CTHRC1对卵巢癌细胞顺铂耐药的作用及机制研究

目的:探究胶原三股螺旋重复蛋白1(CTHRC1)对卵巢癌细胞顺铂耐药的作用及其相关机制。方法:Western blot法检测卵巢癌细胞株A2780、SKOV3及顺铂耐药细胞株A2780/DDP、SKOV3/DDP中CTHRC1蛋白表达水平。慢病毒lenti-sh CTHRC1转染SKOV3/DDP细胞,下调CTHRC1表达水平。CCK-8法检测沉默CTHRC1后SKOV3/DDP细胞增殖情况及顺铂半数抑制浓度(IC_(50))的变化。Western blot法检测转染后SKOV3/DDP细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表达情况及Akt、STAT3的磷酸化水平。结果:与A2780和SKOV3细胞相比,顺铂耐药细胞株A2780/DDP和SKOV3/DDP细胞中CTHRC1蛋白表达水平相对较高(P0.05)。靶向下调CTHRC1表达后,SKOV3/DDP-sh CTHRC1细胞的增殖能力无明显变化,但顺铂的IC_(50)显著降低(P0.01),Akt、STAT3磷酸化水平受到抑制,Bcl-2表达水平降低(P0.05)。结论:CTHRC1可能通过Akt、STAT3信号通路,调节抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,继而影响卵巢癌细胞对顺铂的敏感度。     

核苷酸切除修复与卵巢癌顺铂耐药

DNA损伤修复能力增强是导致卵巢癌顺铂耐药的主要原因之一,由铂-DNA加合物引起的DNA损伤修复主要通过核苷酸切除修复途径,该途径涉及多种蛋白,包括损伤识别、切开、切除、修复合成和DNA连接等5个步骤.大量基础和临床研究表明核苷酸切除修复基因表达水平的增加与卵巢癌顺铂耐药相关联.应用基因治疗、化疗增效剂或联合化疗抑制肿瘤细胞的DNA修复能力将增加卵巢癌患者顺铂敏感性.     

顺铂联合紫花牡荆素抑制人卵巢癌细胞增殖的研究

目的:探讨顺铂(DDP)是否具有敏化紫花牡荆素(CAS)抑制体外培养人卵巢癌SKOV3细胞生长增殖的作用。方法:体外培养SKOV3细胞;用MTT和平皿克隆法检测顺铂、CAS在亚细胞毒性浓度下,以及两者联合对SKOV3细胞生长增殖的影响;用FCM检测CAS对SKOV3细胞周期的影响;Western blot分析p21和cyclin B1蛋白表达的变化。结果:顺铂具有敏化CAS抑制人卵巢癌SKOV3细胞增殖活性的作用;与亚细胞毒性浓度的顺铂和CAS相比,顺铂和CAS联合作用SKOV3细胞集落形成率明显下降(P<0.01);经亚细胞毒性浓度的顺铂和CAS联合作用48h后SKOV3被阻滞于G2/M期,同时cyclin B1蛋白表达降低,p21蛋白表达增高。结论:顺铂具有敏化CAS抑制体外培养人卵巢癌SKOV3细胞生长增殖的作用,其机制可能是通过降低cyclin B1表达、活化p21实现的。     

