水通道蛋白-1在高糖培养人晶状体上皮细胞中的表达

目的研究水通道蛋白-1（AQP-1）在糖尿病性白内障发病机制中的作用。方法从健康的供体眼中分离出人晶状体囊膜,用组织块培养法将人晶状体囊膜分别置于1g/L葡萄糖＋体积分数15%胎牛血清的DMEM培养液中（对照组）或4.5g/L葡萄糖＋15%胎牛血清的DMEM培养液中进行培养（高糖组）。培养3d、28d后观察2组人晶状体上皮细胞（LECs）的生长状态。采用免疫荧光技术和流式细胞术检测AQP-1在人LECs中表达的平均荧光强度,应用流式细胞术检测2组人LECs的凋亡和坏死情况,并进行比较。结果培养第3天2组LECs的生长形态近似,但培养28d高糖组坏死细胞增加。培养3d后高糖组人LECs的AQP-1免疫荧光表达较对照组明显增强,2组间平均荧光强度的差异有统计学意义（t=3.934,P=0.004）,但2组间LECs的凋亡率和坏死率差异均无统计学意义（t=1.681,P=0.131;t=1.064,P=0.318）。培养28d后高糖组人LECs的AQP-1免疫荧光表达较对照组弱,差异有统计学意义（t=3.069,P=0.015）,LECs凋亡率、坏死率较对照组升高,差异均有统计学意义（t=11.213,P〈0.01;t=15.778,P〈0.01）。结论 AQP-1的异常表达在糖尿病性白内障的发生发展中起重要作用。     

线粒体靶向抗氧化剂SS31对人晶状体上皮细胞氧化损伤的影响

背景老视是影响中老年视觉质量和生活质量的主要原因之一,主要与晶状体上皮细胞（LECs）随年龄增长而发生的氧化损伤有关。SS31是线粒体靶向的抗氧化剂,研究其对LECs氧化损伤的保护作用对老视的预防和治疗有重要意义。目的探讨SS31对叔丁基过氧化氢（t-BHP）诱导的人LECs氧化损伤的保护作用。方法用含质量分数10％胎牛血清（FBS）的DMEM低糖培养液对人LECs细胞株HLEB．3进行培养和传代,用200μmol／Lt-BHP处理HLEB一3细胞18h以构建细胞氧化损伤模型。培养的细胞分为空白对照组、t-BHP模型组、10nmol／LSS31±T—BHP组、100nmol／LSS31±T—BHP组、1μmol／LSS31±T—BHP组、10μmol／LSS31±T—BHP组和100μmol／Lt-BHP组,应用噻唑蓝（MTT）法检测各组细胞的存活率,以筛选SS31的最佳药物浓度。再将培养的细胞分为空白对照组、t-BHP模型组和1p~mol／LSS31±t．BHP共培养组。采用JC-1染色法并用流式细胞仪检测各组HLEB一3细胞线粒体膜电位的改变,用MitoSOX染色在荧光显微镜下检测各组活细胞线粒体中产生活性氧簇（ROS）的情况。结果200μmol／Lt-BHP加入培养液作用HLEB一3细胞18h后,与空白对照组的细胞存活率（100±0）％比较,模型组细胞存活率下降至（53．424-2．52）％,不同浓度的SS31组细胞存活率均较模型组明显升高,各组细胞存活率的差异有统计学意义（F=58．349,P〈0．01）,其中以1μmol／LSS31组细胞存活率最高（82．134-3．15）％,明显高于t-BHP模型组,差异有统计学意义（t=28．710,P〈0．05）。各组HLEB-3细胞线粒体膜电位检测结果提示,正常对照组红／绿荧光强度比值为7．07±0．06,t-BHP模型组为4．46±0．14,1μmol／LSS31±t—BHP共培养组为5．76±O．26,3个组间差异有统计学意义（F=172．332,P〈0．01）,空白对照组和1Izmol／LSS31±t—BHP共培养组红／绿荧光强度比值均明显高于t-BHP模型组,差异均有统计学意义（扛2．609、1．303,P〈0．001）。荧光显微镜下显示正常对照组HLEB一3线粒体内仅可见微弱的ROS红色荧光,t-BHP模型组细胞线粒体内ROS荧光明显增强,红色荧光染色的细胞明显增多,而1μmol／LSS31±t—BHP共培养组细胞线粒体内ROS荧光明显弱于t-BHP模型组。结论SS31能有效预防t,BHP诱导的HLEB-3细胞的氧化损伤,可能是治疗老视和其他年龄相关性晶状体疾病一个潜在的靶向治疗手段。     

