生物素标记HBV DNA探针在肝石蜡切片上作原位杂交技术的研究——各型肝病时HBV DNA的定位及形态

报告用生物素标记HBV DNA探针原位杂交技术,现察75例慢性肝病者肝石蜡切片上HBV DNA定位及形态。共检出HBV DNA阳性者25/75例(33.33％)。其中:CPH2/7例、CAH10/21例、肝硬化0/3例、SS4/11例、无症状HBsAg携带者4/21例和HCC5/12例。HBVDNA在肝切片上呈棕黄色粗颗粒状,主要分布于肝细胞浆内,个别核内亦可见少数浅染棕黄色颗粒。阳性肝细胞分布有三种形式:Ⅰ型(弥漫型):25例中有4例(16％),Ⅱ型(局灶型):20例(80％),Ⅲ型(散在型):仅1例(4％)。颗粒在胞浆内亦有a型(密集)和b型(稀疏)之分。各型乙型肝炎HBV DNA在肝切片上定位与分布不完全相同,可能表示不同的病毒感染状态和复制的活跃程度。HCC只在癌旁肝组织内查见HBV DNA。     

原发型肝癌的肝内HBVDNA整合状况

应用~(32)P标记的克隆HBVDNA片段探针对30例原发型肝癌病人的肝内组织进行了DNA电泳转移Southern杂交。结果检出HBVDNA整合者21例(70％),其中癌组织整合者18例(60％),癌外组织整合者16例(53％),双份组织均整合者13例(43％)。杂交带分析发现,不同例和同例肝内不同组织的HBVDNA整合模式都不相同,提示整合具随机性并可能发生整合和/或侧翼序列的基因重排。由于探针含HBV基因组中1.4～2.8kb的DNA顺序,故结果实际反映S基因及其下游增强子的整合状况。基因重排和增强子插入整合并活化细胞原癌基因的致癌机理在本文也进行了初步探讨。     

腮腺组织HBsAg、HBcAg和HBVDNA的检测

目的 观察乙型肝炎病毒感染者腮腺组织中HBsAg、HBcAg和HBV DNA的表达情况。方法 对22例血清学HBV标志阳性的腮腺肿瘤患者用免疫组化方法检测腮腺活检组织HBsAg、HBcAg的表达；应用PCR技术对免疫组化阳性病例进一步检测腮腺组织HBV DNA。结果 22例腮腺组织中HBsAg阳性10例。阳性率为45．5％；HBcAg阳性9例，阳性率为40．9％。总阳性率为54．5％(12／22)，其中HBsAg和HBcAg同时阳性7例。占31．8％。阳性信号呈棕褐色细颗粒状，弥漫分布于腮腺腺泡细胞。12例免疫组化阳性患者检出HBV DNA7例，阳性率为58．3％。结论 腮腺组织对HBV有较强的亲和力，唾液中HBV的出现可能源于受染的唾液腺组织，含HBV的唾液是乙型肝炎生活接触性传播的媒介。     

原发性肝癌内HBV DNA及HBAg的分布与意义

采用原位分子杂交和免疫组化及双标记技术,对44例原发性肝细胞肝癌及痛旁肝组织进行了乙型肝炎病毒DNA及其表达产物x抗原、核心抗原检测。癌组织中HBV DNA、HBxAg、HBcAg检出率分别为70.5％、65.9％及20.5％;癌旁肝组织依次为76.5％、76.5％及29.4％。HBV DNA及HBxAg主要位于肝细胞浆中,在HBcAg阳性组中的检出率高于HBcAg阴性组(P<0.05)。9例枯否氏细胞浆有HBxAg检出。HBVDNA在癌及癌旁组织中的检出有“伴随现象”。HBcAg多位于核内,部分为核浆型,且总是伴随HBV DNA和(或)HBxAe检出,无一例单独检出HBcAg者。此外,HBxAg可由肝内游离型HBV DNA所表达;肝内核型或浆型HBcAg均可反映HBV的复制。因此,肝内HBxAg的检测可作为HBV感染的灵敏指标之一,进一步证实HBV感染与HCC的发生有密切关系。     