Dicer1在卵巢癌间质成纤维细胞中调控DNA损伤修复相关基因

目的:检测Dicer1在卵巢癌间质肿瘤相关成纤维细胞中的表达情况,探讨其对DNA双键断裂损伤(DSB)修复相关基因的影响。方法:应用基因集合富集分析(GSEA)方法分析卵巢癌间质和正常卵巢间质基因表达公共数据库GSE40595,探索Dicer1对DSB修复相关通路及关键基因的调控作用,并筛选出相关差异基因。应用重组人转化生长因子β1(h TGFβ1)细胞因子诱导成纤维细胞系MRC5细胞活化成为肿瘤相关成纤维细胞(CAFs),即MRC5-CAFs。以靶向Dicer1基因的siRNA转染MRC5-CAFs,下调其Dicer1表达水平。qRT-PCR、Western blot法分别检测Dicer1及分析所得相关基因,如XRCC6、TP53BP1、H2AFX、BRCA1、ATR、RAD51 mRNA水平及Dicer1和DSB损伤修复关键基因γ-H2AX(磷酸化H2AX)、RAD51蛋白水平。荧光共聚焦检测细胞核蛋白γ-H2AX表达;采用CCK8试验检测细胞活性。结果:GSEA分析结果显示,Dicer1表达水平与DSB(NES=1.7942109,FDRq=0.0067545176)及DNA损伤修复(NES=2.4433048,FDRq=0)显著正相关,进一步通过相关分析筛选出在上述通路中与Dicer1表达正相关的显著基因集。沉默MRC5-CAFs细胞中Dicer1表达后,DSB相关基因,如XRCC6、TP53BP1、H2AFX及损伤修复相关基因BRCA1、ATR、RAD51均较对照组显著下降,与GSEA分析结果一致。荧光共聚焦显微镜检测到沉默Dicer1 MRC5-CAFs细胞内聚集较少的DSB。CCK8试验结果显示,MRC5-CAFs细胞在20μmol/L顺铂作用下,Dicer1-si组不同时间梯度的细胞活性率均低于NC-si组。结论:Dicer1在卵巢癌间质成纤维细胞中正向调控DNA损伤修复相关基因,抑制Dicer1表达后其对顺铂敏感性显著增加。     

带hTERT启动子的腺病毒干扰ERCC1基因表达逆转卵巢癌顺铂耐药的研究

目的:研究带hTERT启动子的腺病毒通过干扰ERCC1基因表达而逆转卵巢癌顺铂耐药的作用。方法:以1、10、50、80感染复数(MOI)的重组腺病毒分别感染卵巢癌细胞株SKOV3、卵巢癌细胞顺铂耐药株SKOV3/DDP和脐静脉内皮细胞ECV304,同时以相同滴度的空载体腺病毒感染细胞,将感染前的细胞作为对照,以RT-PCR方法检测重组腺病毒转染细胞中ERCC1 mRNA表达,以Western blot方法检测重组腺病毒转染细胞中ERCC1蛋白表达,并以MTT法检测肿瘤细胞对顺铂化疗敏感性的影响。结果:(1)在SKOV3及SKOV3/DDP细胞中,不同剂量Ad-hTERT-ERCC1 shRNA转染组与转染前相比,ERCC1 mRNA及ERCC1蛋白表达水平下调,差异有统计学意义(P<0.01)。而在空载体腺病毒转染组及ECV304细胞中,ERCC1 mRNA及ERCC1蛋白表达水平无改变,差异无统计学意义(P>0.05);(2)重组腺病毒转染后,SKOV3/DDP细胞对顺铂的敏感性显著增加(P<0.01),并呈剂量依赖性。结论:带hTERT启动子的腺病毒能够通过干扰ER-CC1基因表达而逆转卵巢癌顺铂耐药,并且具有剂量依赖性。     

同源重组修复基因在卵巢癌中的研究进展

卵巢癌是女性生殖器常见的三大恶性肿瘤之一,由于卵巢位于盆腔深部,起病隐匿,约70%～75%的患者出现症状时已达晚期,严重威胁着女性的健康。目前已知的大多数卵巢癌易感基因通过同源重组在修复DNA双链断裂中发挥作用,乳腺癌易感基因1（BRCA1）和BRCA2是卵巢癌最常见的两大基因,是双链DNA断裂同源重组修复过程中的关键因子,以其为核心组成的BRCA肿瘤抑制因子网络中多种致病性突变均可损伤基因组的完整性和稳定性,增加卵巢癌的易感性。多项研究表明同源重组相关基因或蛋白的表达与肿瘤对放疗及基因药物的敏感性相关,并可成为生物标记物被用于肿瘤的个体化治疗。现对同源重组修复通路中与卵巢癌关联最密切的几种重要基因突变与卵巢癌的关系进行初步探讨,为卵巢癌的筛查和早期预防奠定临床基础。     