原花青素对兔氧化损伤性白内障的预防作用

目的观察原花青素（PC）对兔氧化损伤晶状体的形态学及抗氧化系统的影响,探讨PC对晶状体上皮细胞（LECs）的保护作用。方法将正常兔12只24只眼的晶状体分为4组：Feton模型组（氧化损伤组）、维生素E组、PC0.05g/L组、PC0.10g/L组。体外培养晶状体24h后,观察晶状体的混浊情况,分析晶状体的相对灰度值,光镜下观察组织形态学变化。比色法检测各组晶状体总抗氧化能力（T-AOC）、抗氧化酶系统中的谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）活性以及脂质过氧化反应终产物丙二醛（MDA）的含量。结果 Feton模型组显示弥漫性白色混浊;维生素E组周边部出现空泡,晶状体核呈云雾样混浊;PC各质量浓度组可见晶状体赤道部出现少量空泡,皮质轻度混浊。Feton模型组较维生素E组和PC组相对灰度值减小（F=2.866,P=0.045）。Feton模型组显示晶状体前囊膜普遍增厚,LECs增生,排列紊乱,细胞形态出现异常,晶状体纤维板层结构紊乱;维生素E组较Feton模型组损伤轻;PC组较其他2组损伤明显减轻,晶状体前囊膜连续、光滑,无增厚,LECs线状排列,核形态一致,晶状体纤维板层间排列紧密、规整。与Feton模型组和维生素E组相比,PC组GSH-px活性增高、T-AOC增强、MDA的含量降低,差异均有统计学意义（P=0.042,P=0.006,P=0.009）,PC0.10g/L组GSH-px活性、T-AOC均高于PC0.05g/L组（P〈0.05）。结论 PC可提高兔晶状体的抗氧化能力,保护LECs,降低脂质过氧化物水平,减轻晶状体的氧化损伤。     

微小RNA-133b对紫外线诱导的晶状体上皮细胞凋亡的抑制作用及其调控机制

背景 研究证实紫外线B照射是白内障发生的主要原因之一,其机制与晶状体上皮细胞(LECs)凋亡有关.微小RNA-133b(miR-133b)参与氧化应激诱导的LECs凋亡的调控过程,但其是否参与紫外线诱导白内障的发病过程及其机制尚未阐明. 目的 观察miR-133b对紫外线诱导白内障LECs凋亡的抑制作用及其调控机制.方法 将20只8周龄SPF级C57 BL/6小鼠采用随机数字表法分为白内障模型组和正常对照组,其中白内障模型组小鼠用波长302 nm的紫外线直接照射眼部5 min,照射强度为300 W/cm2,每天照射1次,共照射1周;正常对照组小鼠不给于任何干预.于末次照射后24 h处死各组小鼠并摘出10只眼球以制备全眼球切片.取人LECs细胞系(SRA01/04)紫外线照射25 min,并继续培养4h作为紫外线照射组,正常对照组细胞不作任何干预.取紫外线照射模型组细胞接种于96孔板并分为miR-133b模拟物组、模拟物阴性对照组、miR-133b抑制物组和抑制物对照组,分别用lipofectamine2000联合50 nmol/L miR-133b模拟物、miR-133b模拟物对照剂、100 nmol/L miR-133b抑制物或miR-133b抑制物对照剂瞬时转染细胞.采用实时荧光定量PCR法检测小鼠晶状体组织和不同转染组入LECs中miR-133b mRNA及其预测靶基因BCL2L2mRNA的表达以评估转染效率;采用TUNEL凋亡检测试剂盒检测小鼠晶状体组织中LECs和不同转染组人LECs的凋亡情况.结果 正常对照组小鼠晶状体前囊膜LECs排列规则,未发现TUNEL染色阳性细胞,白内障模型组小鼠LECs排列稀疏,可见凋亡细胞呈红色荧光.紫外线照射组细胞凋亡率为(43.90±9.30)％,明显高于正常对照组的(1.08±0.49)％,差异有统计学意义(t=-7.963,P=0.015).白内障模型组小鼠晶状体组织和紫外线照射组细胞中miR-133b mRNA的相对表达量分别低于正常对照组小鼠和正常人LECs,差异均有统计学意义(t=-2.958,P=0.042;t=-6.195,P=0.003).白内障模型组小鼠晶状体组织和紫外线照射组细胞中BCL2L2 mRNA的相对表达量分别高于正常对照组小鼠和正常人LECs,差异均有统计学意义(t=3.761,P=0.020;t 12.437,P=0.000).miR-133b模拟物组人LECs中miR-133b mRNA的相对表达量明显高于miR-133b模拟物对照组,而BCL2L2 mRNA的相对表达量明显低于miR-133b模拟物对照组,差异均有统计学意义(t=10.883、-5 927.617,均P＜0.01);miR-133b抑制物组人LECs中miR-133b mRNA的相对表达量明显低于miR-133b抑制物对照组,而BCL2L2 mRNA的相对表达量明显高于miR-133b抑制物对照组,差异均有统计学意义(t=-1 606.622、17.556,均P＜0.01).miR-133b模拟物组LECs凋亡率明显低于miR-133b模拟物对照组[(17.55±4.24)％与(43.62±9.19)％],miR-133b抑制物组LECs凋亡率为(78.23±12.42)％,明显高于miR-133h抑制物对照组的(48.01±9.68)％,差异均有统计学意义(t=-4.462,P=0.011;t=3.324,P=0.029).结论 miR-133b可防止紫外线照射所致的白内障的形成,其机制可能与靶向负性调控BCL2L2基因从而调控LECs的凋亡过程有关.     

