乙肝病毒核心抗原强制泛素化DNA疫苗的构建

目的构建乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）强制泛素（Ub）化的DNA疫苗表达质粒。方法以BALB/c小鼠肝脏mRNA为模板,RT-PCR扩增Ub单体基因片段,并将其羧基端第76位氨基酸突变为丙氨酸;以HBVpADR为模板,PCR扩增HBcAg基因片段,并根据N末端法则将其第1位氨基酸突变为精氨酸;利用重组PCR技术拼接Ub-HBcAg融合基因,纯化后连接pUCm-T载体,酶切鉴定正确后将Ub-HBcAg片段插入真核表达质粒pcDNA3.1（-）,构建重组真核表达质粒Ub-HBcAg-pcDNA3.1（-）,并行酶切鉴定和基因测序。结果构建的HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗经基因测序证实目的基因插入方向正确,突变与预期相符;其余基因序列与GenBank发布序列完全一致。结论成功构建了HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗。     

强制泛素化乙肝病毒核心抗原融合基因表达质粒的构建

目的 构建强制泛素化乙肝病毒核心抗原(HBcAg)融合基因真核表达质粒.方法 以HBV adr亚型全基因质粒pADR.为模板,PCR扩增HBcAg基因片段;无茵操作下分离Balb/C小鼠肝脏,提取mRNA,RTPCR扩增小鼠泛素基因片段.PCR产物经测序鉴定后双酶切,插入真核表达质粒pcDNA 3.1(-),构建重组真核表达质粒ub-HBcAg-pcDNA 3.1(-)酶切鉴定和基因测序.结果 扩增的泛素基因片段和HBcAg基因片段经测序证实序列正确;将上述基因双酶切后插入质粒pcDNA 3.1(-)中,构建强制泛素化rmcAg融合基因表达质粒ub-HBcAg-pcDNA3.1(-);融合基因真核表达质粒ub-HBcAG-pcDNA 3.1(-)经酶切、基因测序等鉴定证实目的基因序列和插入方向正确,与预期结果一致.结论 成功构建了强制泛素化乙肝病毒核心抗原融合基因真核表达质粒,为进一步研究强制泛素化HBcAg诱导HBV特异性CTL奠定了实验基础.     

乙型肝炎病毒核心抗原DNA疫苗对小鼠和猕猴的免疫原性观察

目的 :观察乙型肝炎病毒核心抗原 ( HBc Ag) DNA疫苗对小鼠和猕猴的免疫原性。方法 :肌内注射法接种 HBc AgDNA疫苗 ;EL ISA法检测小鼠和猕猴血清抗 - HBc Ig G终点滴度和 Ig G亚类水平 ;51铬释放法测定小鼠脾细胞 HBc Ag特异性细胞毒性T细胞 ( CTL )活性 ;EL ISA法检测猕猴外周血单个核细胞 ( PBMC)培养上清中 IFN -γ及 IL - 4水平 ;3H - Td R掺入法检测猕猴PBMC HBc Ag特异性增殖反应。结果 :小鼠和猕猴经接种该 DNA疫苗后均产生高滴度抗 - HBc抗体 (分别达 1∶ 3 2 80 5 0和1∶ 10 93 5 0 ) ;小鼠抗 - HBc Ig G亚类以 Ig G2 a为主 ,猕猴抗 - HBc Ig G亚类以 Ig G2占优势 ( Ig G1/Ig G2 <1) ;小鼠的 HBc Ag特异性CTL杀伤活性达 5 0 %以上 ;猕猴 PBMC培养上清中 ,IFN-γ水平与 IL - 4相比占明显优势 ( 15 .63 pg/ml vs <3 .13 pg/ml) ,猕猴PBMC抗原特异性增殖反应阳性 (刺激指数 =2 .12～ 3 .83 )。结论 :HBc Ag DNA疫苗对小鼠和猕猴均具有良好的体液免疫和细胞免疫原性。     