TWEAK激活自噬增强上皮性卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/DDP顺铂敏感性的研究

目的:观察TWEAK对上皮性卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/DDP的顺铂(DDP)耐药性的影响,并初步探讨其机制。方法:CCK8法测定不同浓度TWEAK刺激后A2780/DDP的顺铂半数细胞致死量(IC50)。Western blot法检测TWEAK刺激A2780/DDP后Beclin-1、微管结合蛋白轻链3(LC3)及成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14(Fn14)的表达水平。激光共聚焦显微镜检测绿色荧光-LC3蛋白(GFP-LC3)在A2780/DDP细胞内的分布情况。用TWEAK刺激敲除Fn14表达的A2780/DDP细胞,Western blot法检测Beclin-1、LC3的表达。结果:CCK8检测结果显示,10、100ng/mlTWEAK组的顺铂IC50分别为(31.940±0.118)μg/ml、(28.769±0.090)μg/ml,均显著低于0ng/ml组(36.358±0.106)μg/ml(P均<0.05)。Western blot法结果显示,TWEAK可呈剂量和时间依赖性诱导Beclin-1、LC3及Fn14表达上调,而特异性敲除Fn14表达后,Beclin-1、LC3表达明显下调。激光共聚焦显微镜检测结果显示,TWEAK可诱导GFP-LC3致密斑形成。结论:TWEAK可增强人卵巢癌细胞耐药株A2780/DDP的顺铂敏感性;呈剂量和时间依赖性激活A2780/DDP的自噬活性,且主要通过与其受体Fn14结合介导。     

同源重组修复基因在卵巢癌中的研究进展

卵巢癌是女性生殖器常见的三大恶性肿瘤之一,由于卵巢位于盆腔深部,起病隐匿,约70%～75%的患者出现症状时已达晚期,严重威胁着女性的健康。目前已知的大多数卵巢癌易感基因通过同源重组在修复DNA双链断裂中发挥作用,乳腺癌易感基因1(BRCA1)和BRCA2是卵巢癌最常见的两大基因,是双链DNA断裂同源重组修复过程中的关键因子,以其为核心组成的BRCA肿瘤抑制因子网络中多种致病性突变均可损伤基因组的完整性和稳定性,增加卵巢癌的易感性。多项研究表明同源重组相关基因或蛋白的表达与肿瘤对放疗及基因药物的敏感性相关,并可成为生物标记物被用于肿瘤的个体化治疗。现对同源重组修复通路中与卵巢癌关联最密切的几种重要基因突变与卵巢癌的关系进行初步探讨,为卵巢癌的筛查和早期预防奠定临床基础。     

微小RNA－16参与上皮性卵巢癌细胞周期调控的实验研究

目的：研究微小RNA－16（miR－16）调控靶基因CCNDl及其蛋白表达产物一细胞周期相关蛋白DI（cyclinDl）在卵巢肿瘤细胞系SKOV3及其耐药株SKOV3／DDP中的表达,并初步探讨其逆转卵巢癌耐药的可能机制。方法：脂质体Lipofectamine2000介导miR－16成体模拟物（mimics）及其阴性对照片段（NC）成功转染人卵巢癌细胞顺铂耐药株SKOV3／DDP;流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化;Western blot法检测转染前后cy—clinDl表达的变化。结果：（1）成功转染miR－16后,SKOV3／DDP细胞系G1期细胞所占比例显著升高（P〈0．01）;（2）SKOV3／DDP细胞的cyclinDl蛋白相对表达量显著高于SK—OV3细胞：转染miR－16后,cyclinDl相对表达量显著下降（P〈0．01）。结论：miR－16很可能通过下调靶基因CCNDl及cyclinDl蛋白的表达,阻止细胞由C,期向S期转换,抑制肿瘤细胞无限增殖与生长。     

丙戊酸钠协同顺铂对HO8910细胞杀伤作用机制研究

目的:探讨丙戊酸钠(VPA)协同顺铂(DDP)对人卵巢癌HO8910细胞的杀伤作用及机制。方法:以1μg/m l DDP联合3mmol/L VPA处理细胞,MTT法检测细胞生长抑制率;光镜下观察药物作用下各组细胞形态学的改变;流式细胞术检测细胞周期阻滞情况;RT-PCR法检测p53、p21 mRNA水平表达的改变;W estern blot法检测Ac-H3、p53、p21、Cyclin D1蛋白水平表达的改变。结果:(1)VPA能明显抑制HO8910细胞生长,且呈剂量和时间依赖性,VPA+DDP处理组抑制率高于DDP处理组,组间差异有统计学意义(P<0.05);(2)光镜下观察细胞形态,可见VPA处理组细胞体积缩小呈长梭型,胞膜皱缩,贴壁不良,VPA+DDP组改变更明显;(3)VPA阻滞卵巢癌HO8910细胞周期于G0/G1期,VPA+DDP组S期细胞明显减少;(4)VPA及VPA联合DDP均能够明显提高卵巢癌HO8910细胞组蛋白H3的乙酰化水平,上调p53、p21 mRNA及蛋白表达水平,降低CyclinD1蛋白的表达水平,组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论:VPA能够协同DDP杀伤卵巢癌细胞HO8910;其作用机制可能与VPA提高组蛋白乙酰化水平,上调p53、p21基因表达和下调Cyclin D1表达,引发细胞周期阻滞有关。     