组织型转谷氨酰胺酶抑制剂对TGF—β2诱导人LECs表达纤维连接蛋白和Ⅳ型胶原的影响

目的观察组织型转谷氨酰胺酶（tTG）特异性抑制剂（MDC）对TGF—β2诱导人晶状体上皮细胞（LECs）表达纤维连接蛋白（FN）、Ⅳ型胶原（Col-Ⅳ）的影响。方法将含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养的LECs株HLE—B3传代后分为5组：无血清培养基培养的HLE—B3为正常对照组;加入10μg／LTGF—β2处理的HLE—B3为TGF—β2组;10μg／LTGF—β2与100、200、400μmol／LMDC共同处理的HLE—B3为不同浓度MDC组。用半定量RT—PCR检测tTG、FN、Col-Ⅳ在HLE—B3中的表达,计算A（tTG／β-actin）、A（FN／β-actin）、A（Col-Ⅳ／β-actin）值。结果正常体外培养的HLE-B3中可表达一定量的tTG、FN及Col-Ⅳ。与正常对照组相比,10Ixg／LTGF-β2组中tTG、FN、Col—Ⅳ的表达明显增加（t=33．95,P〈0．01;t=38．24,P〈0．01;t=13．48,P〈0．01）;与TGF—B,组相比,100、200、400μmol／LMDC组中FN和Col-Ⅳ的表达明显减少（P〈0．01）。100、200、400μmol／LMDC组各组间FN和Col—Ⅳ的表达差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论MDC可剂量依赖性地抑制TGF—β2诱导的LECs中FN、Col—Ⅳ表达的增加。tTG可促进人LECs表达FN、Col—Ⅳ,并参与后囊膜混浊（PCO）的形成。     

槲皮素对高压氧诱导的人晶状体上皮细胞凋亡的抑制作用

背景 氧化应激诱导的晶状体上皮细胞( LECs)凋亡与c-Jun氨基末端激酶(JNK)细胞信号通路有关;槲皮素能抑制JNK细胞信号通路并且有显著的抗氧化作用,但其对高压氧诱导的人LECs损伤有无保护作用有待研究. 目的 研究高压氧诱导人LECs凋亡的作用及槲皮素对高压氧处理的人LECs的保护作用,探讨JNK细胞信号通路在上述过程中的作用.方法 人LECs细胞系SRA01/04在MEM培养基中进行培养,传至第3代进行实验.实验细胞分为空白对照组、高压氧组(体积分数99％ O2+体积分数1％ CO2)、高压氧+SP600125组和高压氧+槲皮素组,实验前2h分别在后2个组人LECs培养基中加入20μmol/L JNK2特异性抑制剂(SP600125)或1μmol/L槲皮素预孵育,除空白对照组外,其他3个组于588 kPa高压氧舱处理6h后收集人LECs.应用MTT法检测各组人LECs的细胞活力,以570 nm处吸光度(A)值表示.用流式细胞仪以Annexin V-FITC试剂盒检测人LECs处理后各组细胞的凋亡率,通过Western blot法检测各组人LECs中JNK/p-JNK、c-Jun/p-c-Jun、caspase-3、caspase-9的蛋白表达情况. 结果 实验6h后,高压氧组、高压氧+SP600125组、高压氧+槲皮素组人LECs活力分别为0.450±0.083、0.654±0.079、0.649±0.090,明显低于空白对照组(0.835±0.082),差异均有统计学意义(P=0.001);高压氧+SP600125组、高压氧+槲皮素组人LECs活力明显高于高压氧组(P=0.003、0.002).高压氧组、高压氧+SP600125组、高压氧+槲皮素组人LECs凋亡数分别为19.77±1.44、8.45±0.93、7.79±0.78,明显高于空白对照组的3.17±0.74,差异有统计学意义(P=0.000);高压氧+SP600125组、高压氧+槲皮素组人LECs细胞凋亡数明显少于高压氧组,差异均有统计学意义(P=0.000).同时,高压氧组人LECs中p-JNK、p-c-Jun、caspase-3和caspase-9蛋白的表达量明显高于空白对照组,差异均有统计学意义(P=0.000),而高压氧+SP600125组、高压氧+槲皮素组人LECs中p-JNK、p-c-Jun、caspase-3和caspase-9蛋白的表达量明显低于高压氧组,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 JNK细胞信号通路在高压氧诱导的人LECs凋亡发生发展中起重要作用,SP600125和低浓度的槲皮素能抑制JNK细胞通路和细胞内源性凋亡途径,减轻高压氧引起的人LECs损伤.     

核因子抑制剂对眼表碱烧伤后白内障形成的影响

目的探讨大鼠眼表碱烧伤后应用核因子抑制剂对晶状体上皮细胞（LECs）核转录因子-κB（NF-κB）mRNA表达的影响。方法制造大鼠眼表碱烧伤模型。实验组每天给予PDTC球结膜下注射,对照组每天给予生理盐水球结膜下注射,分别于烧伤后1、3、5、7d处死大鼠,取晶状体行免疫组织化学染色及RT-PCR检测。结果碱烧伤后1d,对照组大鼠晶状体上皮脱落,但实验组大鼠LECs完整。碱烧伤后5～7d,2个组的晶状体上皮和皮质变得致密浓缩。碱烧伤后1～3d,对照组LECs中NF-κB表达的灰度值明显低于核因子抑制剂组（t=2.836,P=0.036;t=4.932,P=0.004）,但对照组NF-κBmRNA的表达（NF-κB/β-actin）明显高于核因子抑制剂组（t=31.563,P=0.000;t=17.837,P=0.000）。碱烧伤5d后,2组间NF-κB及其mRNA表达量的差异均无统计学意义（P〈0.05）。结论眼表碱烧伤可以导致白内障的发生,在碱烧伤后早期使用核因子抑制剂对白内障的形成有一定的抑制作用。     

