PCR快速检测细菌16S rRNA基因的初步研究

目的：建立检测细菌16SrRNA基因的PCR方法。方法:以细菌16S rRNA基因为靶序列。利用计算机软件primer5．0，Bioedit设计2条引物-pml.,pm2并建立相应的PCR方法。采用该PCR方法扩增实验室保留菌株的16srRNA基因,以人类外周血白细胞基因组DNA、HBV—DNA阳性血清以及白色念珠菌为对照。检测该实验方法的特异性;采用倍比稀释的方法进行该实验方法的敏感性实验。结果：用引物pml，pm2对17个不同菌株进行PCR扩增。均得到371bp左右长度的DNA片段。特异性实验表明,此通用引物与人类基因组DNA、真菌及病毒无交叉反应。敏感性实验表明。用pml，pm2引物进行的PCR扩增可检测出20CFU／ml,结论：16S rRNA基因PCR检测方法具有特异、敏感、快速的特点。     

成年人前列腺组织细菌16S rRNA基因的检测

目的 探讨慢性前列腺炎的细菌学病因,为临床治疗提供帮助。方法前列腺检测标本取自140例猝死的器官捐献者,年龄20～35岁。取前列腺周围带组织,分成两块,一块作常规病理检查,另一块用聚合酶链反应检测细菌16S rRNA基因。结果32．9％（46／140）的组织病理呈慢性前列腺炎,均为轻度灶性炎症改变,其中间质炎42例,间质伴腺体周围炎3例,腺体周围炎1例。16S rDNA阳性率为19．3％（27／140）,其中前列腺炎标本阳性率为48．9％．（22／46）,非前列腺炎标本阳性率为5．3％（5／94）,前列腺炎标本阳性率高于非前列腺炎标本,差异有统计学意义（X^2=36．910,P〈0．001）。结论细菌感染可能是引起慢性前列腺炎的重要原因。     

16S-23S rRNA间区基因RFLP用于病原菌区分

[目的]探讨16S-23SrRNA间区基因RFLP用于临床常见病原茵区分的可能性。[方法]183株临床分离来的细菌经荧光PCR扩增后进行不完全限制性酶切,产物进行毛细管电泳。[结果]所有细菌的酶切产物经毛细管电泳后,不同细菌产生不同的RFLP谱图,互相之间能够明显区分。[结论]该方法可以将临床常见病原茵准确区分到种的程度,极有应用价值。     

聚合酶链反应检测细菌16S rRNA基因

根据细菌１６ＳｒＲＮＡ基因的高度保守性,设计合成所有细菌、革兰氏阳性细菌及革兰氏阴性细菌的共同引物,采用聚合酶链反应检测已知细菌１３株,三对引物分别扩增的阳性率为１００％,倍比稀释法能检出细菌的最低浓度为４ＣＦＵ·ｍｌ－１,同时检测临床样本４０份,阳性率为６７５％（２７／４０）,同期细菌培养阳性率为４５％（１８／４０）,二者比较差异有显著性（Ｐ＜０．０５）。结果提示聚合酶链反应检测细菌１６ＳｒＲＮＡ基因具有高度的特异性和敏感性。     

16S rRNA基因及16S～23S rRNA基因区间在临床细菌学检验中的应用

核糖体16S RNA(16S rRNA)为所有细菌所共有,其编码基因兼保守性和变异性于一身,素有细菌的"分子化石"之称.通过对16S rRNA基因保守区引物进行聚合酶链反应(PCR)扩增,可早期、快速判断细菌的存在与否,因此在临床细菌感染的检验中有较高的应用价值.本文就细菌16S rRNA基因的特征、在检测临床细菌感染中的应用,以及一种新方法--16S～23S rDNA 区间序列在分类及鉴别细菌的应用研究等作一综述.     

前列腺结石患者结石中纳米细菌的分离和16S rRNA基因的鉴定

目的 检测纳米细菌在前列腺结石中的分布情况,探讨其在前列腺结石发病中的作用.方法 采集前列腺结石患者的前列腺结石标本,分离培养纳米细菌,采用PCR法对纳米细菌16S rRNA基因进行扩增,电泳分析结果并测序.结果 将PCR得到的特异性片段的测序结果与已知纳米细菌16S rRNA序列进行比较,相似度为98%:分值=2 480 bits(1290),期望值=0.0;相似度=1387/1409(98%),缺失=4/1409(0%);链=正/正.结论 PCR法和测序可以作为纳米细菌16S rRNA基因的检测手段;前列腺结石患者的结石中存在着纳米细菌的感染.     