DNA repair in primordial follicle oocytes following cisplatin treatment

Purpose

Genotoxic chemotherapy and radiotherapy can cause DNA double stranded breaks (DSBs) in primordial follicle (PMF) oocytes, which then undergo apoptosis. The development of effective new fertility preservation agents has been hampered, in part, by a limited understanding of DNA repair in PMF oocytes. This study investigated the induction of classical DSB repair pathways in the follicles of wild type (WT) and apoptosis-deficient Puma^-/- mice in response to DSBs caused by the chemotherapy agent cisplatin.

Methods

Adult C57BL/6 WT and Puma^-/- mice were injected i.p. with saline or cisplatin (5 mg/kg); ovaries were harvested at 8 or 24 h. Follicles were counted, and H2A histone family member (γH2AX) immunofluorescence used to demonstrate DSBs. DNA repair protein RAD51 homolog 1 (RAD51) and DNA-dependent protein kinase, catalytic subunit (DNA-PKcs) immunofluorescence were used to identify DNA repair pathways utilised.

Results

Puma^-/- mice retained 100% of follicles 24 h after cisplatin treatment. Eight hours post-treatment, γH2AX immunofluorescence showed DSBs across follicular stages in Puma^-/- mice; staining returned to control levels in PMFs within 5 days, suggesting repair of PMF oocytes in this window. RAD51 immunofluorescence eight hours post-cisplatin was positive in damaged cell types in both WT and Puma^-/- mice, demonstrating induction of the homologous recombination pathway. In contrast, DNA-PKcs staining were rarely observed in PMFs, indicating non-homologous end joining plays an insignificant role.

Conclusion

PMF oocytes are able to conduct high-fidelity repair of DNA damage accumulated during chemotherapy. Therefore, apoptosis inhibition presents a viable strategy for fertility preservation in women undergoing treatment.

     

1,25二羟维生素D3联合顺铂对子宫内膜癌HEC-1-A细胞增殖及Skp2/p27表达的影响

目的:探讨1,25二羟维生素D3[1,25(OH)2D3]与顺铂(DDP)联合抑制人子宫内膜癌HEC-1-A细胞的增殖,测定二者作用下S期激酶相关蛋白(Skp2)、抑癌基因p27蛋白的表达。方法:用CCK-8法测定1,25(OH)2D3、DDP及二者联合处理后细胞增殖情况,用流式细胞仪分析细胞周期,用W estern blot检测Skp2及p27蛋白表达的变化。结果:与对照组相比,1,25(OH)2D3、DDP作用下细胞吸光度(OD)值减少,细胞增殖受到抑制(P0.01),二者联用时此作用明显增强;1,25(OH)2D3、DDP均能增加G0/G1期细胞比例,降低S、G2/M期细胞比例,从而降低细胞增殖指数(P0.01);二者作用下Skp2表达减少,p27蛋白表达增多。结论:1,25(OH)2D3有增强DDP抗肿瘤的作用,二者均可能通过下调Skp2、上调p27蛋白表达,抑制癌细胞增殖。     

ERCC1基因与卵巢上皮癌细胞铂类耐药相关性探讨

目的 检测切除修复交叉互补1（ERCC1）基因在人卵巢上皮癌顺铂(DDP)耐药细胞株SKOV3／DDP及其亲本细胞株SKOV3中的表达,探讨ERCC1基因在卵巢上皮癌顺铂耐药中的意义以及有效沉默ERCC1基因能否有效逆转SKOV3／DDP细胞对DDP耐药。方法 于2013-2014年在南方医科大学采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Western印迹法检测 ERCC1 mRNA和蛋白在SKOV3／DDP及SKOV3细胞中的表达。人工构建3个靶向沉默ERCC1基因的短发夹状RNA(shRNA)质粒表达载体,慢病毒载体法转染至SKOV3／DDP细胞,RT-PCR和Western印迹法检测ERCC1基因水平并挑选沉默效果最佳的表达载体。RT-PCR和Western印迹法检测稳定转染后SKOV3／DDP细胞中ERCC1基因的表达,CCK-8法检测转染细胞对DDP的耐药性。结果 SKOV3／DDP细胞中ERCC1 mRNA和蛋白的表达量明显高于SKOV3,差异有统计学意义(P<0.01)。稳定转染ERCC1 shRNA后的SKOV3／DDP细胞,ERCC1的mRNA及蛋白的表达量明显下降,差异有统计学意义(P<0.01)。细胞活性检测提示特异性沉默ERCC1基因能增加SKOV3/DDP 细胞对顺铂的敏感性(P<0.05)。结论 ERCC1基因在SKOV3／DDP细胞中的表达明显升高,有效沉默ERCC1 基因能有效逆转SKOV3/DDP细胞对DDP耐药,增加卵巢上皮癌DDP耐药细胞对DDP的敏感性,为卵巢上皮癌耐药的治疗提供新靶点。     