丝裂素蛋白激活激酶信号途径介导水杨酸钠诱导的人晶状体上皮细胞中HSP27表达

背景热休克蛋白（HSPs）是生物体在各种应激情况下产生的高度保守蛋白,HSP27与人晶状体中α-晶状体蛋白在氨基酸和基因水平上高度同源,其结构和表达的异常与白内障的形成密切相关。此研究先前的研究证实水杨酸钠对H2O2造成的人品状体上皮细胞（LECs）损伤具有保护作用。目的探讨水杨酸钠诱导的人LECs中HSP27的表达及与丝裂素蛋白激活激酶（MAPK）信号途径的关系。方法人LECs—B3系在含质量分数15％胎牛血清的DMEM中进行培养,将不同浓度的水杨酸钠（0～55mmol／L）加入培养基中刺激人LECs不同时间,然后去除刺激再分别培养。在阻断实验中,分别给予P38MAPK、ERK1／2及JNK／SAPK信号通路特异性阻断剂SB20350（10μmol／L）、PD98059（20μmol／L）及SP600125（10μmol／L）预孵育细胞1h,在给予水杨酸钠刺激后检测相关指标,采用Westernblot法检测各种处理情况下人LECs中HSP27的表达,用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测HSP27mRNA的表达;免疫组织化学法检测HSP27蛋白在人LECs中的表达。结果正常人LECs仅有微弱的HSP27表达,35～55mmol／L水杨酸钠刺激人LECs1h去除刺激再培养6h后可使HSP27表达显著增加,与正常对照组比较差异有统计学意义（F=509．953,P〈0．01）;55mmol／L水杨酸钠刺激人LECsI～5h不能诱导HSP27的表达（F=2．119,P〉0．05）,而去除刺激再分别培养6h后可诱导HSP27表达,差异有统计学意义（F：452．534,P〈0．01）;55mmol／L水杨酸钠刺激人LECs1h后去除刺激再培养3h后HSP27表达明显增加,6h达到高峰,直至24h恢复到基础水平,差异有统计学意义（F=419．234,P〈0．01）。水杨酸钠刺激30min时磷酸化p38MAPK表达增加,1h表达显著,各组总体差异有统计学意义（F=865．680,P〈0．01）;磷酸化ERK1／2在水杨酸钠刺激时间内未见升高;去除水杨酸钠刺激再培养1h后开始增加,6h达到高峰,各时间点总体差异有统计学意义（F=388．840,P〈0．01）;水杨酸钠刺激1h及去除刺激再培养过程中未见到磷酸化JNK的表达;加入P38MAPK、ERK1／2特异性阻断剂预处理人LECs1h后可使水杨酸钠诱导的HSP27表达受到显著抑制,加入JNK特异性阻断剂未见对水杨酸钠诱导的HSP27表达产生影响。结论水杨酸钠可诱导人LECs中HSP27的表达,P38MAPK和ERK1／2信号途径促进水杨酸钠诱导的HSP27在人LECs中的表达。     

TGF-β2作用于人晶状体上皮细胞后Smad 4与p-Smad2／3的动态表达

目的观察转化生长因子β2（TGF-β2）作用于人晶状体上皮细胞（LECs）后2类通路转导蛋白Smad4和p-Smad2／3的动态表达变化。方法体外培养的人LECs中添加10ng／mL人TGF—β2,RT-PCR方法测定不同时间点Smadg mRNA的表达,Western blot观察p-Smad2／3的表达,免疫组织化学法观察p-Smad2／3在LECs表达的特点。结果人LECs添加了外源性人TGF-β2,后1h,可出现Smad 4 mRNA表达增高,16h时达峰值（0．72±0．07）,并持续至24h。与对照组比较差异无统计学意义（P〈0．05）。p-Smad2／3在2h后逐渐增强,与对照组比较差异明显,16h达到峰值（2．53g／L）。16h有p-Smad2／3颗粒胞浆表达,24b向核内聚集。结论TGF-β2刺激LECs后,可激活膜受体激活型Smad和通用型Smad,TGF-β2对Smad通路蛋白的激活存在时效关系。TGF—β2可通过特异性激活Smad通路,将信号转导至细胞核内。     

