ADAM17对血小板GPIbα 受体的切割作用—— 活血化瘀中药的一个作用靶点？*

GPIbα(glycoprotein Ibα) 是血小板表面重要的黏附受体GPIb-IX-V复合物的组成部分,其细胞外配体结合片段可在基质金属蛋白酶ADAM17/TACE的作用下发生剪切脱落,削弱血管性血友病因子vWF等配体与血小板的结合,是一种重要的血小板功能调控机制。笔者前期研究发现中药赤芍、红花和黄芪中的活性成分芍药苷（PF）、羟基红花黄色素（HSYA）和某些黄芪皂苷单体（AS-III）,以及复方活血胶囊均可激活血管内皮细胞中的ADAM17,诱导血管内皮细胞表面多种炎症相关蛋白（如TNFR1和EGFR配体）的胞外片段脱落,调控炎症过程、激活保护性信号通路。本文通过综述血小板膜受体GPIbα的功能、ADAM17的激活机制及其对血小板GPIbα受体的切割作用,推测血小板ADAM17可能是中药活血化瘀作用的一个重要物质基础,为研究和阐明中药抑制血小板黏附聚集、血栓形成的作用机制提供了新思路。     

血小板膜糖蛋白Ibα受体的酶切机制

当血管内皮细胞受到损伤（如动脉粥样硬化斑块破裂）,或在病理性血流高剪切力作用下,血小板通过表面膜糖蛋白（Glycoprotein,GP）Ib-Ⅸ-V复合物中GPIbα亚基的膜外功能区,与血管内皮表面或血浆中血管性血友病因子（von Wille-brand factor,vWF）结合,     

体外循环对血小板的影响

目的 研究体外循环对血小板数量、功能的影响。方法 普通犬10只,进行体外循环,于体外循环前后选择不同时间点检测血小板计数、ADP诱导的血小板聚集功能、血小板膜表面糖蛋白(GPIb）、血小板膜表面α颗粒膜蛋白(GMP-140）分子数、血浆血栓素B2等血小板获得性损害相关指标并进行统计学分析。结果 体外循环期间血小板数量下降,ADP诱导的血小板聚集功能受损,GPIb分子数减少,GMP-140分子数及血浆血栓素B2浓度均上升。结论 体外循环过程中,血小板数量急剧下降;聚集及粘附功能受损;血小板内α颗粒释放增加;血小板膜GPIb分子数下降;血小板内前列腺素代谢增强。     

血小板膜糖蛋白GPIbα末端重新糖基化的研究

目的 建立冷藏(4℃)保存48 h血小板膜糖蛋白GPIbα(CD42b)末端半乳糖基化及唾液酸化的方法.方法 冷藏保存48 h后,将半乳糖基化底物UDP-gal及唾液酸化底物CMP-NeuAc加入血小板保存袋中,37℃复温lh,分别以FITC-sWGA、FITC-ECA标记血小板膜糖蛋白GPIbα末端β-GlcNAc及β-Gal糖基,流式细胞术检测糖基化效果.以FITC-CD42 b抗体标记血小板膜糖蛋白GPIbα,流式细胞术检测冷藏保存以及糖基化处理对于GPIbα蛋白量的影响.以金属蛋白酶(metalloproteinase,MP)抑制剂GM6001抑制MP对GPIbα的剪切,验证冷藏保存以及糖基化处理对GPIbα的量的影响,并阐明其机制.结果 FITC-sWGA、FITC-ECA标记结果显示,冷藏保存48h后37℃复温1h处理(无论是否加入糖基化底物)可致膜表面GPIbα末端糖基暴露(以FITC荧光强度表示)明显降低,FITC-sWGA荧光强度由1918.2±526.2降至1316.2±368.1,FITC-ECA荧光强度由8036.6±1466.3降至5672.6±1522.7 (P＜0.05);同时可致膜表面GPIbα蛋白量降低,由1582.9±123.1降至1380.7±136.7 (P＜0.05);加入GM6001后,GPIbα蛋白量恢复至对照组水平1602.2±153.2.相对荧光强度分析显示,冷藏保存48h与冷藏保存48h后37℃复温1h处理组FITC-sWGA/CD42b比值分别为2.23±0.56与2.11±0.38,FITC-ECA/CD42b比值分别为2.02±0.36与1.91±0.33,二组之间无统计学差异.结论 冷藏保存48h后37℃复温1h处理可致血小板膜糖蛋白GPIbα量减少;减少系复温处理激活MP所致;通过此处理方式实现血小板糖蛋白GPIbα重新糖基化不可行.     

