逆转录病毒介导系统感染原代培养人皮肤成纤维细胞

目的利用包装生产逆转录病毒感染原代培养人皮肤成纤维细胞,为细胞重编程提供技术保证。方法利用组织块贴壁法体外原代培养人皮肤成纤维细胞。包装生产携带绿色荧光蛋白GFP基因的逆转录病毒上清液。收集逆转录病毒上清液感染原代培养人皮肤成纤维细胞,利用荧光显微镜观察逆转录病毒感染成纤维细胞。结果体外成功原代培养出人皮肤成纤维细胞。293T细胞包装生产携带GFP基因的逆转录病毒上清液。包装生产后逆转录病毒成功地感染原代培养人皮肤成纤维细胞。结论逆转录病毒介导系统是人皮肤成纤维细胞重编程的有效基因转移载体。     

体外原代培养脐带基质间充质细胞和人皮肤成纤维细胞

目的探讨体外原代培养脐带基质间充质细胞(UMC)和人皮肤成纤维细胞(HSF)的方法。方法用Ⅳ型胶原蛋白酶、Ⅰ型脱氧核糖核酸酶和0.25%胰蛋白酶消化法原代分离培养UMC细胞,用组织块贴壁法原代分离培养HSF细胞,镜下观察细胞的培养过程和生长状态。结果脐带组织分离培养第3天,有少量UMC贴壁生长,细胞膜周围有折光性,形态类似于成纤维细胞;皮肤组织块贴壁培养第7天,有HSF爬出,呈长梭形、不规则三角形。随着细胞培养时间延长,UMC和HSF数量逐渐增多,细胞生长状态良好。结论应用酶消化法和组织块贴壁法可成功分离培养出UMC和HSF。     

Sox2、Klf4、Oct4、c—Myc基因重编程人皮肤成纤维细胞的实验研究

目的探讨利用Sox2、Klf4、Oct4、c—Myc基因能否将人皮肤成纤维细胞（HSF）编程为诱导性多潜能干细胞（iPS）。方法①利用组织块贴壁法原代分离培养HSF细胞。②包装生产携带Sox2、Klf4、Oct4、c—Myc基因的逆转录病毒上清液感染HSF细胞。③病毒感染后HSF细胞培养,镜下观察HSF细胞形态学变化。④应用细胞碱性磷酸酶（AP）染色检测细胞基因表达量和体内分化畸胎瘤实验对细胞生物学特性进行鉴定。结果原代HSF细胞编程后形态类似于胚胎干细胞,细胞AP染色阳性,内源多能基因Oct4、Sox2、Nanog、Rexl表达量增高,细胞体内可分化为畸胎瘤。结论利用Sox2、Klf4、Octd、c．Myc基因可将HSF细胞编程为iPS细胞。     

脑组织匀浆诱导人脐带间充质干细胞分化为神经样细胞

目的模拟体内微环境,研究人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)在脑组织匀浆诱导下向神经样细胞的分化程度。方法体外分离、培养、扩增hUCMSCs,流式细胞仪鉴定其表面抗原CD29、CD44、CD45、CD105、CD34、HLA-DR;制备大鼠脑组织匀浆与hUCMSCs共培养,在倒置显微镜下观察细胞形态变化,并应用免疫细胞化学技术检测共培养3 d后细胞内神经干细胞表面标志物巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。结果脑组织匀浆培养hUCMSCs后,细胞表达nestin、NSE及GFAP,而正常培养的hUCMSCs不表达。结论脑组织匀浆可以诱导hUCMSCs向神经样细胞分化。     

人脐带间充质干细胞在心力衰竭领域的临床研究进展

心力衰竭(HF)是各种心血管疾病的终末阶段,具有高患病率和病死率的流行病学特点.庞大的患者群体(我国约450万)和低生存率的预后特征给该疾病的治疗带来了巨大的挑战.目前HF的治疗包括药物治疗和非药物治疗.非药物治疗主要有心脏移植、左心室辅助装置置入术及细胞治疗等.近年来,包括间充质干细胞治疗在内的多种细胞疗法在修复受损...     