Caspase-3活性改变与人卵巢癌细胞系COC1/DDP耐药的关系

目的 探讨人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP中抗凋亡蛋白Bcl-XL、Bcl-2、细胞色素C的表达及半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)活性与人卵巢癌顺铂耐药的关系。方法:采用RT-PCR和Western Blot分析人卵巢癌顺铂敏感细胞株COC1和顺铂耐药株COC1/DDP中Bcl-XL、Bcl-2、细胞色素C的表达和caspase-3的活性。并用流式细胞术测定顺铂作用后COC1和COC1/DDP细胞株的凋亡率。结果:在COC1/DDP细胞中,Bcl-XL和Bcl-2的表达明显高于COC1细胞;顺铂作用后,在COC1/DDP细胞株中细胞色素C的表达明显减少,caspase-3活性明显降低(P<0.05);其凋亡率也明显低于COC1细胞株(P<0.05)。结论:人卵巢癌细胞株COC1/DDP对顺铂产生耐药可能与细胞内Bcl-XL、Bcl-2过度表达抑制了线粒体细胞色素C的释放及caspase-3活性有关。     

神经酰胺增强卵巢癌顺铂敏感性的体外研究

目的:探讨神经酰胺增强卵巢癌顺铂敏感性的作用及机制,为筛选有效的卵巢癌顺铂耐药逆转剂提供实验依据。方法:本研究采用MTT法测定不同剂量的C6-神经酰胺(Ceramide C6)(5、10、20、40μmol/L)对卵巢癌顺铂化疗的增敏作用,以RT-PCR、Westernblot法检测Ceramide C6对肿瘤细胞Bcl-2 mRNA及其蛋白表达的影响,应用流式细胞技术观察Ceramide C6对肿瘤细胞凋亡的影响。结果:Ceramide C6对SKOV3、SKOV3/DDP细胞生长有抑制作用,与DDP联合应用时可增强DDP敏感性。SKOV3细胞中,与对照组相比,不同浓度Ceramide C6使顺铂敏感性分别增加了7.23%、20.14%、45.02%、57.75%。SKOV3/DDP细胞中,顺铂敏感性分别增加了23.08%、24.57%、45.86%、65.78%。随Ceramide C6浓度增加,SKOV3和SKOV3/DDP细胞中Bcl-2 mRNA及蛋白表达逐渐减低,差异有统计学意义(F=41.780,P=0.000;F=223.258,P=0.000;F=98.306,P=0.000;F=224.687,P=0.000)。Ceramide C6可增加SKOV3、SKOV3/DDP细胞凋亡率,差异有统计学意义(F=135.625,P=0.000;F=224.906,P=0.000)。结论:神经酰胺可能通过抑制肿瘤细胞Bcl-2 mRNA及其蛋白表达,诱导肿瘤细胞凋亡途径,增强顺铂对卵巢癌SKOV3和SKOV3/DDP细胞体外生长的抑制作用,在一定程度上逆转了卵巢癌顺铂耐药。     

