Fas配体在膀胱肿瘤细胞系免疫逃逸中的作用

目的　探讨膀胱肿瘤细胞系的免疫逃逸机制。　方法　采用免疫细胞化学方法检测膀胱癌细胞系BIU 87中Fas配体 (FasL)的表达 ,应用BIU 87与JurkatT淋巴细胞共培养的方法体外研究FasL诱导T淋巴细胞凋亡的作用。　结果　膀胱癌细胞系BIU 87FasL表达阳性。BIU 87与JurkatT淋巴细胞共培养T细胞凋亡率为 (33.2± 6 .5 ) % ,应用抗体NOK 2中和BIU 87细胞FasL后 ,T细胞凋亡率减少为 (10 .1± 2 .7) % ,两组相比 ,差别有非常显著性意义 (P <0 .0 1)。　结论　膀胱肿瘤细胞系可能通过表达FasL主动诱导T淋巴细胞凋亡从而在膀胱肿瘤的免疫逃逸中发挥作用     

bcl-2过表达对阿霉素诱导的膀胱癌细胞凋亡和活性氧产生的影响

目的探讨凋亡相关基因bcl-2过表达对阿霉素(ADR)诱导的膀胱癌细胞凋亡的影响。方法采用脂质体转染法将bcl-2基因转入膀胱癌BIU87细胞,G418筛选获得抗性亚克隆细胞株,逆转录．聚合酶链反应(RT-PCR)法检测bcl-2基因的表达。比较BIU87、BIU87/neo和BIU87/bcl-2细胞对ADR的敏感性。用ADR分别作用于上述细胞24 h,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞内活性氧(ROS)产生情况。结果建立分别稳定表达bcl-2基因、新霉素抗性基因(neo)的膀胱癌亚克隆细胞株BIU87/bcl-2、BIU87/neo。RT-PCR BIU87/bcl-2细胞的bcl-2 mRNA水平显著高于BIU87、BIU87/neo(P＜0．01)。噻唑蓝(MTT)检测显示BIU87/bcl-2细胞对ADR的化疗敏感性明显降低(P＜0．01)。ADR作用24 h后,BIU87、BIU87/neo细胞凋亡率分别为(23．75±3．72)%、(21．94±1．27)%,而BIU87/bcl-2细胞为(3．38±0．95)%(P＜0．01)；ROS分别为(90．45±1．96)%、(88．41±3．88)%和(77．00±3．86)%,BIU87/bcl-2细胞较前两者明显降低(P＜0．01)。结论bcl-2基因能够抑制ADR诱导的膀胱癌BIU87细胞凋亡,降低细胞内ROS水平是其发挥抗凋亡作用的重要机制。     

转人GM—CSF基因人膀胱癌细胞株的建立及体外生物学特性

经逆转录病毒载体将人GM-CSF基因导入人膀胱癌细胞株BIU-87细胞中,建立了转基因细胞株BIU/GM。经流式细胞仪行细胞DNA周期分析表明GM-CSF基因的导人及表达对BIU-87细胞的增长无影响。免疫荧光测定发现转GM-CSF基因及表达不能促进BIU-87细胞表面HLA-ABC、DR、DQ抗原的表达。转基因瘤细胞株经6000rad X射线照射灭活后,丧失增殖能力,逐步死亡,但能维持一定水平的GM-CSF分泌活性达两周以上。从而为制备灭活的转基因瘤苗提供了初步经验。     

