同时间,采用重氮法测定NO含量。结果：10^-6mol/L,10^-8mol/L 17β-E2作用1h,NO即明显增高（P＜0．001）,10^-6mol/L,17β－E2作用30min,NO即明显增高（P＜0．05）,10^-10mol/L,10^-8mol/L 17β－E2作用30min,NO与对照组无统计学差异。结论：一定剂量17β－E2可促进HUVEC生成NO,可能为降低血管阻力,抑制动脉粥样硬化（AS）形成的重要机制之一。     

低糖诱导人脐静脉内皮细胞一氧化氮与活性氧变化的研究

目的观察低浓度葡萄糖对人脐静脉内皮细胞一氧化氮(NO)与活性氧(ROS)变化的影响。方法以体外培养人脐静脉内皮细胞株HUVEC-12为研究对象,将实验分为正常对照组(5.5mmol/L葡萄糖)、低糖组(2.8mmol/L葡萄糖)、无糖组(0mmol/L葡萄糖)。分别用2.8、0mmol/L葡萄糖干预HUVEC-12细胞,经过1、2、4、12h后,硝酸还原酶法测定NO产量,化学比色法测定一氧化氮合成酶(NOS)活性,Dihydroethidium荧光探针法测定细胞内ROS水平。结果与正常对照组相比,低糖组与无糖组NO水平降低(P<0.01),NOS活性下降(P<0.01),细胞内ROS水平升高(P<0.01),均呈剂量依赖关系。同一浓度组内随着时间的延长,内皮细胞NO水平、NOS活性进一步降低(P<0.01),ROS水平进一步升高(P<0.05),各指标都具有浓度和时间依赖性。结论低糖可导致内皮细胞功能障碍,NO水平降低,NOS活性下降,其机制可能与低糖导致内皮细胞氧化应激损伤有关。     

高糖对人脐静脉内皮细胞GSH-PX活力、NOS及ICAM-1表达的影响

目的:探讨体外培养条件下高糖状态对血管内皮细胞的影响。方法:培养人脐静脉内皮细胞株ECV3 0 4,分为对照组和高糖组,用分光光度比色法检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH PX)活力,RT- PCR法检测细胞间粘附分子1(ICAM- 1)mRNA水平,免疫细胞化学法观察内皮细胞型一氧化氮合酶(eNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的蛋白表达。结果:高糖组GSH- PX活力明显下降,eNOS、iNOS蛋白表达明显增高,ICAM- 1mRNA水平也显著上升。结论:在较短时间内糖浓度升高可引起血管内皮细胞GSH PX活力下降,ICAM -1mRNA、eNOS和iNOS蛋白表达增高,对糖尿病血管病变早期进展起一定的作用。     

非诺贝特对LPC诱导脐静脉内皮细胞增殖、凋亡及eNOS基因表达的影响

目的：探讨非诺贝特对LPC诱导的脐静脉内皮细胞增殖、凋亡及内皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因表达的影响。方法：体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs），根据非诺贝特不同浓度分为正常对照组、LPC组、低浓度非诺贝特（10μmol／L）组、中浓度非诺贝特（50μmol／L）组、高浓度非诺贝特（100μmol／L）组，根据非诺贝特不同干预时间分为正常对照组、LPC组、非诺贝特（50μmol／L）干预6h组、12h组、24h组、48h组进行实验。分别观测不同浓度及不同时间非诺贝特内皮细胞增殖、凋亡、NO浓度及eNOS mRNA表达的变化。结果：与正常对照组比较，LPC抑制内皮细胞增殖，促进细胞凋亡，并使HUVECs eNOS mRNA表达降低，NO合成减少。非诺贝特可干预LPC对内皮细胞的作用，使内皮细胞增殖增强，细胞凋亡减少，eNOS mRNA表达升高，NO合成增加，且其作用呈时间-效应、浓度-效应依赖关系。结论：非诺贝特可改善LPC对HUVECs的影响，使内皮细胞增殖增强，凋亡减少，eNOS mRNA表达升高，NO合成增加，从而起到抗动脉硬化作用。     