体外循环对血小板的影响

目的 研究体外循环对血小板数量、功能的影响。方法 普通犬10只，进行体外循环，于体外循环前后选择不同时间点检测血小板计数、ADP诱导的血小板聚集功能，血小板膜表面糖蛋白（GPIb)、血小板膜表面α颗粒膜蛋白（GMP-140）分子数、血浆血栓素B2等血小板获得性损害相关指标并进行统计学分析。结果 体外循环期间血小板数量下降，ADP诱导的血小板聚集功能受损，GPIb分子数减少，GMP-140分子数及血浆血栓素B2浓度均上升。结论 体外循环过程中，血小板数量急剧下降；聚集及粘附功能受损；血小板内α颗粒释放增加；血小板膜GPIb分子数下降；血小板内前列腺素代谢增强。     

活性氧在钙蛋白酶诱导血小板GPIbα酶切中的调控作用

目的探讨活性氧在血小板酶切中的调控作用。方法健康人洗涤血小板N-乙酰半胱氨酸(NAC)、二硫苏糖醇(DTT)、钙调蛋白酶抑制剂I(CII)和钙蛋白酶抑制剂II(MDL28170)和钙离子载体(A23187)凝血酶、钙蛋白酶活化剂(dibucaine)单独或联合处理。流式细胞仪分别进行血小板内ROS水平的变化和细胞膜表面GPIbα表达量的检测。处理好的血小板进SDS-PAGE电泳,NC膜转膜,用针对GPIbα的抗体SZ-2孵育,用胶片显影结果。SPSS软件对实验数据进行统计分析,不同组之间的比较采用one-way ANOVA进行统计分析,P0.05表示有统计学差异。结果 1Dibucaine介导GPIbα酶切的同时,引起了血小板ROS水平的升高。2 DTT和NAC能够明显抑制Dibucaine诱导血小板内ROS水平,同时对Dibucaine诱导GPIbα胞外域的酶切产生抑制作用。3钙蛋白酶抑制剂显著降低A23187、凝血酶、Dibucaine诱导活性氧的产生。结论活化的血小板通过产生内源性活性氧诱导血小板GPIbα的酶切,该通路是依赖钙调蛋白酶的活化而实现的。     

血小板膜糖蛋白受体拮抗剂在冠状动脉疾病应用的进展

1 血小板膜糖蛋白受体 血小板膜表面的糖蛋白受体分两类,即整合素类和非整合素类。整合素类糖蛋白受体由(和(两个亚单位组成,每个亚单位有其独立的基因编码,两者于巨核细胞组合成一个功能单位,参与血小板的粘附与聚集。参与血小板聚集的糖蛋白受体只有GPⅡb/Ⅲa(α_2bβ_3),存在于血小板膜表面,在血小板激活时大量表达,是引起血小板聚集的最后共同通路。玻联蛋白(vitronetin)受体(α_vβ_3)存在于内皮细胞、破骨细胞、血小板等,参与血小板与内皮细胞的相互作用,和血管再狭窄的形成有关(表1)。     