逆转录病毒载体介导的HyTK基因在人膀胱癌细胞株EJ中的表达

为探索ＨＳＶ１ＴＫ基因对人膀胱癌的治疗作用，作者用一种与潮霉素磷酸转移酶（ｈｐｔ）基因相融和的Ⅰ型单纯疱疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶ１ＴＫ）基因（简称ＨｙＴＫ基因）作目的基因，用逆转录病毒载体将ＨｙＴＫ基因导入人膀胱癌细胞株ＥＪ细胞中表达。含ＨｙＴＫ基因的逆转录病毒载体ＬＨｙＴＫＮ，经包装细胞ＰＡ３１７包装后，获得重组逆转录病毒；病毒感染人膀胱癌细胞株ＥＪ细胞，经潮霉素Ｂ筛选培养，获得潮霉素Ｂ的抗性克隆；ＰＣＲ扩增证实：病毒感染的ＥＪ细胞中导入了ＨＳＶ１ＴＫ基因，为开展ＨｙＴＫ基因治疗膀胱癌打下了基础。     

干扰素α对膀胱癌细胞多药耐药性逆转作用的研究

目的:探讨干扰素α(IFN-α)对膀胱癌细胞多药耐药性的逆转作用。方法:以人膀胱移行上皮癌细胞系BIU87和BIU87/ADM为研究对象,应用MTT法检测阿霉素(ADM)的细胞杀伤作用、荧光法检测细胞内ADM浓度和斑点杂交法检测mdrlmRNA相对含量。结果:500IU/mlIFN-α能明显增强ADM对耐药细胞BIU87/ADM的杀伤作用,但不能增强ADM对敏感细胞BIU87的杀伤作用;IFN-α能增加ADM在BIU87/ADM细胞内的积聚,但并不改变mdrlmRNA在细胞内的表达量。结论:IFN-α对膀胱癌细胞多药耐药性具有逆转作用,其机制与IFN-α增加细胞内抗癌药物浓度有关,与mdrlmRNA表达量无关     

LRIG1基因对膀胱癌细胞侵袭力的影响

目的探讨抑癌基因LRIG1对膀胱癌细胞BIU87侵袭能力的影响。方法用脂质体介导的基因转染技术,将pLRIG1-GFP质粒转染人膀胱癌细胞BIU87,用G418筛选出抗性克隆。用Boyden小室观察转染前后细胞侵袭能力的变化,并用逆转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）法和Western—blot检测转染前后LRIG1和表皮生长因子受体（EGFR）的mRNA和蛋白表达水平。结果转染pLRIG1-GFP后的BIU87细胞侵袭能力显著降低,LRIG1的mRNA和蛋白表达水平明显升高,而EGFR的mRNA和蛋白表达水平则显著降低（P〈0．01）。结论LRIG1对膀胱癌细胞BIU87的侵袭能力有显著的抑制作用。     

AP-1反义寡聚脱氧核苷酸逆转人膀胱癌耐药细胞多药耐药的实验研究

目的 观察以激活剂蛋白-1(AP-1)位点为靶序列的特异性反义寡聚脱氧核苷酸(a-sODNs)对人膀胱癌耐药细胞株多药耐药性的逆转作用。方法 设计针对谷胱甘肽(GSH)生物合成的限速酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因启动子区域AP-1序列的特异性asODNs，用阳离子脂质体包被后转染人膀胱癌细胞株BIU87及其多药耐药(MDR)亚株BIU87／A，然后分别用定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法[以β-肌动蛋白(β-actin)为内参照]、荧光分光光度法、MTT法等检测AP-1-asODNs对两株细胞γ-GCSmRNA表达、细胞内GSH水平及其对6种抗癌药物肿瘤细胞抑制率的变化。结果 AP-1-asODNs转染72h后，BIU87和BIU87／A细胞的γ-GCS mRNA的表达和细胞内GSH的水平均出现下降。同时6种抗癌药物对反义转染后的两株细胞的抑制率大部分都有所提高。结论 γ-GCS特异的AP-1-asODNs可通过降低细胞内的GSH水平增强膀胱癌细胞对化疗的敏感性，逆转肿瘤细胞的耐药。     