c—myc反义寡核苷酸抑制半乳糖性白内障晶状体上皮细胞凋亡的机制

目的研究c-myc反义寡核苷酸（ASODN）对半乳糖性白内障晶状体上皮细胞（LECs）凋亡的影响。方法将Wistar大鼠按随机数字表法分为生理盐水组、半乳糖组和半乳糖＋c-myc ASODN组,每组36只。半乳糖组及半乳糖＋c—mycASODN组每日球后注射O．2mL20％半乳糖,制作大鼠半乳糖性白内障模型,半乳糖＋c—mycASODN组球后注射半乳糖4h后加注Lipo—mycASODN复合液0．2mL,隔日1次。分别于给药后7、14、24d处死动物,取出晶状体,检测LECs的凋亡情况,采用TUNEL法检测c—mycASODN对半乳糖诱导LECs凋亡的影响,透射电镜下观察LECs超微结构的改变。结果各组在7、14、24d的LECs凋亡率比较,差异均有统计学意义（F7 days=3418．495,P〈0．01;F14 days=1137．555,P〈0．01;F14 days=2198．871,P〈0．01）;24d时半乳糖组LECs的凋亡率为56．57±3．20,生理盐水组为0．37±0．11,差异有统计学意义（P〈0．01）;半乳糖＋c．mycASODN组细胞凋亡率为29．35±1．63,较半乳糖组明显降低（P〈0．05）。透射电镜下观察发现,半乳糖组可见LECs呈凋亡细胞的早期改变;随着高糖诱导时间的延长,凋亡细胞逐渐增多;生理盐水组几乎未见到凋亡细胞;半乳糖＋c—mycASODN组凋亡细胞数量较同期半乳糖组少。结论在白内障形成过程中半乳糖能诱导LECs凋亡,c．mycASODN能够抑制半乳糖诱导的LECs凋亡。     

复方血栓通对人视网膜血管内皮细胞抗氧化损伤的保护作用及其机制

背景氧化损伤是引起内皮细胞功能障碍和细胞死亡的重要因素之一,它还可导致视网膜血管性疾病的发生。复方血栓通对多种视网膜血管性疾病有一定的疗效,但分子机制尚不明确。目的研究复方血栓通对叔丁基过氧化氢（t—BHP）诱导的人视网膜血管内皮细胞（RVECs）氧化损伤的保护作用及其机制。方法分离健康人供体眼的视网膜,用组织块培养法进行人RVECs的原代培养,并用FITC-vwF染色流式细胞仪对培养细胞进行鉴定。取3～5代的细胞用于实验,在含有5×10^4个／L细胞密度的培养孔中分别加入质量浓度为0．0625、0．1250、0．2500、0．5000、1．000g／L复方血栓通溶液,各质量浓度复方血栓通组和t-BHP模型组均加入终浓度为100μmol／Lt-BHP,干预24h后用MTT法检测各组人RVECs的吸光度（A490）值以评估复方血栓通的细胞毒性。t-BHP模型组分别加入终浓度为75、100、200和300μmol／L的t-BHP,相应的复方血栓通组在不同浓度t-BHP造成细胞氧化损伤的同时均加入终质量浓度为0．2500g／L复方血栓通溶液,干预6h后,用MTT法检测复方血栓通对t-BHP引起氧化损伤的作用。用Annexin V—FITC／PI双染流式细胞仪检测各组细胞的凋亡和坏死率;用倒置显微镜和Hoechst33258细胞核染色观察各组细胞的形态学,利用免疫荧光法检测人RVECs中蛋白氧化损伤和DNA氧化损伤的生物标记物硝基酪氨酸（NT）和8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）的表达;Western blot法检测t-BHP损伤6、12、24h各组细胞核转录因子．KB（NF—KB）、p53、bcl-2和bax的蛋白表达水平。结果正常对照组、0．0625、0．1250、0．2500、0．5000、1．000g／L复方血栓通组人RVECs的A490值总体比较差异无统计学意义（F=1．989,P〉0．05）,75、100、200和300μmol／L的t-BHP作用后细胞存活率下降,而相应的复方血栓通组细胞存活率均较t-BHP模型组升高,差异均有统计学意义（t=14．57、13．82、21．51、32．64,P〈0．05）。分别用75、100、200、300μmol／Lt-BHP干预6h后细胞凋亡率和细胞坏死率升高,而细胞正常率均明显低于相应的复方血栓通组,差异均有统计学意义（t=14．908、5．495、17．165、26．330,P〈0．01）。t-BHP模型组随着t-BHP浓度的增加,变形和死亡的人RVECs数目增加,但复方血栓通组细胞形态无明显变化,死亡细胞数减少。与相应的t-BHP模型组相比,不同质量浓度的复方血栓通组人RVECs中NT及8-OHdG的表达明显减少,NF—KB、p53和bax蛋白的表达水平明显降低,而bcl-2蛋白的表达升高,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论复方血栓通可保护人RVECs免受t-BHP诱导的氧化损伤,其机制可能是通过下调细胞中NF—κB、p53和bax蛋白的表达并上调bcl-2蛋白的表达。     

丹参抗晶状体上皮细胞DNA氧化损伤的研究

目的研究丹参对晶状体上皮细胞（LECs）DNA氧化损伤的保护作用。方法应用单细胞凝胶电泳法分别测定0．1、0．2、0．4、0．8mg／mL丹参液对体外培养的LECs氧化损伤的保护作用，并与牛磺酸的保护作用相比较。结果各质量浓度组丹参液培养后的LECs对H2O2的损伤均有抵抗作用，尤其0．8mg／mL质量浓度组的保护作用优于40mmol／L牛磺酸组，除0．1mg／mL丹参组外各处理组细胞的尾长、彗星细胞百分率与H2O2损伤组相比差异有统计学意义（P〈0．01）。结论丹参中的有效成分对体外培养的LECs氧化损伤有明显的保护作用，且呈现质量浓度依赖的量效关系。     