猕猴对乙型肝炎病毒核心抗原核酸疫苗的特异性细胞免疫应答

目的 观察乙型肝炎病毒核心抗原核心酸疫苗即ＨＢｃＡｇ核酸疫苗（ｐＪＷ４３０３／ＨＢｃ）免疫猕猴的特异性细胞免疫应答。方法 猕猴分别在第０、２、４、６个月肌肉注射法接种核酸疫苗（ｐＪＷ４３０３／ＨＢｃ）或对照质粒（ｐＪＷ３０３）；ＥＬＩＳＡ法检测猕猴外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ），经特异性抗原（ＨＢｃＡｇ）刺激后，培养上清中人白细胞介素－４（ＩＬ－４）和干扰素γ（ＩＦＮ－γ）以及猕猴血清中抗－ＨＢｃｌ     

乙肝核心抗原DNA疫苗的构建及其免疫原性分析

构建ＨＢＶ核心抗原ＤＮＡ疫苗,并探讨基实验动物内的表达及其免疫原性。方法：采用ＰＣＲ法从ＨＢＶ全基因ＤＮＡ中获得核心抗原ＤＮＡ片段,并将其重组到ｐｃＤＮＡ３载体。以此为候选疫苗分别免疫小鼠和树Ｊｕ,并检测其抗ＨＢｃＩｇＧ。结果：构建了乙肝核心抗原候选核酸疫苗ｐｃＤＮＡ３－ＨＢｃ。免疫接种该疫苗后第２周抗ＨＢｃＩｇＧ水平开始升高,小鼠至第９周,树Ｊｕ至第７周升至峰值。结论：构建ｐｃＤＮＡ３－ＨＢＣｄ     

单纯疱疹病毒2型泛素化新型DNA疫苗构建

目的构建单纯疱疹病毒2型(HSV-2)早期表达蛋白感染细胞蛋白(ICP)27强制泛素化的DNA疫苗表达质粒。方法利用聚合酶链反应(PCR)技术从人基因组DNA和HSV-2基因组中分别扩增出泛素全长基因和HSV-2、ICP27 377-459,PCR鉴定后酶切连接获得融合基因片段,插入真核表达质粒pcDNA3．1载体中,构建出重组真核表达质粒Ub-ICP-pcDNA3．1,并对其进行测序鉴定。结果构建的重组质粒Ub-ICP-pcDNA3．1克隆基因插入方向正确,与预期序列完全一致。结论成功构建了HSV-2早期表达蛋白ICP27强制泛素化DNA疫苗。     

乙肝病毒表面抗原基因疫苗诱导小鼠细胞及体液免疫应答的研究

为观察乙肝病毒 Ｈ Ｂｓ Ａｇ 基因疫苗免疫小鼠后的细胞及体液免疫应答,将该疫苗定向克隆于质粒ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３ 巨细胞病毒启动子下游,构建能在真核细胞内表达的重组基因疫苗ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ Ｈ Ｂｓ Ａｇ 。将此疫苗通过多点肌肉注射免疫 Ｂａｌｂ／ Ｃ 小鼠后第六周,实验组小鼠均出现抗－ Ｈ Ｂｓ Ｉｇ Ｇ 阳性,其抗体水平明显高于对照组,同时 Ｔｈ１ 免疫应答相关的细胞因子 Ｉ Ｌ２ 及γ干扰素水平也明显高于对照组,表明本文构建的基因疫苗ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３ Ｈ Ｂｓ Ａｇ 能诱导 Ｂａｌｂ／ Ｃ 小鼠产生良好的细胞及体液免疫应答。     