米非司酮对卵巢上皮性癌耐药细胞DNA修复基因表达和顺铂敏感性的影响

目的 研究米非司酮对卵巢上皮性癌(卵巢癌)耐药细胞DNA修复基因表达的调控,及对顺铂的增敏作用.方法 应用四甲基偶氮唑蓝比色法检测2.5、5.0、10.0 μmol/L米非司酮作用后卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP的顺铂半数抑制浓度(IC50);用RT-PCR技术、流式细胞仪检测米非司酮联合顺铂作用后COC1/DDP细胞ERCC1、BRCA1、hMLH1 mRNA的表达水平及细胞周期和凋亡率的变化;建立COC1/DDP细胞裸鼠皮下移植瘤模型,分为顺铂组、米非司酮组、联合组和对照组,观察米非司酮在裸鼠体内对顺铂的增敏作用.结果 2.5、5.0、10.0 μmol/L米非司酮分别使COC1/DDP细胞对顺铂的IC50下降为(3.18±0.46)、(1.95±0.14)和(0.64±0.18)μg/ml,2.5 μmol/L米非司酮联合顺铂作用后的IC50与单用顺铂者[(3.71±0.38)μg/ml]比较,差异无统计学意义(P=0.076),其他浓度之间两两比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).米非司酮下调ERCC1、BRCA1、hMLH1 mRNA表达水平,3种基因mRNA的相对表达量随米非司酮浓度的升高均呈下降趋势.2.5、5.0、10.0 μmol/L米非司酮联合顺铂对COC1/DDP细胞作用后,G0/G1,期细胞比例升高(分别为51.68%、53.74%、55.08%).2.5、5.0、10.0 μmol/L米非司酮与10 μg/ml顺铂联合作用使细胞凋亡率分别增加为5.11%、9.13%和12.24%.米非司酮联合顺铂治疗裸鼠皮下移植瘤的生长抑制率为70.1%,与顺铂组、米非司酮组(分别为22.5%、6.5%)比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 米非司酮通过下调ERCC1、BRCA1、hMLH1基因的表达及阻滞G0/G1期细胞、增加细胞凋亡率来增强顺铂对卵巢癌细胞的抗肿瘤敏感性.     

子宫内膜癌顺铂耐药细胞株的建立和鉴定及耐药机制研究

目的 建立子宫内膜癌顺铂耐药细胞株ISH/DDP,鉴定其生物学特性,并探讨其顺铂耐药的机制.方法 采用顺铂浓度逐步递增联合大剂量顺铂冲击方法,在体外连续诱导、培养子宫内膜癌细胞株Ishikawa细胞,建立子宫内膜癌顺铂耐药细胞株ISH/DDP.非放射性细胞增殖法(MTS法)测定ISH/DDP细胞对顺铂的耐药指数;绘制细胞生长曲线,计算细胞群体倍增时间;流式细胞术检测ISH/DDP细胞的细胞周期比例;免疫细胞化学法检测ISH/DDP细胞中耐药蛋白--乳腺癌耐药蛋白(BCRP)、P糖蛋白(P-gp)以及谷胱甘肽S转移酶π(GST-π)蛋白的表达水平,以综合积分表示.结果 Ishikawa细胞在体外采用顺铂浓度逐步递增联合大剂量顺铂冲击方法 连续诱导、培养,历时10个月,成功建立了子宫内膜癌顺铂耐药细胞株ISH/DDP,其耐药指数为3.77.Ishikawa细胞和ISH/DDP细胞的群体倍增时间分别为34.1 h和40.4 b,两者比较,差异有统计学意义(P<0.05).与Ishikawa细胞相比,ISH/DDP细胞的S期细胞比例[分别为(44.2±6.1)%和(55.3±8.4)%]增加,G2/M期细胞比例[分别为(11.9±0.7)%和(5.7±2.4)%]减少,差异均有统计学意义(P<0.05);G0/G1期细胞比例[分别为(44.3±5.7)%和(39.0±10.7)%]减少,但差异无统计学意义(P>0.05).ISH/DDP细胞中BCRP蛋白的表达水平为(16.3±2.0)分,高于Ishikawa细胞的(13.4±1.5)分,差异有统计学意义(P<0.05);而Ishikawa和ISH/DDP细胞中P-gp蛋白的表达水平分别为(16.1±1.0)和(15.5±1.2)分,GST-π蛋白的表达水平分别为(14.9±1.1)和(15.2±1.9)分,分别比较,差异均无统计学意义(P>0.05).结论 ISH/DDP细胞具有耐药表型及耐药细胞的生物学特性;其耐药机制可能与细胞中BCRP蛋白的过度表达相关.