基于16S rRNA序列鉴定临床不常见细菌

目的以16S rRNA基因为靶序列,建立核糖体测序方法鉴定临床不常见细菌。方法利用通用引物聚合酶链反应(PCR)扩增细菌16S rRNA基因,对PCR产物进行测序,在GenBank中对测序结果进行Blastn分析。结果10株临床常见细菌测序结果与表型鉴定符合,检测出4株临床不常见细菌。结论 16S rRNA基因测序可以作为鉴定临床不常见细菌的重要方法之一。     

16S rRNA基因RFLP 用于不同科细菌区分

[目的]了解16S rRNA基因在细菌区分中的应用价值。[方法]细菌热裂解后用荧光(FAM,JOE)标记引物进行扩增,产物用Hae Ⅲ消化并进行毛细管电泳。[结果]所有细菌PCR产物均产生255bp片段,酶切产物电泳后具有科间差别。[结论]该方法可以用于不同细菌之间的分科。     

经会阴前列腺穿刺组织的细菌16S rRNA基因检测

目的 探讨Ⅲ型前列腺炎(CPPS)的细菌学病因及16s rRNA基因检测对抗生素疗效的预测价值.方法 对112例CPPS患者(年龄20～48岁),经会阴前列腺穿刺取得皮下组织及前列腺组织,用聚合酶链反应法(PCR)检测细菌16S rRNA基因.加替沙星片治疗4周后随访,根据治疗前后慢性前列腺炎症状评分(NIH-cPsI)评定疗效.结果 18例病人因皮下组织中检测到细菌信号疑为污染而排除,94例完成研究.16S rRNA基因总阳性率63.8%(60/94),Ⅲ a型信号阳性率为68.3%(28/41),Ⅲb型60.3%(32/53).抗生素治疗后16S rRNA基因阳性组总有效率优于阴性组(55.0%比14.7%,P<0.001),在分组研究中,Ⅲa型和Ⅲb型阳性组有效率均优于阴性组(75%比23.1%,P<0.001;37.5%比9.5%,P<0.05).结论 部分CPPS与细菌感染有关,前列腺组织16SrRNA基因检测对抗生索治疗有指导意义.     

界膜组织细菌16S rRNA和23S rRNA对假体周围感染的诊意义

目的 对界膜组织中细菌16S rRNA、23S rRNA进行PCR检测,分析比较两者单独以为及联合应用于假体周围感染诊断的效率.方法 应用诊断标准对本机构67例髋关节翻修患者是否患有假体周围感染(PJI)作出诊断;用PCR技术检测各界膜组织中细菌16S rRNA和23S rRNA基因片段的表达,同样对PJI作出诊断.分别将16S rRNA、23S rRNA、16S rRNA/23S rRNA(即16S rRNA或23S rRNA检测一项为阳性结果即可)以及16S rRNA+23S rRNA 4种策略的诊断结果与诊断标准的结果比较,分析4种策略的敏感性、特异性、阳性及阴性预测值、准确性的差异.结果 应用16S rRNA/23S rRNA诊断的敏感性和阴性预测值均高于16S rRNA+23S rRNA(95.7％vs52.2％,P＜0.01;97.6％vs79.6％,P=0.01).4种诊断策略的特异性、阳性预测值以及准确性无显著性差异,单独应用16S rRNA或23S rRNA的诊断效率相当.结论 单独应用16S rRNA或23S rRNA进行诊断的效率明显差异,16S rRNA/23S rRNA较16S rRNA+23S rRNA更为敏感,且阴性结果可信度更高.     