乙肝病毒DNA与前S1抗原及HBcAg检测的意义

目的探讨乙型肝炎病毒DNA与前S1蛋白及HBcAg在乙肝患者血清中的相关性及临床意义。方法对280例乙肝的血清采用酶联免疫吸附法(EIISA)检测前S1抗原、HBcAg,定量PCR检测HBV-DNA。结果HBV-DNA阳性的130例中HBcAg阳性率为82.30%,前Sl抗原的阳性检出率为79.23%,在前Sl抗原阳性的94例中HBcAg阳性率为17.02%,在前S1抗原的阴性的70例中,HBcAg阳性率为8.57%,两者比较有显著性差异(<0.05)。前Sl抗原与HBcAg阳性患者的HBV-DNA拷贝数大部分在107~l08IU/ml之间,且HBcAg的阳性率明显高于前S1阳性率,当HBV-DNA在l03~106IU/ml时,前Sl的阳性率高于HBcAg的阳性率。结论前S1抗原、HBcAg与HBV-DNA符合率较高,检测前Sl抗原和HbcAg同样具有重要的临床意义。     

HCV核心蛋白DNA疫苗诱导的小鼠体液免疫应答

目的：观察丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白ＤＮＡ疫苗诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠体液免疫应答的效力，为研制应用于人类的ＨＣＶ ＤＮＡ疫苗提供实验依据。方法：将全长ＨＣＶ核心蛋白基因插入真核表达质粒载体ｐｃＤＮＡ３．１，构建ＨＣＶ核心蛋白重组表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１ＨＣＶｃｏｒｅ，肌注ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，以ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血清ＨＣＶ抗体。以此重组质粒转染小鼠ＮＩＨ３Ｔ３细胞，以ＨＣＶ抗体阳性小鼠血清为捕获抗     

乙肝病毒小基因嵌合DNA疫苗的构建与鉴定

目的采用基因重组技术,将乙肝病毒4段小基因与协同刺激分子CD80基因嵌合,构建成嵌合乙肝小基因DNA疫苗。方法①根据文献选择和设计HBV的一段pres2、三段core表位编码小基因,以人工合成DNA片段P1~P10,通过退火、连接成为含约170bp的嵌合基因,用HindⅢ酶切;②提取和纯化pcDNA3-CD80,用HindⅢ酶切和去磷酸化;③将酶切小基因定向插入pcDNA3-CD80载体的HindⅢ位点之间,构建成pcHBV-CD80小基因质粒;④pcHBV-CD80转入E.coli JM109扩增、提取质粒,测序鉴定。结果①各DNA小片段经退火、连接,成功嵌合为一大小约170bp之目的基因;②pcDNA3-CD80提取、酶切均成功;③170bp之目的基因定向克隆到载体上,构建了重组质粒pcHBV-CD80,经测序鉴定均构建正确。结论乙肝病毒小基因与协同刺激分子CD80嵌合DNA疫苗构建成功。     

乙肝病毒adr型基因疫苗诱导小鼠体液免疫应答

目的：构建乙肝病毒adr型基因疫苗pCMVS2-S,观察其免疫小鼠的特异性体液免疫应答。方法：将构建的乙肝病毒基因疫苗注射于C57BL/6小鼠胫骨前肌肉,运用ELISA检测不同时间小鼠血清中抗HBs抗体。结果：注射基因疫苗1周后,血清中抗HBs抗体转阳,1个月后抗体达到高峰,并以高水平维持至少2个月。结论：基因疫苗pCMVS2-S诱导C57BL/6小鼠产生较好的体液免疫应答。     

乙型肝炎病毒核心抗原及Flt3配体双表达核酸疫苗的构建与体外表达

目的:构建可同时表达乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)和Flt3配体(FL)胞外段的双表达核酸疫苗。方法:将HBcAg和FL胞外段的基因用PCR方法扩增并分别引入相应的限制性内切酶酶切位点,然后克隆入真核双表达载体pIRES,获得含双基因片段的表达质粒;再取该表达质粒中的内部核糖体切入位点(IRES)序列和基因片段克隆入pJW4303载体中,获得相应的双表达核酸疫苗,经筛选鉴定后,以293T细胞瞬时表达检测两基因的表达水平。结果:构建成功以pIRES、pJW4303为载体的4种HBcAg和FL胞外段的双表达核酸疫苗,体外表达证实HBcAg和FL胞外段均能高效表达,基因位于IRES上游时表达水平较高。结论:用IRES元件实现了HBcAg和FL胞外段双表达核酸疫苗的构建,pJW4303为载体的核酸疫苗两基因表达水平优于pIRES为载体的核酸疫苗。     

