小鼠钟基因Period2(Per2)抑制乳腺癌细胞生长的研究

目的 研究小鼠节律基因Period2（Per2）对小鼠乳腺癌细胞（EMT6）的生长抑制及诱导凋亡的作用。方法 将pcDNA3．1（＋）-Per2转导入EMT6细胞内,同时设立转染空质粒pcDNA3．1（＋）入细胞的对照组。以RT-PCR、Western blot、流式细胞技术来检测Per2基因和蛋白的表达;采用MTT、细胞生长曲线、细胞平板集落形成实验检测Per2过表达后对小鼠乳腺癌细胞的生长抑制作用;通过流式细胞技术、DNA梯形带、hochst33258荧光染色和电镜技术检测nr2过表达后对小鼠乳腺癌细胞凋亡的影响。结果 小鼠节律基因nr2过表达抑制EMT6细胞的生长和增殖,诱导细胞凋亡率增加。结论 本研究发现小鼠节律基因Per2可能通过使EMT6细胞阻滞于G1期,并诱导细胞凋亡来实现对该肿瘤细胞的生长抑制作用。     

hPeriod1PAS结构域相互作用蛋白的筛选和研究

目的寻找与近日节律系统核心基因Period1（Per1）相互作用的新蛋白,揭示近日节律相关的可能信号通路。方法采用酵母双杂交方法,以人Per1的PAS结构域为诱饵,扫描人下丘脑cDNA文库,并通过体外转录、免疫共沉淀验证蛋白间相互作用;通过RT—PCR检测RACK1（receptors for activated Ckinase）表达的组织特异性及节律性;运用RNAi技术初步研究RACK1与Per1的信号联系。结果人下丘脑区域RACK1蛋白与Per1存在相互作用;RACK1在多器官组织保守表达,但其表达未呈现明显节律性;上调及下调Per1表达,RACK1的RNA水平无显著变化。结论细胞内接头分子RACK1是一种新的Per1作用蛋白,可能介导、调控Per1的功能。     

节律基因Period2对肿瘤细胞生长及放射敏感性的影响

目的探讨Period2（Per2）基因对细胞生长及放射敏感性的影响。方法体外培养C6神经胶质瘤细胞（C6 glioma cells）,使用脂质体包裹法将nr2表达质粒（pcDNA3．1-Per2）转导入C6细胞内;以免疫组化及流式细胞术检测Per2表达;通过流式细胞术和克隆形成试验检测稳定转染Per2阳性表达的C6细胞在正常情况下和γ射线照射后的凋亡、生长。结果未经γ射线照射的Per2阳性表达的C6细胞较对照组细胞增殖减慢、凋亡率增加,但γ射线照射后的较对照组细胞增殖速度快、凋亡率减少。结论节律基因Per2过表达会增加肿瘤细胞的凋亡,但在射线照射情况下会降低肿瘤细胞对射线的敏感性。     

Exendin-4改善Aβ31-35所致小鼠海马HT22神经细胞Per2节律基因/蛋白异常表达

目的探讨Exendin-4对β淀粉样蛋白31-35(Aβ31-35)所致HT22细胞Per2节律基因/蛋白表达的影响及机制。方法 HT22细胞分为Aβ31-35处理组(0,2.5,5.0,10.0μmol/L),Exendin-4单独处理组,Exendin-4预处理组,Exendin-4+Exendin(9-39)预处理组,Exendin-4+Exendin(9-39)处理组,Exendin(9-39)单独处理组,以完全培养基培养的细胞为对照组。光镜下观察HT22细胞形态,MTT法检测细胞存活率,实时荧光定量PCR检测Per2基因的表达,免疫荧光染色观察GLP-1R及PER2蛋白表达。结果 5,10μmol/L Aβ31-35处理后,细胞存活率较对照组显著降低(P0.05)。Exendin-4预处理后,5μmol/L Aβ31-35引起的细胞形态结构的改变明显改善,细胞存活率显著提高(P0.05)。Exendin-4预处理后,Per2基因/蛋白表达在CT(circadian time)16时较Aβ31-35处理显著提高(P0.05);Exendin-4+Exendin(9-39)处理后,GLP-1R表达在CT16时较Exendin-4处理显著降低(P0.05)。Exendin-4+Exendin(9-39)预处理后,CT16时PER2蛋白荧光强度较Exendin-4预处理显著降低(P0.05)。结论Exendin-4可能通过上调GLP-1R,改善Aβ31-35所致HT22细胞Per2节律基因/蛋白异常表达。     