缺氧对人视网膜色素上皮细胞G蛋白信号转导调节子5表达的影响及其可能机制

目的探讨缺氧环境下人视网膜色素上皮（RPE）细胞中G蛋白信号转导调节子5（RGS5）表达的可能机制。方法实验研究。在正常培养的人RPE细胞培养基中加入终浓度为200／μmol／L的CoCl：建立细胞化学缺氧模型。按缺氧时间分为0、1、3、6、12和24h6组,观察RGS5和血管内皮生长因子（VEGF）表达的变化;另选取12和24h作观察点,按处理因素分为缺氧对照组和VEGF抑制剂Bevacizumab处理组,Bevacizumab包括25、100和250肛咖l3种浓度,观察特异性抑制VEGF表达对RGS5表达产生的影响。应用免疫荧光染色法、Western blot和RT-PCR分别检测RGS5及其mRNA和VEGF蛋白及其mRNA的表达。采用Student’s t检验进行统计学分析。结果正常条件下,RGS5主要在人RPE细胞胞浆中表达。与VEGF存在相同表达区域。随着缺氧时间的延长,RPE细胞中RGS5蛋白及其mRNA表达逐渐上调,24h时达高峰（0．932±0．104,t=3．106,P=-0．01l;0．742±0．083,t=2．852,P=-0．017）;VEGF蛋白及其mRNA表达12h达高峰（1．022±0．141,t=4．144,P=0．002;0．491_＋0．063,t=5．707,P〈0．01）,24h时有所下降,但仍高于无缺氧的RPE细胞（0．942±0．125,t=3．306,P=0．008;0．425±0．080,t=3．239,P=0．011）。浓度为100和250μg／ml的Bevacizumab有效抑制VEGF蛋白（￡=2．794,P=0．019;t=3．396,P=0．007）和其mRNA（t=2．823,P=0．018;t=9．584,P〈0．01）表达后,RGS5蛋白（t=2．953,P=0．014;t=2．913,P=0．015）和其mRNA（t=3．009,P=-O．013;t=4．243,P=-0．002）表达也随之受到抑制。结论缺氧条件下人RPE细胞RGS5表达上调,并与VEGF表达具有时相关系;抑制VEGF表达后,RGS5表达随之降低。提示RGS5位于VEGF信号通路下游,可能参与缺血缺氧性RPE相关眼病发生的调控。     

地塞米松对人晶状体上皮细胞核转录因子κB及其抑制蛋白α的表达和细胞凋亡的影响

背景长期全身或眼局部应用糖皮质激素可诱导皮质类固醇性白内障,但其作用机制尚不明确。目的研究地塞米松作用于人晶状体上皮细胞（LECs）后对LECs中核转录因子κB（NF—κB）／NF—κB抑制蛋白κ（IκBκ）表达的影响及LECs凋亡的发生情况,了解皮质类固醇性白内障的发病机制。方法取人LECs系（HLE283）在含质量分数20％胎牛血清的DMEM中进行培养和传代。将不同浓度的地塞米松（0．01、0．1、1、10、100μmol／L）分别加入DMSO无血清DMEM培养液中作为不同浓度地塞米松组,不含地塞米松的DMSO无血清DMEM培养液培养的LECs作为空白对照组。采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）、Western blot、流式细胞术等方法,分别在基因水平、蛋白水平检测LECs中NF—κB／IκB α浓度的改变及LECs凋亡率的变化。结果扩增的基因片段与所设计片段大小一致。地塞米松作用后NF—α核蛋白在LECs中的表达量随着地塞米松浓度的增加而下降,差异有统计学意义（F=36．077,P=0．004）;IκBα蛋白的表达随着地塞米松浓度的增加而上升,差异有统计学意义（F=35．741,P=0．002）。在同浓度地塞米松组,NF—κB核蛋白在LECs中的表达量随作用时间的不同差异有统计学意义（F=16．606,P=0．01）,与地塞米松作用24h时的表达量比较,36h和48h时的NF—κB核蛋白表达量明显下降,差异有统计学意义（P=0．002;P=0．01）。与地塞米松作用24h时的表达量比较,36h和48hIκBα蛋白在LECs中的表达量明显增加,差异均有统计学意义（P=0．014;P=0．002）。流式细胞仪检测显示LECs的凋亡率随着地塞米松浓度的增加明显上升,与空白对照组相比差异有统计学意义（P〈0．05）。结论地塞米松通过上调IκBα的表达而过度抑制了NF—κB的活性,并导致LECs凋亡,其作用呈浓度依赖性,这可能是皮质类固醇性白内障发生发展的细胞学和分子生物学机制之一。     