融合蛋白TAP-SSL5对人血小板功能的影响

目的探讨抗炎抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5对人血小板功能的影响。方法采用健康人富含血小板血浆以凝胶过滤法分离得到人血小板。流式细胞仪检测融合蛋白TAP-SSL5或小鼠抗人CD42b(glycoprotein Ibα,GPIbα)单克隆抗体(HIP1)与血小板的结合情况;以人血小板表面P-选择素的表达及PAC-1的结合反映血小板的激活程度;以全血电阻法定量分析TAP-SSL5对人血小板聚集功能的影响;为评价TAP-SSL5的出血风险,进一步观察了TAP-SSL5对小鼠尾部出血时间的影响。结果融合蛋白TAP-SSL5可与血小板结合,并竞争性抑制HIP1与血小板的结合,提示TAP-SSL5可与血小板表面的GPIbα结合,进而抑制GPIbα与vWF的相互作用。但高浓度的TAP-SSL5(终浓度30 mg/L)也能激活血小板,使人血小板表面P-选择素的表达增加(表达阳性率为90.4%)和PAC-1的结合量上升(阳性率为66.3%);终浓度为10、30 mg/L的TAP-SSL5可引起血小板的显著聚集。给小鼠单次尾静脉注射10 mg/kg的TAP-SSL5,可显著延长尾部出血时间,由对照组的(647.1±33.7)s延长至(753.6±127.3)s(P<0.01);而常规剂量组(3 mg/kg TAP-SSL5)尾部出血时间为(612.8±79.1)s,与对照组相比无显著差异(P>0.05)。结论融合蛋白TAP-SSL5保留了SSL5与血小板GPIbα结合的功能,有助于进一步提高TAP-SSL5的抗血栓作用,但同时也导致融合蛋白TAP-SSL5在高浓度情况下可延长出血时间和激活血小板。     

Effect of TAP-SSL5 fusion protein on human platelet functions in vitro and in vivo

目的 探讨抗炎抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5对人血小板功能的影响.方法 采用健康人富含血小板血浆以凝胶过滤法分离得到人血小板.流式细胞仪检测融合蛋白TAP-SSL5或小鼠抗人CD42b( glycoprotein Ibα,GPIbα)单克隆抗体( HIP1)与血小板的结合情况；以人血小板表面P-选择素的表达及PAC-1的结合反映血小板的激活程度；以全血电阻法定量分析TAP-SSL5对人血小板聚集功能的影响；为评价TAP-SSL5的出血风险,进一步观察了TAP-SSL5对小鼠尾部出血时间的影响.结果 融合蛋白TAP-SSL5可与血小板结合,并竞争性抑制HIP1与血小板的结合,提示TAP-SSL5可与血小板表面的GPIbα结合,进而抑制GPIbα与vWF的相互作用.但高浓度的TAP-SSL5(终浓度30m g/L)也能激活血小板,使人血小板表面P-选择素的表达增加(表达阳性率为90.4％)和PAC-1的结合量上升(阳性率为66.3％)；终浓度为10、30 mg/L的TAP-SSL5可引起血小板的显著聚集.给小鼠单次尾静脉注射10mg/kg的TAP-SSL5,可显著延长尾部出血时间,由对照组的(647.1±33.7)s延长至(753.6±127.3)s(P ＜0.01)；而常规剂量组(3 mg/kg TAP-SSL5)尾部出血时间为(612.8±79.1)s,与对照组相比无显著差异(P＞0.05).结论 融合蛋白TAP-SSL5保留了SSL5与血小板GPIbα结合的功能,有助于进一步提高TAP-SSL5的抗血栓作用,但同时也导致融合蛋白TAP-SSL5在高浓度情况下可延长出血时间和激活血小板.     

血小板膜糖蛋白Ⅰ bα基因多态性与心血管疾病

血栓形成是导致冠脉闭塞的主要形式,血小板的突然聚集阻断了动脉的血液供应,导致心肌组织梗死.血小板膜糖蛋白(GP)Ib-Ⅸ-Ⅴ是参与血小板粘附的关键因素.血小板膜糖蛋白GPIbα是血小板膜上含量最多的糖蛋白,可以结合vWF及凝血酶.     