近日节律基因Period2对紫外线损伤NIH3T3细胞的影响

目的 探讨Period2(Per2)基因对紫外线损伤NIH3T3细胞的影响.方法 将Per2基因插入pcDNA 3.1,构建Per2基因的真核表达质粒,采用脂质体包裹法转导入NIH3T3细胞内.以紫外灯照射Per2基因过表达(pcDNA 3.1-Per2)的NIH3T3细胞、pcDNA 3.1空白组(pcDNA 3.1-vector)细胞和空白对照组细胞;通过流式细胞术和克隆形成试验检测稳定转染Per2阳性表达的NIH3T3细胞的凋亡、生长情况;采用单细胞凝胶电泳技术检测Per2过表达对DNA损伤后修复的影响.结果 紫外线照射后Per2阳性表达的NIH3T3细胞较其对照组细胞增殖速度快、凋亡率减少,单细胞凝胶电泳实验表明紫外线照射后,各组细胞均表现出明显的DNA损伤,但是pcDNA 3.1-Per2转染组均较pcDNA 3.1-vector及空白对照组细胞的彗星细胞出现率和拖尾细胞DNA迁移长度低.结论 节律基因Per2能抑制紫外线对细胞的损伤,其机制可能与Per2促进DNA修复作用有关.     

近日节律基因Per2对人肺癌细胞生长的抑制作用

目的 研究近日节律基因Per2对肺癌细胞(A549)生长的抑制作用及其机制.方法 将pcDNA3.1(+)-Per2转导入A549细胞内,过表达Per2,以空质粒pcDNA3.1(+)为对照.采用MTT和细胞平板集落形成实验检测肺癌细胞的生长情况;通过流式细胞技术观察细胞的凋亡.结果 近日节律基因Per2能够抑制A549细胞的生长和增殖,诱导细胞凋亡.结论 近日节律基因Per2能够抑制肺癌细胞的生长,其机制可能涉及诱导肿瘤细胞的凋亡.     

非小细胞肺癌(NSCLC)p16基因甲基化改变及p16蛋白表达研究

目的分析非小细胞肺癌(NSCLC)及癌周正常肺组织p16基因甲基化改变及p16蛋白表达情况。 方法选取各种病理类型的非小细胞肺癌(NSCLC)标本共40例作为研究对象,同时选取癌组织周围的正常肺组织作为对照。运用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测肺癌标本及周围正常肺组织中p16基因的甲基化改变情况,运用免疫组化方法检测p16蛋白在肺癌标本及周围正常肺组织中的表达情况。 结果①40例肺癌标本中,29例发生了p16基因甲基化。而其周围正常肺组织只有5例发生了p16基因甲基化。二者有明显差异(P<0.01)。②40例肺癌标本中,26例p16蛋白表达降低,而其周围正常肺组织只有5例蛋白表达降低,二者有明显差异(P<0.01)。③29例p16基因发生了甲基化改变的肺癌标本中,有22例发生了p16蛋白表达降低。在11例未发生p16基因甲基化改变的肺癌标本中,有4例发生了p16蛋白表达降低。 结论p16基因甲基化是导致非小细胞肺癌(NSCLC)p16蛋白表达降低的重要机制。     

hPer1相互作用蛋白的筛选

目的 应用酵母双杂交系统筛选血液中与人体生物钟蛋白Per1相互作用的新蛋白.方法 以人Per1的basic HLH-PAS结构域为诱饵,在人血液cDNA文库中筛选与之相互作用的新蛋白.阳性克隆送测序后用生物信息学分析.结果 酵母双杂交文库营养缺陷筛选得到114个阳性克隆,β-半乳糖苷酶检测报告基因获得46个蓝色克隆.通过测序和生物信息学分析,其中之一能与Per1相互作用的蛋白为LSMD1.结论 通过酵母双杂交系统证明Per1能够与LSMD1发生相互作用.     