多西他赛对人晶状体上皮细胞的抑制作用

背景一些已知的抑制人晶状体上皮细胞（LECs）增生的药物由于严重的不良反应限制了其临床应用，寻找高效、安全的抑制LECs增生的药物是防治晶状体后囊膜混浊（PCO）的研究热点。目的探讨多西他赛对LECs增生的影响，并与盐酸表柔比星、盐酸吡柔比星和雷替曲塞的作用进行比较。方法对永生系人LECs细胞株SRAOI／04进行培养及传代，将不同浓度的多西他赛、盐酸表柔比星、盐酸吡柔比星和雷替曲塞加入LECs中分别作用24、48、72h，以MTT法评价不同浓度的多两他赛对人LECs增牛的抑制作用并与其他药物进行比较。用流式细胞术分析不同浓度的多西他赛作用48h后对LECs细胞周期的影响，采片jAnnexinV-FITC／PI标记法和蛋白印迹分析法评估不同浓度的多西他赛作用48h后LECs细胞bcl-2蛋白的表达和凋亡情况。结果8～519pmol／L多西他赛组LECs的增生率为100％，LECs形态正常，而66nmol／L多西他赛组干预48h和72h后LECs的增生率分别为34．7％和27．4％，LECs形态出现异常。23．22～523．56μmol／L雷替曲塞对人LECs的增生无明显抑制作用。多西他赛作用48h和72h时，半数抑制量（IC50）明显低于盐酸吡柔比星和盐酸表柔比星。多西他赛作用LECs48h后，随着多西他赛浓度的增高，处于G2／M期的LECs百分数明显增加，各组的总体差异有统计学意义（F=2633．05，P〈0．01）；8．3nmol／L和266nmol／L多西他赛浓度组干预48h后，LECs的凋亡率分别为22．4％和27．9％，较细胞对照组升高，差异均有统计学意义（χ2=20．00，P〈0．01；χ2=42．68，P〈0．01）。Westernblot检测表明不同浓度多西他赛干预后bcl-2蛋白在LECs中的表达条带均较对照组淡，8．3nmol／L多西他赛组bcl-2蛋白表达降低更为明显。结论多西他赛、盐酸表柔比星和盐酸吡柔比星均可抑制人LECs的增生，而雷替曲塞对人LECs的增生无明显的抑制作用。多西他赛对LECs增生的抑制作用强于其他药物，其作用强度呈浓度和时间依赖性。     

LY294002对bFGF诱导的兔晶状体上皮细胞增生的影响

目的探讨LY294002对碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）诱导的兔晶状体上皮细胞（LECs）增生的影响。方法兔眼LECs经培养后,将10^-8、10^-7、10^-6、10^-5、10^-4mol／LLY294002分别加入LECs培养基中培养48h为LY294002组。另将10^-8、10^-7、10^-6、10^-5、10^-4mol／LLY294002＋bFGF（10mg／L）加入培养基中培养LECs48h。bFGF（10mg／L）诱导LECs增生48h为阳性对照组,空白对照组仅用无血清DMEM。MTT比色法测定吸光度（A）值,分析各组药物对LECs增生的抑制率,流式细胞仪检测各细胞周期的LECs百分率。结果bFGF组与空白对照组相比A值升高,LY294002组随着药物浓度的增加,4值明显降低,差异有统计学意义（P〈0．01）。bFGF＋LY294002组与LY294002组相比,A值下降更明显,差异有统计学意义（P〈0．01）。流式细胞仪分析LY294002对LECs的抑制作用与MTT呈现相同趋势,随着LY294002浓度的增加,处于G0／G1期的LECs逐渐增加（P〈0．01）,而S期和G2／M期逐渐减少。结论LY294002可明显抑制体外培养的bFGF诱导的兔LECs的增生,并呈剂量依赖关系,为临床筛选防治后发性白内障的药物提供依据。     

色素上皮衍生因子对高糖刺激下大鼠视网膜Müller细胞凋亡的影响

目的 探讨色素上皮衍生因子(pigmentepitheliumderivedfactor,PEDF)对高糖刺激下视网膜Müller细胞凋亡的影响,为PEDF治疗糖尿病视网膜病变提供实验依据。方法 实验分3组,分别是正常对照组、高糖模型(HG)组(培养基内含有25mmolL-1的葡萄糖)和PEDF处理高糖模型(HG+PEDF)组(在高糖培养基础上加入25mgL-1的PEDF)。反复胰蛋白酶消化法培养纯化SD大鼠视网膜Müller细胞,免疫荧光双标鉴定纯度;应用倒置相差显微镜观察Müller细胞形态,AnnexinVFITC、PI染色流式细胞技术检测Müller细胞的凋亡率,RTPCR测定Müller细胞bcl2、baxmRNA的表达变化。结果 原代培养的Müller细胞传至3代时纯度为95%以上。正常对照组、HG组、HG+PEDF组Müller细胞早期凋亡率分别为(1.223±0106)%、(2.657±0.120)%、(1.907±0.117)%,baxmRNA相对灰度值分别为0.269±0.041、0.804±0.052、0.528±0.018,bcl2mRNA相对灰度值分别为0.904±0.021、0.413±0015、0.521±0.010。HG组与正常对照组相比,Müller细胞形态发生明显改变,细胞凋亡率显著增加(P<0.001),baxmRNA表达显著升高,bcl2mRNA表达显著降低(均为P<0.01);HG+PEDF组Müller细胞凋亡率较HG组显著降低(P<0.001),baxmRNA表达显著降低,bcl2mRNA表达显著升高(均为P<0.01),但仍有别于正常对照组(均为P<005)。结论 外源给予PEDF可以显著减少高糖刺激引起的Müller细胞的凋亡,对视网膜Müller细胞具有显著的保护作用。     