早产胎儿脐血和脐带间充质干细胞分离培养的比较

目的对比早产胎儿脐血和脐带间充质于细胞（MSCs）的培养成功率,探讨早产胎儿MSCs获取的最佳途径。方法无菌条件下采集早产胎儿（不足37周）脐血,密度梯度离心法分离单个核细胞,采用贴壁培养法获得脐血MSCs;将脐带剪成1mm^3大小组织块,采用组织块贴壁法获得脐带MSCs;分别观察脐血和脐带MSCs的生物学特性,免疫荧光法检测MSCs表面标记物的表达情况。结果采用Mesencult^TM培养基,早产胎儿脐血MSCs培养成功率为100％,脐带MSCs培养成功率为67％,明显低于脐血MSCs;早产胎儿脐血和脐带MSCs均表达CD29、CD44和CD90不表达造血干细胞表面标志CD34。结论早产胎儿脐血中较易获得MSCs,为临床移植治疗提供了理想的细胞来源。     

异基因脐带间充质干细胞移植治疗类风湿关节炎疗效及安全性

目的探讨异基因脐带间充质干细胞（uhcMSC）移植治疗难治性类风湿关节炎（RA）的疗效及安全性。方法从足月顺产供者脐带中分离培养MSC,给予3例RA患者行MSCs移植治疗,移植细胞数（1×106/kg体重）。评价患者移植前后的临床表现和实验室检查指标的改变。结果异基因MSC移植后,3例RA患者随访9～11个月,所有患者均无移植相关并发症。移植后1月疾病活动评分（DAS-28）由5.13降低为2.16（n=3）,1例血液系统受累患者血细胞（中性粒细胞、红细胞、血小板）均上升。移植前后比较抗环瓜氨酸（CCP）抗体滴度降低。1例患者移植前后比较Th17细胞明显升高,Treg细胞降低。结论异基因脐带MSC移植治疗难治性RA有效、安全。uhcMSC取材方便,扩增迅速,输注安全经济。     

人脐带间充质干细胞向心肌样细胞定向分化及其临床移植研究进展

人脐带间充质干细胞是一种非常有潜力的干细胞资源,在一定条件下可分化为骨、软骨、脂肪、神经、肝、心肌等多种组织细胞。因与其他来源干细胞相比,其资源丰富,不存在伦理道德问题,免疫原性弱,并已应用临床移植研究。现就人脐带间充质干细胞向心肌细胞的定向分化及其临床移植应用研究做简要综述。     

人脐带间充质干细胞体外培养过程中的表观遗传学改变

目的分离、培养人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs),并探讨体外培养过程中表观遗传学的改变。方法随机选取足月顺产健康胎儿脐带,采取复合酶消化法从脐带胶质中获得hUC-MSCs。流式细胞术检测细胞表面标志物。分化培养基诱导hUC-MSCs分化。β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老。甲基化特异性PCR(MSP)检测hUC-MSCs在不同培养时期特定基因的甲基化状态。蛋白免疫印记(Western blot)检测hUC-MSCs在不同培养时期MGMT基因的蛋白表达。结果按整根脐带30 cm计算,可收获(3～6)×106hUC-MSCs。培养的hUC-MSCs高表达CD29、CD73、CD105、CD90和CD44,不表达CD45、CD34和HLA-DR。hUC-MSCs可定向分化为成脂、成骨和成软骨细胞。随着细胞的传代,衰老细胞占细胞总数的比例增加。培养后期的hUC-MSCs出现MGMT基因甲基化。结论复合酶消化法可从脐带胶质中获得具有间充质干细胞(MSC)特性的细胞。随着传代次数的增多,DNA修复基因MGMT出现甲基化,可能参与hUC-MSCs衰老调控。     

c-Met基因过表达脐带间充质干细胞株的构建*

目的 建立c-Met慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞（hUMSC）,为治疗肝衰竭作为种子细胞。方法 培养hUMSC,经流式细胞技术检测细胞表面表型,转染c-Met慢病毒载体,在荧光显微镜下观察转染效率,确定最佳多重感染复数（MOI）。采用嘌呤霉素抗性筛选稳定表达c-Met的hUMSC细胞系,采用Western-blot法检测细胞c-met蛋白表达量。结果 P5代细胞高表达CD44、CD90和CD105抗原,不表达CD31、CD45和CD34相关造血细胞抗原,符合人脐带间充质干细胞的特性;构建成功的c-Met慢病毒载体转染人脐带间充质干细胞最佳MOI=80,经嘌呤霉素筛药,在荧光显微镜下观察发现荧光阳性率为100%,且经Western-blot法检测证实该细胞过表达c-Met蛋白。结论 成功构建过表达c-Met基因的脐带间充质干细胞,为进一步实验打下了基础。     