Abstract：

Objective To establish the cisplatin(DDP)-resistant cell line from human endometrial cancer cell line Ishikawa and to investigate its resistant mechanism to DDP. Methods A resistant endometrial cancer cell line ISH/DDP was established by gradually increasing dose of cisplatin and high-dose stimulation. The resistant index was estimated by 3-(4,5-dimethylthiazol-zyl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,inner salt (MTS) assay. Cell growth curve, doubling time and cell cycle phase distribution were measured; drug-resistant protein of breast cancer resistance protein (BCRP),P-glycoprotein (P-gp) and glutathione-S-transferase-π (GST-π) were examined by immuocytochemistry. Results The DDP-resistant cell line ISH/DDP was established with the resistant index of 3. 77. The proliferation of ISH/DDP got slow, doubling time prolonged, which were 40. 1 hours, while it was 34. 1 hours in Ishikawa (P<0.05); and the cell number of G0/G1 phase [(44. 3 ±5. 7)% and (39. 0 ± 10. 7)% ,P >0. 05] and G2/M phase [(11.9 ±0.7)% and (5. 7 ±2. 4)% ,P <0. 05] decreased, while S-phase [(44. 2 ±6.1)% and (55. 3 ± 8. 4) % , P < 0. 05] increased compared with parent cells. The comprehensive score of the expression of BCRP in ISH/DDP was 16. 3 ± 2. 0, while it was 13.4 ± 1. 5 in Ishikawa (P < 0. 05). The score of the expression of P-gp in ISH/DDP and Ishikawa were 15. 5 ± 1. 2 and 16. 1 ± 1. 0 (P > 0. 05) ,respectively. The score of the expression of GST-π in ISH/DDP and Ishikawa were 15. 2 ± 1. 9 and 14. 9 ± 1.1 (P > 0. 05) . Conclusion ISH/DDP cell line showed a typical resistant phenotype and biological characteristics, which may be accounted for high BCRP expression.     

Fn14活化凋亡增强人上皮性卵巢癌细胞顺铂敏感度的研究

目的：探讨成纤维细胞生长诱导因子14（Fn14）对人上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer,EOC）细胞的顺铂（DDP）敏感度的影响及其可能机制。方法：蛋白质印迹（Western blotting）法检测EOC细胞株SKOV3、CAOV3、OVCAR3、ES2、3AO、A2780、A2780/DDP中Fn14蛋白的表达情况,选择低表达Fn14蛋白的细胞株转染Fn14过表达质粒后,观察转染后细胞株的Fn14蛋白、凋亡相关蛋白caspase-3、cleaved caspase-3和Bcl-2的表达情况。CCK-8法检测细胞增殖能力及DDP半数抑制浓度（IC50）。流式细胞学检测细胞凋亡。结果：人EOC细胞株SKOV3、CAOV3、OVCAR3、ES2、3AO、A2780、A2780/DDP中,A2780/DDP细胞株Fn14蛋白表达水平最低。Fn14过表达质粒转染A2780/DDP细胞后,细胞内Fn14表达水平上调（P＜0.05）;细胞的增殖能力无变化,但细胞DDP的IC50显著降低（P＜0.05）。流式细胞学检测结果进一步显示Fn14可以增加DDP诱导的A2780/DDP凋亡细胞数目。同时,Western blotting结果显示促凋亡蛋白caspase-3表达升高,抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显下降（P＜0.05）。结论：Fn14可能活化凋亡通路进而提高A2780/DDP细胞对DDP的敏感度。     

RNA干扰技术抑制切除修复交叉互补基因1对卵巢上皮性癌细胞顺铂敏感性的影响

目的探讨RNA干扰技术抑制切除修复交叉互补基因(ERCC)1对卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞顺铂敏感性的影响。方法体外设计、合成针对ERCC1的小分子干扰RNA(siRNA),并转染卵巢癌细胞ES2,应用RT PCR、蛋白印迹法(westernblot)和免疫组化链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶(SP)连接法检测转染siRNA后ES2细胞ERCC1基因和蛋白的表达变化,应用四甲基偶氮唑蓝比色法检测干扰ERCC1后ES2细胞对顺铂敏感性的变化。结果转染针对ERCC1的siRNA后24、48、72h,ES2细胞ERCC1基因和蛋白的表达水平下降;转染ERCC1siRNA后,ES2细胞对顺铂的半数抑制量从(10.475±1.713)μg/ml提高到(0.194±0.021)μg/ml,ES2细胞对顺铂的敏感性增加了53.88倍。结论RNA干扰技术抑制ERCC1能增加卵巢癌细胞ES2对顺铂的敏感性。