VEGF、P27蛋白在胆管癌中的表达、CT及临床意义

目的：探讨VEGF、P27蛋白在胆管癌组织中的表达以及临床意义。方法：采用免疫组化法检测46例胆管癌组织及30例正常胆管组织中VEGF、P27蛋白的表达。结果：46例胆管癌中VECF、P27蛋白的阳性表达率分别为63．1％（29／46）和36．9％（17／46）,而在正常胆管组织中分别是16．6％（5／30）和73．3％（22／30）,差异均有统计学意义（P〈0．05）。胆管癌中VEGF、P27蛋白的表达与性别、年龄、肿瘤大小及肿瘤部位无关（P〉0．05）,而与肿瘤分化程度和淋巴结转移有关（P〈0．05）。结论：胆管癌中VEGF的高表达和P27蛋白低表达可能与胆管癌的发生、发展、转移有关,联合检测对胆管癌的预后判断提供帮助。     

肿瘤转移抑制基因nm23在肝外胆管癌中的表达及临床意义

近年来发现ｎｍ 2 3与肿瘤的发生发展有关 ,已有实验表明ｎｍ 2 3表达与肿瘤转移呈负相关 ,是一种转移抑制基因。但ｎｍ 2 3基因与肝外胆管癌 (ＥＣＨＣ)形成、发展、转移关系少有报告 ,我们用免疫组化法检测ＥＣＨＣ及非肿瘤胆管中ｎｍ2 3表达 ,探讨其在肝外胆管癌中的作用。1　资料和方法1 1　资料　 35例肝外胆管癌 ,7例胆总管囊肿和 4例正常胆管组织均取自 1997年～ 2 0 0 1年第四军医大学西京医院外科手术切除或活检标本 ,年龄 31～ 72岁 (中位年龄 5 4岁 ) ;其中女性 19例 ,男性 16例 ,根据国际组织病理学分级标准和Ｈｅｎｓｏｎ分期…     

DEPDC1基因在非肝炎病毒相关性肝细胞癌及癌旁组织中的表达及临床意义

目的 探讨DEPDC1基因与非肝炎病毒相关性肝细胞癌临床病理特征的关系及其对预后判断的意义。方法 收集56例非肝炎病毒相关性肝细胞癌及癌旁组织,实时定量PCR检测癌组织及癌旁组织中DEPDC1蛋白和mRNA的表达,结合临床数据分析DEPDC1表达的意义。结果 DEPDC1蛋白在肝癌组织中的表达(7.83±0.17)显著高于癌旁组织(4.67±0.22),差异比较有统计学意义（P<0.05）;DEPDC1 mRNA在肝癌组织中的表达高于癌旁组织中的表达,高表达率为73.2%(41/56);在DEPDC1高表达组,肿瘤分化程度较低,甲胎蛋白水平较高,微血管癌栓发生率高。结论 DEPDC1分子表达水平与非肝炎病毒相关性肝癌的生物学行为相关,可能位于致癌因素最终的共同通路上。     

Methylation analysis of circadian clock gene promoters in forensic autopsy specimens

DNA methylation in gene promoter regions influences gene expression. Circadian clock genes play an important role in the formation of a biological clock and aberrant methylation of these genes contributes to several disorders. In this study, we examined forensic autopsy specimens to determine whether DNA methylation status in the promoter regions of nine circadian clock genes (Per1, Per2, Per3, Cry1, Cry2, Bmal1, Clock, Tim, and Ck1e) is related to a change in acquired diathesis and/or causes of death. Methylation-specific PCR and direct sequencing methods revealed that the promoters of Per1, Cry2, Bmal1, Clock, and Ck1e were unmethylated in all the forensic autopsy specimens, while the promoters of Per2, Per3, Cry1, and Tim were partially methylated. Methylation status varied between individuals and between tissues in the same patient. A detailed analysis of methylation patterns in the Cry1 promoter region revealed that the patterns also varied between individuals and the Cry1 promoter had highly methylated patterns in two cases that had been exposed to methamphetamine. These results suggest that the methylation status of clock gene promoters varies between individuals. Methamphetamine use may influence methylation in the Cry1 gene promoter region and disturb circadian rhythmicity.     

