重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-hIL-2的构建及病毒滴度测定

目的:构建重组腺病毒载体pAdBM5-GFP-hIL-2,并测定病毒滴度.方法:从Jurkat细胞中提取mRNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增hIL-2基因全编码区序列.将测序正确的片段用Bgl II和Pme I双酶切定向插入到pAdBM5-GFP腺病毒载体中.通过磷酸钙共沉淀法将线性化重组质粒和腺病毒骨架共转染HEK293A细胞,扩增纯化重组腺病毒,TCID50法测定重组腺病毒滴度.结果:成功构建出表达hIL-2基因的重组腺病毒载体(pAdBM5-GFP-hIL-2),获得了高滴度表达hIL-2基因的重组腺病毒.结论:重组腺病毒表达载体(pAdBM5-GFP-hIL-2)的成功构建及重组腺病毒的获得有利于进一步开展肝癌的转基因治疗研究.     

人IL-2基因克隆及其重组腺病毒载体的构建

目的克隆人白细胞介素2基因（hIL-2），构建其重组穿梭载体pAdBM5-GFP—hIL-2。方法：应用PHA体外刺激培养的Jurkat细胞以促进hIL-2基因表达．设计特异性引物，应用RT—PCR法扩增hIL-2基因。将测序正确的片段用PmeⅠ和BglⅡ双酶切定向插入到pAdBM5-GFP穿梭载体中，酶切鉴定。结果：RT—PCR方法，成功克隆了hIL-2基因，并构建出pAdBM5-GFP-hIL-2真核表达载体．克隆的hIL-2序列全长528bp，含462个碱基开放读框．结论；构建含人白细胞介素2基因片段的重组腺病毒表达载体（pAdBM5-GFP—hIL-2），为下一步扩增重组腺病毒开展肝癌的免疫与基因治疗研究奠定基础．     

双表达人Arid5a及报告基因eGFP的重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建双表达人Arid5a(hArid5a)及报告基因eGFP的重组腺病毒载体,为研究Arid5a的生物功能打基础。方法:通过常规分子克隆方法及基因重组技术获得双表达hArid5a及eGFP的腺病毒载体。通过荧光显微镜观察eGFP的表达来确定病毒包装情况,Western blot检测Arid5a蛋白表达。结果:将hArid5a克隆到腺病毒穿梭载体中,获得pAd5-CMV-hArid5a载体,然后将Pac I线性化的pAd5-CMV-hArid5a与Pac I线性化的携带报告基因eGFP的病毒骨架通过基因重组,最终获得携带有报告基因eGFP及人Arid5a的腺病毒载体Ad5 CMV-hArid5a/eGFP。将纯化获得的腺病毒载体Ad5 CMV-hArid5a/eGFP感染U87细胞后,通过荧光显微镜观察eGFP的表达;通过Western blot检测到感染细胞中hArid5a表达。结论:成功构建了携带报告基因eGFP的hArid5a的腺病毒表达载体,为进一步研究hArid5a的生物功能奠定了基础。     

CRT180基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建表达CRT180基因重组的腺病毒载体,为肿瘤的基因治疗奠定实验基础。方法采用腺病毒表达系统（Vira Power^TM Adenoviral Expression System）构建重组腺病毒表达载体。首先利用RT-PCR的方法在人肺腺癌细胞系A549细胞中扩增CRT180基因,以连接、转化等方法克隆入载体pENTR／D—TOPO以获得重组的入门克隆,经测序及PCR鉴定正确后,用重组酶（LRClonase^TMⅡ Enzyme Mix）进行入门克隆与腺病毒表达载体（pAd—CMV／V5-DEST）间的重组反应,以获得表达克隆（rAd．CRT180）质粒。重组表达克隆鉴定后,用限制性内切酶PacⅠ是使之线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒。用极限稀释法检测病毒滴度用Western Blot法检测rAd．CRT180载体是否能正确表达CRT180蛋白。结果用RT-PCR的方法扩增到CRT180基因;重组入门和表达克隆经酶切和PCR鉴定构建正确,重组表达克隆转染HEK293A细胞获得病毒原液并扩增后测定病毒滴度为1．8×10^11pfu／mL,且这个病毒能正确表达CRT180蛋白。结论成功构建了CRT180基因的重组腺病毒载体,可为此重组载体用于肿瘤基因治疗提供实验依据。     

白介素12重组腺病毒载体的构建及其抗肿瘤作用初步观察

[目的]构建携带小鼠白细胞介素12腺病毒载体(AdCMVmIL-12),并观察其对H22肿瘤的抑瘤效果。[方法]构建重组质粒pdlE1SP1BmIL-12,并用该质粒与质粒pJM17共转染293细胞后包装而成AdCMVmIL-12,并进行酶切法鉴定。同时制备肿瘤动物,通过肿瘤内局部注射AdCMVmIL-12,观察其抗肿瘤作用。[结果]酶切鉴定显示构建正确,其病毒滴度为1.3×109pfu/ml;当病毒滴度为100MOI时,mIL-12浓度达到3417ng/1×106细胞/24h。动物实验表明,注射AdCMVmIL-12的小鼠,肿瘤体积明显小于对照组(P<0.01),生存期显著延长。[结论]构建AdCMVmIL-12成功,肿瘤内局部注射可发挥抗肿瘤作用。     