hTERT启动子调控的CXCR4-shRNA逆转录病毒抑制膀胱癌细胞侵袭、增殖的体外研究

目的构建人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控的趋化因子受体4（CXCR4）的短发夹RNA（shRNA）逆转录病毒表达载体,并研究其对hTERT阳性膀胱癌细胞中CXCR4表达的抑制效应及对细胞侵袭、增殖的影响。方法用PCR扩增特异CXCR4-shRNA的DNA片段,以hTERT启动子代替U6启动子,将重组基因片段导入到逆转录病毒载体,收获病毒后分别感染膀胱癌细胞BIU87及人胚肺成纤维细胞MRC5和人乳腺癌细胞MCF7,RT-PCR、Western blot检测CXCR4 mRNA及蛋白的表达。MTT法检测细胞增殖变化。Transwell小室实验检测细胞体外侵袭能力的变化。结果hTERTpro—CXCR4-shRNA能显著抑制MCF7、BIU87细胞CXCR4 mRNA及蛋白的表达,48h mRNA抑制率分别为（87．09±7．60）％、（91．02±11．32）％,48h蛋白抑制率分别为（89.01±4．87）％、（90．42±9．64）％,其对MRC5细胞不抑制。感染重组病毒的膀胱癌细胞体外侵袭、增殖能力均显著下降。结论重组病毒中hTERT启动子调控的下游RNA干扰序列可靶向表达于hTERT阳性膀胱癌细胞、乳腺癌细胞,不表达于hTERT阴性MRC5细胞。     

人IFN-γ cDNA逆转录病毒载体的构建及其在人膀肤癌细胞中的表达

用逆转录病毒载体介导转移人干扰素γ(hIFN-γ)基因在人膀胱癌细胞EJ中稳定表达。应用基因重组技术构建含hIFN-γ基因的逆转录病毒载体pZip-hIFN-γ,采用脂质体介导法转染包装细胞Ψ-2和PA 317,然后用高病毒滴度的PA 317细胞培养上清感染EJ细胞。经G 418筛选培养得到一株能稳定分泌hIFN-γ(210IU/ml)的EJ克隆,Southern印迹证实hIFN-γ基因已插入EJ基因组中。逆转录病毒载体pZip-hIFN-γ能有效地介导基因转移,并能使目的基因在靶细胞稳定表达,这为人膀胱癌转hIFN-γ基因瘤苗的应用研究打下了基础。     

shRNA抑制NOTCH1基因对膀胱癌细胞BIU87生物学行为的影响

目的:探讨NOTCH1基因沉默对人源性膀胱癌细胞增殖及分化的影响.方法:用pGenesil质粒构建靶向NOTCH1的shRNA真核表达载体psiRNA1并将其转染到膀胱癌细胞系BIU87中,四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)、流式细胞术(FCM)检测NOTCH1沉默后膀胱癌细胞生长变化、细胞周期和凋亡情况.WesternBlot和RT-PCR法检测NOTCH1基因的蛋白和mRNA在转染前后表达变化.结果:转染psiRNA1质粒后BIU87细胞中NOTCH1基因在蛋白和mRNA表达水平相对于对照组明显下调(P<0.05),BIU87的生长受到明显抑制,呈现一定的时间依赖性(<60 h).凋亡率增加,G0/G1期细胞明显增多,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05).结论:沉默NOTCH1基因能够抑制膀胱癌细胞的增殖和分化,NOTCH1在膀胱癌中可能具有癌基因的作用.     

人膀胱癌细胞耐药株多基因蛋白表达的意义

为研究膀胱肿瘤细胞耐药机制，使用药物浓度递增的方法，分别采用阿霉素（ＡＤＭ）或足叶乙甙（ＶＰ１６）建立了人膀胱癌耐药细胞株ＢＩＵ８７／Ａ和ＢＩＵ８７／Ｖ，并进行了耐药倍数分析。ＢＩＵ８７／Ａ对ＡＤＭ、ＶＰ１６的耐药倍数分别为５７４、５９４；ＢＩＵ８７／Ｖ对ＡＤＭ、ＶＰ１６的耐药倍数分别为６５、５４。采用免疫组化的方法分析Ｐ５３、ｂｃｌ２蛋白和Ｐ糖蛋白（Ｐｇｐ）在细胞中的表达，结果显示ＢＩＵ８７三种蛋白均阴性，而ＢＩＵ８７／Ａ、ＢＩＵ８７／Ｖ的三种蛋白均阳性，且ＢＩＵ８７／Ａ的表达量均多于ＢＩＵ８７／Ｖ。结果说明突变型Ｐ５３蛋白、ｂｃｌ２蛋白和Ｐｇｐ表达在细胞耐药机制中可能起重要作用     