抗血小板膜糖蛋白Ibα胞内段多肽多克隆抗体的制备及初步应用

目的 制备兔抗人血小板膜糖蛋白(GP)Ibα C端557～561氨基酸序列多肽的多克隆抗体,并初步用于人血小板GPIbα C端559位丝氨酸磷酸化状态的检测.方法 应用化学方法合成C-R-G-S-L-P(559位丝氨酸非磷酸化,Ser559)和C-R-G-s(p)-L-P(559位丝氨酸磷酸化,pSer559)多肽.将2种多肽分别与钥孔蜮血蓝蛋白交联后,以皮下注射法分别免疫新西兰大白兔,分离获得2种抗血清(抗Ser559多抗和抗pSer559多抗).应用斑点印迹和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法 对抗血清进行鉴定并检测效价.从人血小板裂解液中分离纯化血小板GPIbα,利用抗Ser559多抗和抗pSer559多抗、采用ELISA方法检测人血小板GPIbαC端559位丝氨酸磷酸化状况.结果 所制备的2种多抗分别特异性识别各自抗原,效价分别为1:32 000和1:64 000.2种多抗均可与纯化的人血小板GPIbα特异结合,表明人血小板GPIbα 559位点丝氨酸存在磷酸化与非磷酸化两种状态.结论 应用人工合成多肽成功制备出2种可特异性识别丝氨酸磷酸化状态的兔抗人血小板GPIbα胞内段多肽多抗,并证明人血小板GPIbαC端559位丝氨酸存在磷酸化状态.     

血小板与血栓性疾病

血小板在止血与血栓形成中具有重要的作用。血小板表面含有丰富的膜糖蛋白,它们介导血小板的粘附、活化和聚集,最终形成血栓,成为血栓性疾病的发病基础。血小板膜糖蛋白的表达和功能受其基因多态性的影响,后者可能是决定血栓性疾病发生的遗传背景之一,许多多态性位点已成为特定人群血栓性疾病发病的危险因子。通过检测血小板的活化程度有助于诊断血栓性疾病,评价疾病的严重程度和转归。应用抗血小板药物可以有效地预防和治疗血栓性疾病,尤其是近年来研制的各种针对血小板膜糖蛋白的单克隆抗体,显示了良好的治疗效果和广阔的应用前景。血小板在止血与血栓形成过程中处于核心地位。流行病学研究显示,血栓形成的危险因素,包括人群的遗传易感性、环境因素的长期影响以及一些疾病如糖尿病、高血压、脂质血症和高同型半胱氨酸血症等都直接或间接与血小板的止血功能有关,提示血小板与血栓性疾病之间的密切关系。正常人20岁开始血管壁就逐渐发生改变,吸烟、高血压和遗传因素会加快血管损害的进程,从而产生动脉粥样硬化的病变。血小板在“巡游”中与血管壁表面的内皮细胞“和平相处”。当血管损伤性病变发生时,内皮细胞缺损,暴露内皮下胶原等组织,即使血管不破,血小板亦会粘附、聚集、活化并在血管内形成止血栓,造成血管栓塞,导致急性心肌梗死、缺血性脑血管病以及肺栓塞的发生。     

冠状动脉介入术后血小板活化的意义

血小板活化在冠心病的发生发展过程中起着非常重要的作用。在正常血液循环中 ,血小板处于静息状态 ,在冠心病的介入治疗过程中 ,由于球囊扩张对血管内膜的损伤和金属支架的刺激作用 ,血管内皮损伤 ,血小板活化、聚集、黏附 ,导致经皮冠状动脉介入 (PCI)后急性血管闭塞、冠状动脉微栓塞以及可能是导致血管再狭窄 (RS)的主要原因。本文对血小板活化与PCI术后并发症的关系综述如下。1　血小板活化的分子标志物静息血小板膜表面有多种糖蛋白 (GP) ,主要有GPIIb/I IIa复合物、GPIb -IX复合物等 ,它们在维持血小板的完整及功能方面起着非…     