层粘连蛋白在乙肝相关性肝癌中的表达、分布及意义

 目的 探讨层粘连蛋白(laminin,LN)在乙型肝炎病毒 (hepatitis Bvirus,HBV) 感染相关性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达分布及意义。方法 选取2003-01至2013-05在武警总医院施行了原位肝移植手术的215例HBV相关性HCC伴肝硬化患者的组织标本,应用免疫组化的方法检测LN在肝癌组织和癌旁组织中的表达情况,并以30例正常肝组织和良性肝病组作为对照。结果 LN主要定位于HBV相关性肝癌组织肝窦窦壁,其次为癌旁间质血管与新生血管及细胞膜/浆。LN在肝癌组织中肝窦窦壁和新生血管的阳性表达率为70.23％(151/215),在癌旁组织和良性肝病中肝窦窦壁和新生血管的阳性表达率分别为57.20％(123/215)和13.33％(3/30),LN在癌组织中的表达显著高于其在癌旁及良性肝病中的表达(P=0.000),LN在癌组织中的阳性表达与微卫星灶(P=0.026)、肿瘤数量(P=0.053)、血管侵犯(P=0.005)、TNM分期(P=0.029)显著相关。结论 LN的过表达可能与肝癌的发生发展及侵袭转移相关。
     

乙肝相关性肝癌MLH1与p53的表达及其意义

 目的 探讨MLH1与p53在乙型肝炎病毒 (hepatitis B virus ,HBV) 感染相关性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达及其意义。方法 选取原位肝移植手术术后HBV相关性HCC伴肝硬化患者238例,应用免疫组化的方法检测肝癌组织和癌旁组织中MLH1与p53的表达情况,并以25例正常肝组织和良性肝病组作为对照。结果 MLH1在肝癌组织的阳性表达率为31.09％(74/238),在癌旁组织的表达阳性率为26.05％(62/238),良性肝病对照组阳性表达率为48.00％(12/25),各组表达的差异无统计学意义(P=0.053)。相关性分析显示,MLH1基因的表达与患者肝移植术前AFP含量(r=0.221,P=0.001)及术后的复发(r=-0.159,P=0.014)有相关性,与HCC组织病理学Edmondson分级(P=0.060)及TNM分期(P=0.065)有相关趋势。p53在肝癌组织的表达阳性率为47.06％(112/238),在癌旁组织的表达阳性率为0.84％(2/238),良性肝病对照组均为阴性,p53蛋白的表达在癌组织中明显高于其在癌旁及良性肝病中的表达(P=0.000);p53表达情况与患者肝移植术前AFP含量有相关性(r=0.172,P=0.008),与血管侵犯(P=0.053)及肿瘤数量(P=0.051)有相关趋势。结论 MLH1蛋白表达下调可能与HBV相关性肝癌的发生及术后的复发有关,且MLH1与p53蛋白在肝癌中的表达有一定的关联性。     

肺腺癌多药耐药细胞株特异表达的新基因cDNA片段在肺癌组织中表达的研究

目的　检测人肺腺癌多药耐药细胞株特异表达的新基因cDNA片段在多种肺癌组织及其相应癌旁正常组织中的表达情况。方法　分别运用原位杂交技术和Northernblot方法检测该基因cDNA片段在肺癌组织中的表达及定位情况。结果　组织原位杂交和Northernblot的检测结果均显示 ,在 12例肺腺癌组织中有 6例表达阳性 (5 0 % ) ,在其他肺癌组织及其癌旁正常组织中无表达 ,差异有统计学意义 (P <0 0 5或P <0 0 1)。图像分析显示 ,该基因在肺腺癌组织的相对表达量显著高于其癌旁正常组织 (P <0 0 5 )。结论　新基因片段在部分肺腺癌组织有表达 ,可能与临床上部分肺腺癌化疗效果不佳及MDR的产生有关。     