人脐静脉内皮细胞的培养与鉴定

目的研究人脐静脉内皮细胞的体外培养方法,并进行细胞鉴定。方法胰蛋白酶灌流消化法收集人脐静脉内皮细胞,加入DMEM/F12混合培养基,37℃5%CO2培养箱中培养,观察细胞形态及生长状况,近融合时消化传代培养。采用形态学观察和CD34免疫组化法进行细胞鉴定。结果原代培养的人脐静脉内皮细胞约于24h完全贴壁,4~5d后融合成单层铺路石样结构。CD34染色证实培养的细胞是人脐静脉内皮细胞。结论胰蛋白酶灌流消化法可获得大量连续传代扩增的人脐静脉内皮细胞。     

人脐静脉内皮细胞的研究和应用

血管内皮细胞在人体多种生理和病理过程中发挥重要作用,一直以来都是研究的热点。其中使用最广泛的当属人脐静脉内皮细胞,然而就其各种亚系细胞有何特点和优劣,国内尚未见报道。现通过总结原代人脐静脉内皮细胞、延长寿命的脐静脉内皮细胞系、永生化的脐静脉内皮细胞系等在医学研究领域的应用和进展,对不同种类之间优势和局限性进行比较,从而更好地指导实际运用。     

新藤黄酸对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的 探讨新藤黄酸对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）增殖和凋亡的影响。方法 用不同浓度的新藤黄酸培养细胞24、48 h后,采用MTT法观察新藤黄酸对细胞生长的抑制作用;倒置显微镜下观察HUVECs细胞形态变化;通过DAPI染色后倒置荧光显微镜观察新藤黄酸对细胞形态学的影响;通过Annexin V-FITC/PI双染及流式细胞术检测新藤黄酸对HUVECs细胞凋亡率的影响;Western blot检测新藤黄酸对HUVECs中凋亡相关蛋白Caspase-3的表达变化。结果 MTT检测结果显示新藤黄酸能够明显抑制HUVECs的增殖,并呈时效及量效关系;荧光显微镜观察结果显示,新藤黄酸作用HUVECs后出现大量凋亡细胞;流式细胞术结果显示,与空白对照组相比,随着新藤黄酸浓度的增加,细胞凋亡率明显增加;Western blot检测结果表明Caspase-3蛋白表达水平显著增加。结论 新藤黄酸对HUVECs有明显的抑制作用,其作用机制可能是通过诱导细胞凋亡实现的。     

片仔癀对人脐静脉内皮细胞增殖和迁移的影响

目的 观察片仔癀对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、迁移的影响,并探讨其作用机制.方法 用MTT法检潮片仔癀对HUVEC增殖的影响,用划痕损伤实验观察片仔癀对HUVEC的迁移的影响.结果 片仔癀干预6、12、24、48 h后,与空白对照组比较,各剂量组抑制HUVEC的增殖能力(P＜0.01),且有剂量和时间依赖;片仔...     

不同浓度胰岛素对脐静脉内皮细胞形态和活性的影响

目的 观察不同浓度胰岛素对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)形态和细胞活性的影响,用以筛选内皮细胞胰岛素抵抗模型.方法 应用含不同浓度胰岛素(50,40,30,20,10,1,0.1,0.01U/L)的DMEM培养基与HUVEC共同培养6、12、2...     

氧化高密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞一氧化氮合酶活性的影响及药物干预

目的：研究氧化高密度脂蛋白（ｏｘＨＤＬ）对人脐静脉内皮细胞（ＨＵＶＥＣ）一氧化氮合酶（ＮＯＳ）和血管紧张素转化酶（ＡＣＥ）活性的影响及丙丁酚、１７－β－雌二醇（Ｅ２）和尼膜地平的干预作用。方法用试剂盒检测ＨＵＶＥＣ培养上清中ＮＯＳ和ＡＣＥ活性。结果ｏｘＨＤＬ对ＨＵＶＥＣ中ＮＯＳ的生成有明显抑制作用,并具有浓度和时间依赖效应。丙丁酚、Ｅ２和尼膜地平可减轻ｏｘＨＤＬ的抑制作用,与ｏｘＨＤＬ组相比,ＮＯ     