还原型谷胱甘肽对脐带间质干细胞生物学特性的影响

目的 探讨还原型谷胱甘肽(GSH)对脐带间质干细胞生物学特性的影响.方法 用MTT法检测脐带间质干细胞活力、细胞计数法绘制细胞生长曲线、流式细胞仪检测细胞周期和表面标志,成骨诱导后组织化学检测碱性磷酸酶(ALP)表达.结果 GSH浓度低于0.15 mg/ml时可促进脐带间质干细胞的增殖,高于此浓度时对细胞的抑制作用随浓度加大而逐步增强.GSH可缩短脐带间质干细胞到达生长平台期的时间并延长细胞传代的代数,细胞周期检测显示S期显著增加,同时GSH对脐带间质干细胞表面标志无明显影响,成骨诱导分化后ALP表达阳性率无明显改变.结论 低浓度GSH可促进脐带间质干细胞的增殖,0.15 mg/ml浓度可以达到最佳促进增殖效果,同时对细胞表面标志与向成骨细胞分化的能力无明显影响,可以用于体外对脐带间质干细胞的扩增.     

脐带间充质干细胞 nestin mRNA表达的研究

目的：从基因角度求证脐带间充质干细胞（MSCs）神经巢蛋白nestin mRNA表达。方法取新鲜脐带组织行MSCs分离、培养及鉴定。采用胰酶消化法计数MSCs,流式细胞仪检测细胞活性,提取原代、一代、二代细胞的mR-NA,采用实时荧光定量PCR法检测nestin mRNA表达。结果脐带中分离出的细胞贴壁生长状况较好,其中大部分细胞呈梭形生长,传代后细胞与原代细胞生长形态相似,生长加快;个别细胞呈神经样生长。 MSCs呈nestin mRNA阳性表达,其表达量在传代后有明显减少;与nestin蛋白在神经前体细胞向神经细胞分化时的变化一致。结论脐带MSCs存在nestin mRNA表达;传代后nestin mRNA表达量虽减小,但仍可作为备选种子细胞进行移植。     

脐血间充质干细胞的体外扩增及向类肝细胞分化的实验研究

目的探讨人脐带血间充质干细胞（UBC-MSCs）向类肝细胞定向分化的可能性。方法无菌条件下采集新生儿脐带血75份,采用密度梯度离心法与直接贴壁法相结合分离UBC－MSCs,体外培养传代,获得第4代集落生长细胞作流式细胞仪表面抗原测定,并应用a－FGF、b－FGF、HGF、OSM等多种成分,分阶段向肝细胞定向诱导分化。倒置相差显微镜观察细胞形态变化,取诱导后4周和6周的细胞分别采用RT-PCR法检测ALB、AFP和CK－19基因mRNA水平,分析类肝细胞诱导表达情况。结果按10。／ml接种,用含15％FBS的DMEM／F12培养基培养可成功获取UBC—MSCs。细胞呈长梭形,细胞表面抗原测定显示强烈表达CD29、CD44,而不表达造血细胞的标志物CD34、CD45。分阶段诱导6周后,细胞形态呈多角形,并检测到肝细胞表面标志物白蛋白、AFP和CK-19。结论新生儿脐血中可分离出MSCs,并可在体外进行培养扩增,分阶段诱导可分化为类肝细胞。     