PCR-SSCP分析Q热立克次体中国分离株16S-23S rDNA基因间区

目的 建立快速分析Q热立克次体分离株16S-23S rDNA基因间区株间差异的PCR-SSCP方法。方法 用半套式PCR扩增7株中国分离株（七医、新桥、雅安、李、YS-8、YS-9和YH-11）和3株国际参考株（九里、Henzerling和Grita）的16S-23S rDNA基因间区,对扩增产物进行PCR-SSCP分析。结果 3株云南分离株（YS-8,YS-9和YH-11）与其它7株之间的差异较大。与此区域的序列分析结果一致。结论 Q热立克次体分离株的16S-23S rRNA基因间区由于适应不同的地理环境可发生变异,PCR-SSCP是快速分析这些变异的有效方法。     

Establishment and analysis of specific DNA patterns in 16S-23S rRNA gene spac er regions for differentiating different bacteria

Objective To establish the specific 16S-23S rRNA gene spacer regions in different bacteri a using polymerase chain reaction (PCR), restriction fragment length polymorphis m (RFLP), DNA cloning and sequences analysis. Methods A pair of primers were selected from highly conserved sequences adjacent to the 16S-23S rRNA spacer region. Bacterial DNA from sixty-one strains of standard bacteria and corresponding clinical isolates representative of 20 genera and 26 species was amplified by PCR, and further analyzed by RFLP, DNA cloning and se quences analysis. Furthermore, all specimens were examined by bacterial cultur ing and PCR-RFLP analysis. The evaluation of these assays in practical clinic practice was also discussed. Results Restriction enzyme analysis revealed one, two or three bands or more observed am ong the 26 different standard strains. The sensitivity of PCR reached 2.5 colony-forming unit (CFU), and there was no cross reaction with human genomic DNA, fungus or virus. Fourt ee n species could be distinguished immediately by PCR, while another 10 species we re further identified by Hinf Ⅰ or Alu Ⅰ digestion. The only difference betwe en K.pneumoniae and E.durans was located at the site of the 779th nucleot ide according to the sequence analysis and only XmaⅢ digestion could distingui sh one from another. Of 42 specimens from septicemic neonates, 15 were identifi e d as positive by blood culture at a rate of 35.7%. However, 27 specimens ident ified as positive by PCR, with a rate of 64.2%, a method significantly more eff ective than blood culture (P＜0.01). Of 6 cerebrospinal fluid (CSF) specim ens, one tested positi ve for S.epidermidis was also positive by PCR, two culture negative were po sitive by PCR and diagnosed as S.epidermidis according to the DNA pattern. One positive for C.neoformans was negative by PCR. The other two specimen s were negative by both PCR and culture. Conclusions The method of detecting bacterial 16S-23S rRNA spacer regions using PCR-RFLP t echniques was specific, sensitive, rapid and accurate in providing a new techniq ue for detecting pathogens in clinical bacterial infections.     

问号钩体血清型参考株16S rRNA基因的PCR－SSCP分析

利用１６ＳｒＲＮＡ基因引物扩增了我国致病性钩体１４群１５型参考株及赖型０１７株ＤＮＡ，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对各参考株的ＰＣＲ产物单链构象多态性进行了对比。结果显示在不同浓度凝胶及电泳条件下，１６株产物均有明显的２条单链，其中爪哇型、拜伦型、塔拉索夫型和曼耗Ⅱ型的国内参考株有相同的带型，而另１１型１２株的带型一致。此结果与Ｙａｓｕｄａ等（１９８７）和Ｒａ－ｍａｄａｓｓ等（１９９２）遗传学分种基本相符。     

细菌直接PCR和双引物策略鉴定16S rRNA基因技术的建立

目的探索一种基于16S rRNA基因的快速鉴定细菌方法,为临床诊断治疗及耐药菌的分子遗传分析提供科学依据。方法对卫生部室间质评菌株和临床病人标本分离培养纯菌落,用双蒸水稀释菌落,然后直接以菌液为模板优化反应体系PCR扩增16S rRNA基因片段,再测序扩增片段。将测序结果在细菌Ribosomal数据库中进行同源性比对,根据序列同源性鉴定病原细菌。结果本实验鉴定的卫生部质评菌株结果与卫生部报告结果一致。本实验能够一次性鉴定出临床病人标本分离的菌株。结论本研究优化了一种免纯化细菌核酸直接PCR鉴定细菌16S rRNA基因的方法。本研究建立的基于病原细菌16S rRNA基因鉴定方法可用于细菌的快速诊断。