健胎液对人脐静脉内皮细胞分泌血管活性物质的影响

采用血清药理学方法观察健胎液对缺氧人脐静脉内皮细胞（HUVEC）分泌血管活性物质——内皮素（ET）、前列环素（PGI2)、一氧化氮（NO)的影响,以及对缺氧HUVEC形态结构的保护作用,旨在探讨健胎液防治胎儿宫内生长迟缓（IUGR）的机理。结果表明健胎液可显著提高缺氧HUVEC合成分泌PGI2、NO（P<0.05,P<0.01）,同时减少ET的释放(P<0.05);从超微结构上观察,健胎液能明显减轻缺氧对HUVEC细胞器和细胞核的损伤。结果提示健胎液通过增强HUVEC对缺氧的耐受性,调节血管活性物质的分泌是其防治胎儿宫内生长迟缓的机制之一。     

黄秋葵总黄酮对氧化应激损伤人脐静脉内皮细胞的保护作用及其机制研究

目的 观察黄秋葵总黄酮对过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）氧化应激损伤的影响。方法 采用MTT法检测黄秋葵总黄酮对HUVECs的保护作用,采用分光光度法测定细胞培养上清液中细胞内超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）及一氧化氮（nitric oxide,NO）含量,酶联免疫吸附试验检测细胞上清液中内皮素-1（endothelin-1,ET-1）含量,采用二氯荧光乙酰乙酸盐法检测活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平;Western blot方法检测内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）的表达水平。结果 黄秋葵总黄酮可以提高氧化应激损伤的HUVECs存活率,增加SOD活性,升高NO水平,降低MDA、ET-1水平,降低细胞ROS水平,升高eNOS的表达水平。结论 黄秋葵总黄酮对过氧化氢诱导的HUVECs氧化应激损伤有保护作用,其作用机制可能与调节SOD、MDA、ET-1、NO氧化应激相关因子,调控内皮细胞功能相关蛋白eNOS的表达有关。     

人脐静脉内皮细胞分离培养及不同消化酶效力比较

目的采用酶消化法进行人脐静脉内皮细胞分离培养,并比较不同消化酶获得细胞数量及细胞存活率的差别。方法分别用0.125%、0.25%胰蛋白酶和0.1%I型胶原酶消化获取脐静脉内皮细胞,比较三种酶液消化的结果,在倒置相差显微镜下观察细胞形态特点,同时用Ⅷ因子免疫荧光法和DiI-acLDL摄取实验对所得细胞进行鉴定。结果0.125%、0.25%胰蛋白酶和0.1%I型胶原酶的最佳消化时间分别为15min、12min、15min,倒置相差显微镜下观察所得细胞呈典型内皮细胞形态,免疫荧光法检测Ⅷ因子相关抗原阳性,且细胞具有DiI-acLDL摄取能力。结论采用酶消化法分离培养脐静脉内皮细胞简便易行,但需严格掌握消化时间以减少细胞损伤,0.1%I型胶原酶是最理想的内皮细胞消化酶。     

PEP-1肽介导人过氧化氢酶转导入人脐静脉内皮细胞

目的:采用体外培养的人脐静脉内皮细胞株(CRL-1730),研究PEP-1肽介导人过氧化氢酶穿透细胞的能力。方法:构建原核表达质粒pET15b-PEP-1-CAT,将其在基因工程菌中表达出N端带有6个组氨酸“标签”(His-tag)的重组蛋白,并通过金属螯合亲和层析对其进行纯化,然后将纯化得到的PEP-1-CAT融合蛋白加入体外培养的人脐静脉内皮细胞,通过Western blot来分析其转导能力。结果:测序分析证实,原核表达质粒pET15b-PEP-1-CAT重组成功。SDS-PAGE和Western blot结果表明,PEP-1-CAT在E.coli中获得了高效表达,经Ni2+-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了融合蛋白PEP-1-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性,活性值为77.1 U/g。将其加入到体外培养的内皮细胞培养基中,发现它能以剂量依赖及时间依赖的方式转导入细胞内,并能保持酶活性达48 h。结论:PEP-1-CAT融合蛋白能高效地转导入人脐静脉内皮细胞,为防治各种与氧化应激损伤有关的疾病开辟了新的途径。