肝衰竭患者血清诱导脐血间充质干细胞表达白蛋白和甲胎蛋白的研究

目的：建立分离、纯化脐血间充质干细胞（HUMSCs）的方法,探讨肝衰竭患者血清对HUMSCs的诱导分化作用。方法：采用密度梯度离心和贴壁培养法相结合分离培养HUMSCs并鉴定,以舍重型肝病患者血清的低糖DMEM培养基诱导培养,不同时间点采用免疫组织化学方法（sP）检测甲胎蛋白（AFP）和白蛋白（Alb）的表达。结果：分离获得高纯度的HUMSCs,HUMSCs高表达CD44和CD29,不表达CD34,可以分化为脂肪细胞;SP结果表明,对照组HUMSCs不表达AFP和Alb,肝衰竭患者血清在培养7天时,大部分细胞呈AFP阳性表达（75．2±7．8）％,与对照组比较差异有显著性意义（P〈0．05）;诱导培养14天、21天和28天时AFP表达阳性率分别为（40．1±8．2）％、（10．4±3．5）％和（6．8±2．3）％;肝衰竭患者血清培养7天时仅少数细胞内可见Alb表达,表达阳性率为（9．8±2．7）％;培养14天、21天和28天,Alb表达阳性率分别为（25．4±5．2）％、（67．2±7．8）％和（83．4±7．9）％,与对照组比较差异有显著性意义（P〈0．05）。结论：密度梯度离心和贴壁培养法相结合是一种较好的分离纯化HUMSCs的方法;肝衰竭患者血清可以诱导HUMSCs表达AFP和Alb。     

Mid-trimester fetal blood-derived adherent cells share characteristics similar to mesenchymal stem cells but full-term umbilical cord blood does not

Stem cell transplantation is a promising treatment for many conditions. Although stem cells can be isolated from many tissues, blood is the ideal source of these cells due to the ease of collection. Mesenchymal stem cells (MSCs) have been paid increased attention because of their powerful proliferation and pluripotent differentiating ability. But whether MSCs reside in blood (newborn umbilical cord blood and fetal or adult peripheral blood) is also debatable. The present study showed that MSC-like cells could be isolated and expanded from 16-26 weeks fetal blood but were not acquired efficiently from full-term infants' umbilical cord blood (UCB). Adherent cells separated from postnatal UCB were heterogeneous in cell morphology. Their proliferation capacity was limited and they were mainly CD45+, which indicated their haematopoietic derivation. On the contrary, MSC-like cells shared a similar phenotype to bone marrow MSCs. They were CD34- CD45- CD44+ CD71+ CD90+ CD105+. They could be induced to differentiate into osteogenic, adipogenic and neural lineage cells. Single cell clones also showed similar phenotype and differentiation ability. Our results suggest that early fetal blood is rich in MSCs but term UCB is not.     

体外诱导人脐带间充质干细胞定向分化为肝细胞的研究

目的对肝组织匀浆上清液(LHS)体外诱导人脐带间充质干细胞(hUCMSC)定向分化为肝细胞的功能特性进行检测。方法选取第3代hUCMSC,采用LHS作为诱导培养基,实验分为对照组和LHS处理诱导组,每组有3、5、7 d三个时间点;诱导后对细胞进行AFP、CK1 8、TPH2、CYP3A4、Alb、HGF的免疫荧光细胞化学染色;并测定诱导前后CYP3A酶活性、Alb、HGF和尿素的分泌量。结果 LHS诱导3 d后细胞表达肝特异性蛋白AFP、CK18、TPH2、CYP3A4、Alb和HGF;对照组hUCMSC不同时间点CYP3A酶特异性代谢底物咪达唑仑的代谢量为0.026~0.03 0ng/mg,LHS诱导3、5和7 d后细胞代谢量分别为(30.14±1.19)、(50.20±6.24)和(120.85±15.52)ng/mg,与对照组相比显著升高(P0.01);对照组细胞3、5和7 d HGF的分泌量分别为(0.24±0.14)、(0.42±0.20)和(0.18±0.15)ng/mg,LHS诱导后细胞HGF的分泌量分别为(4.06±1.35)、(3.35±0.17)和(3.83±0.42)ng/mg,与对照组相比显著升高(P0.01);LHS诱导后各组细胞尿素分泌量增加14倍以上,与对照组相比显著升高(P0.01);对照组3、5和7 d Alb的分泌量分别为(22.66±2.99)、(16.99±2.90)和(15.37±1.86)μg/mg,诱导3、5和7 d后Alb的分泌量分别为(36.40±3.53)、(46.66±2.50)和(54.82±4.28)μg/mg,与对照组相比显著升高(P0.05或P0.01)。结论在体外经LHS诱导后,hUCMSC能够分化为具有成熟肝细胞功能的肝细胞。