大蒜制剂对血小板粘附活性的影响

本实验测定了大蒜制剂对人和兔血小板粘附活性的影响,并观察人血小板膜糖蛋白Ib(GPIb)的变化。结果表明,无论在体内还是体外,给予大蒜制剂均能显著抑制血小板的粘附活性,这种作用与血小板GPIb无关。     

维持性血液透析患者血小板凝血酶受体的表达及其意义

目的观察维持血液透析患者(研究组)血小板蛋白酶激活受体1(PAR1)、蛋白酶激活受体4(PAR4)和糖蛋白Ibα(GPIbα)的表达及其与正常对照者(对照组)之间的差异。方法采用流式细胞术检测两组的PAR1,PAR4和GPIbα的表达,采用比浊法检测其血小板最大聚集率(MAR)。结果维持性血液透析患者血小板GPIbα表达略低于对照组,但差异无统计学意义(P=0.072);血小板PAR1表达高于对照组,血小板MAR低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);相关性分析显示PAR1的表达和血液透析频率之间存在明显正相关(r=0.601,P<0.05)。结论与正常对照者相比,维持性血液透析患者的血小板PAR1表达明显升高,而PAR1的高表达又可引起血小板的进一步活化,从而使血液的高凝状态加剧,可能增加动脉粥样硬化及血管意外发生的概率。     

人血小板膜糖蛋白GPIbα（H1-V289）的原核表达及其生物活性研究

目的获得重组的血小板膜糖蛋白GPIbα的N端片段（1-289氨基酸）,进一步研究其在血栓与止血过程中的生物功能。方法利用质粒pCMV3（编码GPIbαH1-V289）设计引物,构建pQE30-GPIbα（H1-V289）表达载体,转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达蛋白。用Ni-NTA琼脂糖层析柱不同pH值梯度淋洗法纯化蛋白,SDS-PAGE和Western blot鉴定纯化产品纯度和免疫学活性,并观察重组蛋白对瑞斯托霉素和ADP诱导血小板聚集的影响。结果成功获得纯度较高的重组GPIbα（H1-V289）蛋白,浓度为0.6 mg/ml。Western blot检测结果显示,抗GPIbα单抗SZ2能在34 kd区域显示条带。而且纯品能有效抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集,对ADP诱导的反应无抑制作用。结论重组蛋白具有较好的免疫原性和生物活性,并可以大量获得,为开发抗血栓药物奠定了基础。     

血小板膜糖蛋白I ba基因多态性与心血管疾病

血栓形成是导致冠脉闭塞的主要形式,血小板的突然聚集阻断了动脉的血液供应,导致心肌组织梗死。血小板膜糖蛋白(GP)Ib-Ⅸ-Ⅴ是参与血小板粘附的关键因素。血小板膜糖蛋白GP Ibα是血小板膜上含量最多的糖蛋白,可以结合vWF及凝血酶。GP Ibα基因至少有3种多态性:Kozak序列-5T/C多态性、HPA-2a/2b(humanplatelet antigen)多态性和VNTR(variant number of tandemrepeats)多态性。有证据支持Kozak序列-5C、蛋氨酸145和VNTR B/C基因型是心脑血管疾病的危险因素。有必要进行进一步的研究证实GP Ⅰbα基因多态性与心血管疾病的关系。1.GPIbα的结构组成 GP Ib-Ⅸ是血小板膜的主要糖蛋白之一,每个血小板表面约有25 000个GP Ib-Ⅸ分子。GP Ib-Ⅸ-Ⅴ复合物包括两个GP Ib-Ⅸ单位和GPV。GP Ibα(分了量14万)     