层粘连蛋白受体Ⅰ与hPeriod1相互作用的研究

目的寻找与节律蛋白hPeriod1（hPer1）相互作用的蛋白，并对筛选出的层粘连蛋白受体Ⅰ（Lamr1）在节律系统中的功能作初步研究。方法分别构建pGAD rec／脑cDNA文库和pGBKT7／hPer1bHLH—PAS重组诱饵蛋白质粒，酵母双杂交筛选下丘脑里与hPer1相互作用的蛋白。利用RT—PCR技术检测新蛋白在脑、肺、心、肝、肾组织中的表达及在SH—SY5Y细胞中的节律性质。通过RNA干扰技术研究新蛋白与hPer1的关系。结果通过酵母双杂交筛选，证明Lamr1能与hPer1蛋白发生相互作用。该蛋白在脑、肺、心、肝、肾组织广泛表达，灰度比较显示经马血清诱导后的SH～SY5Y细胞的hPer1表达呈现近日节律，而Lamr1表达无节律变化。RNA干扰显示hPer1表达下调不影响Lamr1的表达。结论Lamr1能与hPer1蛋白发生相互作用，但其表达在RNA水平无节律变化。Lamr1参与细胞的黏附、转移和侵袭。其前体蛋白作为核蛋白参与细胞蛋白的合成。Lamr1可能参与hPer1相关的生物节律系统的信号传出。     

三阴性乳腺癌中溶酶体相关膜蛋白-2表达水平的临床意义及预后价值

目的 探讨溶酶体关联膜蛋白2(lysosome-associated membrane protein 2,LAMP2)表达水平与三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)患者临床病理特征及其预后的关系。方法 收集2015年1月至2017年1月在新疆医科大学附属肿瘤医院院确诊并行乳腺癌根治术的104例TNBC患者的临床病理资料,调取患者冻存癌组织及癌旁组织标本,使用蛋白质印迹法(Western Blot,WB)检测TNBC癌组织及癌旁组织中LAMP2表达,验证LAMP2表达水平与TNBC患者的临床病理特征及总生存(overall survival,OS)的关系。使用单因素及Cox多因素回归分析TNBC患者的预后因素。结果 WB实验结果显示,LAMP2在TNBC癌组织中表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05)。LAMP2表达与TNBC患者TNM分期、淋巴结转移及组织学分级相关,结果有统计学差异(P均＜0.05)。生存分析结果显示,截至2022年1月25日,LAMP2高表达组5年生存率显著低于低表达组(P< 0.05)。单因素及Cox多因素回归分析：TNM分期及LAMP2表达水平是TNBC患者独立预后因素,结果有统计学差异(P＜0.05)。结论 LAMP2在TNBC癌组织及癌旁组织中差异表达,LAMP2高表达可能与患者TNM分期、淋巴结转移及组织学分级相关,更高的LAMP2的表达可能预示着患者更差的预后。     

多药耐药基因表达与肺癌相关病理因素的关系

目的　探讨多药耐药基因 (MDR 1)表达与肺癌相关病理因素的关系。方法　应用逆转录—多聚酶链反应 (RT RCR)技术对 41例原发性肺癌 ,癌旁组织及 34枚淋巴结中MDR 1基因的表达进行检测分析。结果　肺癌组织及癌旁组织中MDR 1阳性率分别为 5 4%和 10 % ,两者比较具有显著性差异 (P <0 .0 0 1) ;转移淋巴结组织MDR 1阳性率为 5 3% ,而非淋巴结组织中未见MDR 1阳性表达 ;各病理类型中不同分化程度肿瘤的MDR 1阳性分布不同 ,低分化腺癌的MDR 1阳性率较高 (73 % )。术前化疗病例的MDR 1阳性率 (78% )高于未化疗者 (4 7% )。随访发现 ,MDR 1阳性患者肿瘤复发、转移的发生率 (5 0 % )高于MDR 1阴性者 (13 % )。结论　原发性肺癌组织中MDR 1基因表达增高 ,术前化疗可能起诱导作用 ;肺癌组织与其转移淋巴结中MDR 1表达具有一致性 ,MDR 1的阳性表达与肿瘤的大小 ,临床分型 ,TNM分期无明显关系 ,但可能提示肿瘤的恶性行为。