人膀胱癌多重抗药性逆转的实验研究

为探讨膀胱癌多重抗药性逆转机理，应用阿霉素（ＡＤＭ）大剂量短暂冲击结合低浓度持续递增法，获得了具有多重抗药性的ＢＩＵ８７Ｒ／ＡＤＭ细胞。通过测定细胞内ＡＤＭ聚积量和钙离子浓度，发现ＢＩＵ８７Ｒ／ＡＤＭ细胞内ＡＤＭ聚积量显著低于ＢＩＵ８７细胞（Ｐ＜００５）；维拉帕米（ＶＰＬ）、奎宁能使ＢＩＵ８７Ｒ／ＡＤＭ细胞内ＡＤＭ聚积量增加（Ｐ＜００５），两者协同应用基本上可逆转ＢＩＵ８７Ｒ／ＡＤＭ细胞的抗药性。结果表明：（１）细胞内ＡＤＭ聚积量减少是抗药细胞的重要变化，在细胞抗药性发生机理中可能起主导作用，（２）ＶＰＬ、奎宁能逆转ＢＩＵ８７Ｒ／ＡＤＭ细胞的抗药性，可能与增加细胞内ＡＤＭ聚积量有关，与钙通道无关。     

抑癌基因LRIG1对膀胱癌细胞BIU87生物学特性的影响

质粒转染人膀胱癌BIU87细胞，用G418（800mg／L）筛选出抗性克隆。Western blot检测转染前后LRIG1和EGFR蛋白水平的变化；MTT法绘制转染前后细胞的生长曲线；Boyden小室和同质黏附实验观察转染前后细胞侵袭和黏附能力的变化。结果转染pLRIG1-GFP组LRIG1蛋白表达水平较对照组和转染空载体组明显升高，而EGFR蛋白表达水平较对照组和转染空载体组显著降低；转染pLRIG1-GFP组细胞的生长速度较对照组和转染空载体组明显减慢；转染pLRIG1-GFP后的BIU87细胞侵袭目的研究抑癌基因LRIG1对膀胱癌细胞BIU87生物学特性的影响。方法用脂质体介导的基因转染技术，将pLRIG1-GFP和黏附能力显著降低（P〈0．05）。结论LRIG1是一种抑癌基因，通过参与形成EGFR的负反馈环路，对膀胱癌细胞BIU87的生长、侵袭和转移有显著的抑制作用。     

Survivin启动子驱动LRIG1基因表达的重组腺病毒对人膀胱癌细胞BIU87生长的影响

目的:构建Survivin启动子驱动LRIG1基因表达的重组腺病毒Ad-Surp-LRIGl,并检测其对人膀胱癌细胞BIU87生长的影响.方法:将经同源重组产生的重组腺病毒Ad-Surp-LRIGl在293细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,测其滴度.用Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl分别感染人膀胱癌细胞BIU87及人膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1,MTT法评估Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl对BIU87细胞生长的抑制作用.结果:当感染复数(MOI)=25时,Ad-Surp-LRIGl在BIU87细胞中的转染效率为74.56%,在SV-HUC-1细胞中转染率为0,差异有统计学意义(χ2=58.64,P<0.05);Ad-LRIGl在BIU87细胞中的转染效率为68.27%,在SV-HUC-1细胞中转染率为72.52%,差异无统计学意义(χ2=0.075,P>0.05).Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl在BIU87细胞中的转染效率相比,差异无统计学意义(χ2=0.016,P>0.05).与PBS相比,Ad-Surp-LRIGl和Ad-LRIGl均能明显抑制BIU87细胞的生长,转染后第4天这一差异显著(F=15.96,P<0.05),而Ad-Surp-LRIGl组和Ad-LRIGl组细胞生长速度无明显差异.结论:成功构建了含有Survivin启动子驱动LRIG1基因的重组复制腺病毒Ad-Surp-LRIGl并鉴定正确,Ad-Surp-LRIGl能选择性转染人膀胱癌细胞BIU87,在体外能明显抑制膀胱癌细胞BIU87的生长.     