快速构建腺病毒载体的新方法

目前腺病毒载体已成为重要的基因治疗载体,随着分子生物学技术的迅速发展,构建重组腺病毒的方法有了很大改进。本文主要介绍3种快速构建腺病毒载体的新方法：一是细菌内同源重组法构建重组腺病毒;二是细胞外连接法构建重组腺病毒,三是在黏粒中构建重组腺病毒。3种构建腺病毒载体的新方法相比于传统方法,具有简便,快速,实验周期短的优点。     

IL-7和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建

目的:构建白细胞介素7(IL-7)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)共表达的重组腺病毒载体,为进一步感染干细胞奠定基础。方法:将目的基因IL-7克隆到含有报告基因EGFP的穿梭质粒中,然后再将构建的重组穿梭质粒转移至pAdxsi载体中,构建重组腺病毒载体质粒,继而在H293细胞中扩增,纯化后测定病毒滴度。结果:pShuttle-EGFP-mIL7重组穿梭质粒经酶切鉴定得到0.5kb和5.1kb 2条带;pAdxsi-EGFP-mIL7重组腺病毒载体质粒经酶切鉴定得到14K、11.8K、3.1kb、2.66kb、2.47K、1.45K、0.6K 7条带;TCID50法测定纯化后的病毒滴度为2×1010pfu/ml。结论:pAdxsi-EGFP-mIL7重组腺病毒载体构建成功。     

GM-CSF基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）基因的重组腺病毒载体，为进一步研究GM-CSF基因在肿瘤基因治疗中的应用提供实验基础。方法：采用PCR方法，从重组质粒pcDNA3．1-GM-CSF扩增出GM-CSF基因片段，通过穿梭质粒pShuttle，将带有CMV启动子的目的片段克隆入Adeno-X腺病毒DNA中，获得重组腺病毒DNA，通过脂质体转染HEK293细胞，经包装扩增后，获得重组腺病毒Adeno-X-GM-CSF，PCR鉴定，ELISA法检测表达产物。结果：含GM-CSF基因的重组腺病毒Adeno-X-GM-CSF构建成功，经PCR鉴定和DNA测序等证实了其正确性，重组腺病毒上清液中GM-CSF表达量达26ng／mL。结论：含GM-CSF基因的重组腺病毒构建成功。     

转基因逆转椎间盘退变重组腺病毒载体Ad/CMV-hTGFβ1的构建

目的：构建一个高效的重组腺病毒载体Ad／CMV—hTGFβl，用于进一步的基因转移逆转椎间盘退变的实验研究。方法：应用一种新的重组腺病毒构建系统来构建腺病毒载体。首先将hTGFβ1的cD—NA亚克隆到穿梭质粒pShuttle—CMV上。重组穿梭质粒PShutte—CMV—hTGFβ经PmeI酶切线性化后，与超螺旋的病毒质粒pAdEasy—1共转染大肠杆菌BJ5183。两种质粒在BJ5183中进行同源重组，重组病毒质粒pAd／CMV—hTGFβl经卡那霉素平板筛选获得。经酶切分析鉴定后，重组病毒质粒用PacI酶切线化。线化的病毒质粒经脂质体转染293细胞(包装细胞系)，于2周内收集重组病毒。结果:重组腺病毒质粒经BamHI，PacI酶切鉴定，在0．8％的琼脂糖凝胶电泳中出现了诊断性片段；感染的293细胞出现了明显的细胞病变效应(CPE)；PCR产物电泳证实了重组病毒的存在；免疫组织化学染色证实了hTGF—β1在293细胞中的表达。结论：重组腺病毒载体Ad／CMV—hTGFβl的获得以及目的基因表达的验证使下一步的逆转椎间盘退变的实验研究成为可能。     

IL-7和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体的构建

目的：构建白细胞介素7（IL-7）和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）共表达的重组腺病毒载体,为进一步感染干细胞奠定基础。方法：将目的基因IL-7克隆到含有报告基因EGFP的穿梭质粒中,然后再将构建的重组穿梭质粒转移至pAdxsi载体中,构建重组腺病毒载体质粒,继而在H293细胞中扩增,纯化后测定病毒滴度。结果：pShuttle-EGFP-mIL7重组穿梭质粒经酶切鉴定得到0.5kb和5.1kb 2条带;pAdxsi-EGFP-mIL7重组腺病毒载体质粒经酶切鉴定得到14K、11.8K、3.1kb、2.66kb、2.47K、1.45K、0.6K 7条带;TCID50法测定纯化后的病毒滴度为2×10^10pfu/ml。结论：pAdxsi-EGFP-mIL7重组腺病毒载体构建成功。     

Wnt5a在肿瘤研究中的进展

近年来研究发现WnL5a与肿瘤发生、发展关系密切.根据细胞类型不同,Wnt5a既可以起到促癌作用,又可以起到抑癌作用,其信号级联反应复杂,受多种因子调节.     

Wnt5a在肿瘤研究中的进展

近年来研究发现WnL5a与肿瘤发生、发展关系密切.根据细胞类型不同,Wnt5a既可以起到促癌作用,又可以起到抑癌作用,其信号级联反应复杂,受多种因子调节.     

Wnt5a在肿瘤研究中的进展

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Wnt5a在肿瘤研究中的进展

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Wnt5a在肿瘤研究中的进展

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Wnt5a在肿瘤研究中的进展

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Wnt5a在肿瘤研究中的进展

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近年来研究发现WnL5a与肿瘤发生、发展关系密切.根据细胞类型不同,Wnt5a既可以起到促癌作用,又可以起到抑癌作用,其信号级联反应复杂,受多种因子调节.