糖蛋白Ⅸ基因Ala139→Thr突变导致的巨大血小板综合征

目的：对1例有血小板膜糖蛋白(GP)Ib／Ⅸ缺失的巨大血小板综合征(BSS)患者的GPIb／Ⅸ的基因进行系统的研究。方法：用PCR扩增GPIba．GPIbβ与GPⅨ基因全长编码序列并做DNA序列分析。用限制性内切酶HPYCH4Ⅲ对GPⅨ的基因片断做酶切位点分析。用定点诱变技术制备突变质粒并通过脂质体转染技术转染至中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。用流式细胞术比较野生型与突变CHO细胞表面的GPIb／Ⅸ表达。结果：在GPⅨ cDNA的688bp位置发现G→A突变，导致GPⅨ跨膜区139 Ala(GCC)被Thr(ACC)取代。该突变为一种国际上尚未报道的BSS新的基因突变。限制性酶切位点分析显示患者为纯合子，而家庭的其它成员为杂合子。野生型细胞表面有大量的GPIb／Ⅸ，但突变型细胞几乎无GPIb／Ⅸ表达。结论：研究表明本例BSS患者的发病机理为GPⅨAla139((GCC)→Thr(ACC)突变，并提出GPⅨ跨膜区结构对维持GPTb／Ⅸ在血小板正常表汰与可能中的重要意义。     

出血性血小板病患者凝血酶受体GPIb／IX／V复合物表达研究

目的观察出血性血小板病患者的血小板膜糖蛋白（GP）Ib／IX／V复合物及其组分GP Ibα的表达。方法采用流式细胞术检测68例出血性血小板病患者在出血期的血小板GPIb／IX／V复合物和GP Ibα的表达，采用比浊法检测其血小板最大聚集率（MA），并与33例出血控制者及32例正常健康者比较。结果出血性血小板病患者在出血期间GPIb／IX／V复合物、GP Ibα表达明显低于正常组（P均〈0．01），出血控制者的GPIb／IX／V复合物、GP Ibα表达与正常组比较无显著性差异（P均〉0．05）。结论血小板GPIb／Ⅸ／V复合物作为凝血酶和血管性血友病因子的受体，在出血性血小板病患者体内的表达下降，导致血小板聚集功能障碍，可能是本病反复发作出血倾向的重要原因之一。     

2型糖尿病患者血小板膜糖蛋白Ib/IX/V复合物表达的研究

目的观察2型糖尿病(T2DM)患者血小板膜糖蛋白(GP)Ib/IX/V复合物及其组分GPIbα的表达。方法将51例T2DM患者分为控制良好组(WCP组)和控制不良组(PCP组),并根据有无血管病变分为伴血管病变组(VD组)和不伴血管病变组(NVD组)。同时选取23例健康体检者为正常对照组(NC组)。检测受试者的生化指标、血小板GPIb/IX/V复合物和GPIbα的表达,并采用比浊法检测血小板最大聚集率(MA)。结果(1)PCP组空腹血糖(FPG)和糖化血红蛋白(HbA1c)与NC组、WCP组比较,差别有统计学意义(P<0.01);WCP组和PCP组的空腹胰岛素(FINS)、BMI、血脂(TC、TG、HDL、LDL)与NC组比较,差别有统计学意义(P<0.01)。(2)WCP组、PCP组GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物平均荧光强度(MFI)与NC组比较,差别有统计学意义(P<0.05);且PCP组GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物的MFI与WCP组比较,差别亦有统计学意义(P<0.05)。WCP组、PCP组GPⅠbαMFI与NC组比较,差别有统计学意义(P<0.01);且PCP组GPⅠbαMFI与WCP组比较,差别亦有统计学意义(P<0.01)。(3)相关性分析显示,T2DM患者GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物的MFI与FPG、HbA1c、FINS呈负相关(P<0.05);GPⅠbαMFI与FBG、HbA1c呈负相关(P<0.05)。结论T2DM患者不伴血管病变时即存在血小板活化,发生血管病变后活化更明显,且血小板活化与血糖呈正相关。血小板GPⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物作为凝血酶和血管性血友病因子的受体,可能参与了T2DM血管病变的发生、发展。