深圳市乙肝疫苗免疫失败者S基因分析

目的了解乙肝疫苗免疫失败者的HBVS基因的变异情况。方法采用流行病学、ELISA与分子生物学方法,筛选乙肝疫苗免疫失败者。采用聚合酶链反应（PCR）、基因克隆和测序的方法,对乙肝疫苗免疫失败者的HBVS基因进行分析,并与HBV参考序列s基因进行比较,分析其变异情况。结果从2564份受检者中．筛选出2例（0．78％e）HBsAg（-）／HBeAg（＋）／HBcAb（＋）乙肝疫苗免疫失败者（HBsl、HBs2）,经HBVDNA荧光定量PCR检测和HBVS基因PCR扩增,结果均为阳性,为B基因型。其S基因序列与参考序列（JX429908．1）相比,同源性为98．57％,且乙肝疫苗免疫失败者s基因在第363位和第467位分别由野生型的C变为A、G变为A,HBsAg121位和156位氨基酸C和w缺失。结论乙肝疫苗免疫失败者HBVS基因上第363位和第467位碱基存在错义突变（C→A和G→A）,改变了HBsAg的结构和抗原性。     

丁型肝炎病人肝组织HDAg与HBsAg/HBcAg和HBV DNA表达及关系

目的：探讨丁型肝炎病人肝组织中ＨＤＡｇ与ＨＢｓＡｇ／ＨＢｃＡｇ和ＨＢＶＤＮＡ表达及关系。方法：应用免疫组化双重染色和原位杂交,检测７９例丁型肝炎病人肝组织ＨＤＡｇ、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ和ＨＢＶＤＮＡ表达,以５２例乙型肝炎作对照。结果：丁型肝炎ＨＢｓＡｇ、ＨＢｃＡｇ检出率（８１％、７１％）较乙型肝炎（９４％、９２％）低（Ｐ〈０．０５或０．０１）。ＨＤＡｇ以肝细胞核表达为主,ＨＢｓＡｇ以肝细胞浆表达     

IL-12对乙型肝炎DNA疫苗诱导小鼠免疫应答的影响

目的　观察编码鼠 IL - 12的真核表达载体对 HBVDNA疫苗诱导 BAL B/ c小鼠免疫应答的影响 .方法　肌肉注射 DNA疫苗 ,EL ISA法检测小鼠血清抗 HBs,4h5 1 Cr释放法检测小鼠脾细胞 CTL杀伤活性 .结果　免疫 8wk后 ,单纯注射 p CR3.1- S及共注射 IL - 12真核表达载体的小鼠血清 45 0 nm A值分别为 0 .87± 0 .1及 1.6 7± 0 .15 .CTL 细胞杀伤活性分别为 (5 0 .5± 6 .4) %及 (73.3± 8.8) % ,两组均有明显差异 (P<0 .0 1) ,脾细胞悬液经抗 CD4+ 单克隆抗体处理后 CTL 细胞杀伤活性分别为 (48.3± 5 .9) % ,(75 . 6±9.1) % ,抗 CD8+单克隆抗体处理后分别为 (10 .6± 1.4) % ,(16 .9± 2 .3) % .结论　 IL - 12的真核表达载体能够提高小鼠对 DNA疫苗的免疫应答 ,CTL细胞杀伤活性主要由 CD8+执行 .基因疫苗可能用于预防及治疗 HBV感染     