气／质联用法检测反式花生四烯酸对糖尿病大鼠视网膜微血管的硝化应激损伤评价

背景反式花生四烯酸（TAAs）是NO2介导的花生四烯酸异构化的主要产物,是硝化应激的特异性脂质标志物。NO2介导的损伤是缺血性视网膜病变可能的发病机制之一,先前的研究证实高糖可以引发硝化应激。目的应用气／质联用（GC／MS）法检测TAAs水平以评价高糖引发的硝化应激对视网膜微血管的损害程度。方法2周龄雄性SD大鼠100只随机分为模型组和正常对照组,应用链脲佐菌素（STZ）60mg／kg一次性腹腔注射诱导糖尿病动物模型。应用改良合成法,花生四烯酸（AA）经环氧化及去氧化制得TAAs的标准品14E—AA。GC／MS检测造模后2、4、8、12、16周时血清中TAAs及AA的含量,选择离子79,计算峰面积之比。结果50只大鼠成功建立糖尿病模型,其高血糖状态持续在实验期。14E—AA纯度达到97．3％,可作为标准品使用。糖尿病大鼠造模成功50只,每组10只,造模后2周、4周模型组大鼠血清中TAAs／AA（反式与）顺式之比与正常对照组相比差异无统计学意义（t=-0．376、t=-0．642,P〉0．05）;造模后8、12、16周糖尿病大鼠血清中TAAs／AA值为0．1042、0．1568和0．1895,明显高于对照组的0．0832、0．0910和0．1100,差异均有统计学意义（t=-36．409、t=-166．714、t=-148．212,P〈0．05）。结论糖尿病大鼠血清中TAAs／AA水平随病程的延长而增加,提示硝化应激对视网膜微血管的损伤程度与病程的长短有关。建立GC／MS检测TAAs体系可为缺血性微血管病变的研究提供新的评价指标。     

CTGF作用于体外培养牛晶状体上皮细胞的研究

目的观察结缔组织生长因子（CTGF）在体外培养牛晶状体上皮细胞（LECs）迁移和转分化中的作用。方法将体外培养的第2～3代牛LECs分为对照组和实验组,实验组分别经0.1×10^6、0.5×10^6、1.0×10^6ng/LCTGF处理24h后,采用半定量RT-PCR和Westernblot技术检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA以及蛋白表达的变化。迁移实验中,利用transwell小室对LECs的移行能力进行检测。结果与空白对照组相比,CTGF能够明显促进α-SMAmRNA以及蛋白的表达（F=66.56,P〈0.01;F=65.43,P〈0.01）。迁移实验发现,CTGF能够促进LECs的移行,与空白对照组相比差异有统计学意义（t=51.7,P〈0.01）。结论CTGF以剂量依赖的方式促进牛LECs的分化和迁移,可能在后囊膜混浊（PCO）的LECs移行、转分化以及细胞外基质沉积的过程中发挥重要作用。     

晚期糖基化终末产物受体（RAGE）在糖尿病性白内障和年龄相关性白内障患者前囊膜及人晶状体上皮细胞中的表达

目的　研究晚期糖基化终末产物受体（receptor of advanced glycation endproducts,RAGE）在糖尿病性白内障（diabetic cataract,DC）及年龄相关性白内障（age-related cataract,ARC）患者晶状体前囊膜和不同浓度高糖条件下培养的人晶状体上皮细胞（lens epithelial cells,LECs）中的表达。进一步探讨RAGE在DC患者晶状体前囊膜和人LECs中表达的变化及相互之间的关系。方法　收集DC及ARC患者的晶状体前囊膜,采用Western blot检测RAGE在前囊膜中的表达。ARC患者根据年龄分为:ARC1组（50~69岁）和ARC2组（70~89岁）。DC患者根据年龄及糖化血红蛋白（hemoglobin A1c,HbA1c）水平分为:DC1组（50~69岁,HbA1c为>7.0%~12.0%）、DC2组（50~69岁,HbA1c为4.0%~7.0%）、DC3组（70~89岁,HbA1c为>7.0%~12.0%）、DC4组（70~89岁,HbA1c为4.0%~7.0%）。将培养的人LECs根据培养液不同分为5组,A0组:采用DMEM 培养液;A1组:添加10 mmol·L^-1葡萄糖的培养液;A2组:添加20 mmol·L^-1葡萄糖的培养液;A3组:添加30 mmol·L^-1葡萄糖的培养液;A4组:添加30 mmol·L^-1甘露醇的培养液。Western blot检测以上各组中RAGE的表达,流式细胞仪检测以上各组人LECs凋亡率。结果　RAGE在前囊膜的表达程度:DC1组高于DC2组,DC3组高于DC4组,均高于相应年龄的ARC患者。体外实验中,RAGE在A1、A2、A3组中表达高于A0组,差异有统计学意义（P=0.001）,也高于A4组,差异有统计学意义（P<0.001）;A1、A2、A3组人LECs凋亡率高于A0组,差异有统计学意义（P=0.002）,也高于A4组,差异有统计学意义（P=0.002）;A1、A2、A3组人LECs凋亡率与培养液葡萄糖浓度呈正相关（r=0.892,P<0.001）。结论　RAGE在DC患者晶状体前囊膜的表达高于ARC患者,同等年龄下HbA1c水平越高RAGE表达越多;葡萄糖浓度越高,人LECs的RAGE表达越多,人LECs凋亡率越高。推测RAGE可能参与了白内障的形成,并加速了糖尿病患者的白内障进展。