逆转录病毒载体介导HSV—TK基因在膀胱癌细胞的表达和作用

应用基因工程技术构建了带ＨＳＶＴＫ基因的逆转录病毒重组体ｐＬＮＳＸＴＫ，磷酸钙沉淀法转染ＰＡ３１７细胞，建立了重组病毒的载体产生细胞系ＰＡ３１７／ＴＫ细胞。用病毒上清感染人的膀胱癌细胞株ＢＩＵ８７，Ｇ４１８筛选抗性克隆ＢＩＵ８７／ＴＫ细胞。提取ＰＡ３１７／ＴＫ和ＢＩＵ８７／ＴＫ细胞的ＤＮＡ，用ＤＩＧ标记检测证实整合了ＨＳＶＴＫ基因，在病毒上清用ＲＴＰＣＲ检测到目的基因的转录。转导ＨＳＶＴＫ基因的膀胱癌细胞获得对ＡＣＶ的化学敏感性，给予ＡＣＶ可有效地杀伤肿瘤细胞。     

bcl-2基因表达在人膀胱癌多药耐药现象中的意义

目的探讨ｂｃｌ２基因在人膀胱癌多药耐药中的作用。方法应用原位ＤＮＡ末端转移酶标记法（ＴＵＮＥＬ）、免疫细胞化学及逆转录多聚酶链式反应（ＲＴＰＣＲ）技术,分别对阿霉素诱导的人膀胱癌耐药细胞株（ＢＩＵ８７／ＡＤＭ）及敏感细胞株（ＢＩＵ８７）的细胞凋亡及其ｂｃｌ２基因表达进行研究。结果（１）在相同条件下,与敏感细胞株相比,耐药细胞株中细胞凋亡明显受到抑制;（２）耐药细胞株中ｂｃｌ２基因表达明显强于敏感细胞株。结论凋亡抑制基因ｂｃｌ２在人膀胱癌多药耐药细胞中的高表达,是导致其细胞凋亡受抑制的重要原因,对于人膀胱癌多药耐药的产生具有重要意义。     

HSV-TK/GCV系统体外对膀胱癌细胞的旁观杀伤作用

目的 探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－TK）基因联合羟基无环鸟苷（GCV）对膀胱癌细胞的旁观杀作作用及其机制。方法 将转染HSV－TK基因的膀胱癌细胞（BIU 87－TK）分别与人膀胱癌细胞（BIU 87、T 24）和鼠膀胱癌细胞（T 739）混合培养。在GCV作用下,观测细胞的存活情况及BIU 87－TK条件培养液和细胞死亡裂解对共培养细胞的影响。结果 当BIU 87－TK细胞占50％时,共培养细胞对GCV的敏感性与100％ BIU 87－TK细胞一致。表明每个表达HSV－TK基因的细胞能杀死至少一个不含HSV－TK基因的膀胱癌细胞。BIU 87－TK细胞的条件培养液对BIU 87亲本细胞的生长无影响。G 418诱导的细胞裂解与对其共培养的BIU 87－TK细胞无旁观毒性作用。结论 HSV－TK／GCV对膀胱癌细胞产生的“旁观者”效应是该系统特异性的毒性作用。“旁观者”效应不仅可在人膀胱癌不同细胞株之间产生,而且不局限于某一种属的膀胱癌细胞之间。