丙型肝炎病毒CTL-Th表位嵌合DNA疫苗的构建

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)CTL-Th表位嵌合DNA疫苗并探讨其体内免疫学效应。方法:基于我们前期从HCV中鉴定的4条HLA-A*0201限制性CTL(细胞毒性T细胞)表位(NS4b78-86、NS5a367-375、C181-189和NS2172-180),2条HLA-A*1101限制性CTL表位(NS3609-617和NS5b251-259),1条HLA-A*2402限制性CTL表位(NS5b382-390)和2条Th(辅助性T细胞)表位(P73-15和NS5A276-288),合成编码串联CTL表位和Th表位的基因并克隆入真核表达质粒pc DNATM3.1/myc-His(-)A;阳性重组质粒分别免疫HLA-A*0201、HLA-A*1101和HLA-A*2402转基因小鼠,采用ELISPOT实验和CTL杀伤实验检测小鼠脾细胞内单个CTL表位特异性T细胞的水平及其杀伤靶细胞的效应。结果:合成了含有Kozak序列和编码Igκ信号链序列、7条CTL表位、2条Th表位的基因序列并顺利克隆入了真核表达质粒。阳性重组质粒免疫三种转基因小鼠后,采用ELISPOT实验检测到小鼠脾细胞内存在单个CTL表位特异性分泌IFN-γ的CTL,后者可杀伤负载单个CTL表位的脾细胞。结论:成功构建了可诱导CTL反应的HCV的CTL-Th表位嵌合DNA疫苗。     

乙肝疫苗联合乙肝免疫球蛋白阻断乙肝病毒母婴传播的临床效果

目的：探讨乙肝免疫球蛋白（HBIG）和乙肝疫苗联合阻断乙肝病毒（HBV）母婴传播的疗效。方法：选择2014年12月~2015年12月间246例HBsAg阳性孕妇为研究对象,根据随机数字表法分为观察组及对照组,均123例。对照组仅新生儿单独接种乙肝疫苗,观察组孕妇及新生儿均联合接种乙肝疫苗和HBIG。结果：对照组及观察组新生儿中出现宫内HBV感染率分别为22.76%和9.76%,一年后对照组及观察组新生儿中HBV感染率分别16.26%和1.63%,两组间差异均存在统计学意义。对照组及观察组新生儿出生时及一年后对应HBsAb阳性率分别为8.13%、76.42%和27.64%、94.31%,两组差异存在统计学意义。结论：孕妇及新生儿乙肝免疫球蛋白和乙肝疫苗联合应用能够有效降低HBsAg阳性情况患者所产新生儿HBV感染率,同时能使新生儿对应的HBsAb转阳率有效提高,最终使HBV的传播阻断率提高。     

乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白去糖基化对体液免疫应答的影响

目的:观察乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原中蛋白(MHBs)中去糖基化对体液免疫应答的影响.方法:在MHBs核酸疫苗(pSW3891/MHBs/adr)基础上,通过PCR扩增基因修饰法,使MHBs上编码第4、59、146位氨基酸密码子基因由AAT/AAC突变为CAG,从而使AAT/AAC编码的天冬酰胺Asn(N)突变为CAG编码的谷氨酰胺Gln(Q),使得N-糖基化位点NXS、NXT突变为QXS、QXT.构建3株去糖基化核酸疫苗(dG1,去除Asn4处糖基化位点,位于preS2上;dG23,去除Asn59、Asn146处糖基化位点,均位于HBs上;dG123,去除Asn4、Asn59及Asn146位糖基化位点).脂质体法转染293T细胞,Western blot检测,观察它们在293T细胞中瞬时表达的差异;肌肉注射法免疫BALB/c小鼠,观察MHBs去糖基化对小鼠体液免疫应答的影响.结果:adr、dG23转染293T细胞后,在细胞内及上清液中均检测到HBsAg;dG1、dG123转染293T细胞后,在细胞内检测到HBsAg,但是上清液中未测到.adr、dG1及dG23免疫BALB/c小鼠后均产生抗-HBs抗体,最高滴度均达到1∶102 400;dG123几乎无抗体反应(＜1∶200).结论:Asn4去糖基化导致MHBs向细胞外的分泌障碍,但是对小鼠抗-HBs的产生无影响.Asn59、Asn146两处同时去糖基化对MHBs的分泌和小鼠抗-HBs的产生影响轻微.Asn4、Asn59及Asn 146三处同时去糖基化明显影响MHBs的分泌和小鼠抗-HBs的产生.