血清和肝组织内HBV复制状态与肝脏病变活动性关系的研究

经病理确诊的47例乙型肝炎患者血清中HBV DNA、HBeAg的检出率在各型肝炎之间无显著性差异(P>0.05)。肝组织HBsAg检出率为76.6％,其形态呈包涵体型、弥漫型和膜型为主分布者分别是36.1％、55.6％和8.3％。HBsAg呈弥漫型分布者各类型肝炎之间无显著性差异(P>0.05),提示肝细胞内HBsAg的表达仅反映HBV复制,而与肝组织病变无关。肝组织HBcAg检出率为27.7％,其形态呈核型和浆型分布者分别占38.5％和61.5％,浆型主要见于炎症明显的肝细胞内,而核型刚见于病变较轻的肝细胞中,反映了HBcAg的表达与肝组织活动性病变有关。     

原位杂交研究慢性乙型肝炎病毒感染者肝组织内HBV DNA清除模式

用地高辛素探针原位杂交技术研究52例慢性HBV感染者肝内HBV DNA分布,发现在病毒高复制期,HBV DNA阳性肝细胞以弥漫性分布为主,肝细胞HBV DNA表型为胞浆型和核型,在病毒低复制期肝内HBV DNA阳性肝细胞以小叶聚集分布为主,多分布于灶性坏死和碎片状坏死区,在病毒非复制期,HBV DNA阳性肝细胞以局灶性分布为主,表型多为包涵体型和核型。提示在漫长的HBV感染过程中,肝内HBV DNA阳性肝细胞的分布经历弥漫性—小叶聚集性—局灶性的演变过程,该过程反映肝组织内HBV的清除模式。HBeAg(+)的慢性HBV无症状感染者肝组织病变轻可能是由于HBV DNA易装配为完整的病毒排出肝细胞的结果。说明免疫活性细胞攻击的靶细胞主要是含有HBV DNA的肝细胞。     

原发型肝癌的HBV感染及肝内的HBVDNA

应用~(32)P标记的3.2kb克隆HBVDNA探针对36例原发型肝癌患者的血清和肝组织作HBVDNA斑点杂交,结果:血清、肝癌组织、癌近邻肝组织和癌远邻肝组织的阳性率分别为56％、91％88％和80％,皆高于国内外一些同类研究,说明其HBV感染率比一般认为的还要常见,尽管肝内良恶组织的HBV DNA阳性率未见显著差别。此外,尚对HBV6项血清标记作了检测,结果HBsAg和PHSA·Re的阳性率均较高,分别为83％和75％,说明多数病例的HBV感染仍然处于病毒活动复制阶段。由于血清HBsAb阳性者,肝内HBV DNA全阳性,提示HCC阶段的“保护性抗体”并不能清除病毒感染。     

慢性HBV感染患者精子中HBVDNA存在研究的初步报告

用Southern Blot方法,我们研究了13份慢性HBV感染患者(8份慢迁旰,5份慢活肝)和2份对照精液标本中HBV DNA存在状况。提取物一半用限制酶HindⅢ消化,各行琼脂电泳,转移到纤维膜上,然后用~(32)P—HBV—DNA探针分子杂交。在4份精子內检出HBV DNA,3份为游离形式,1份为整合形式。结果表明HBV DNA可以存在精于内,游离状态HBV DNA提示有传染性、整合序列HBV DNA的存在提示有通过生殖细胞遗传的可能。     

电泳印迹和分子杂交技术在肝内HBV DNA研究中的应用

应用DNA电泳转移、生物素探针Southern杂交及不同探针重复杂交等3项新技术研究肝炎肝癌的肝内HBV DNA分子状态。经过方法学比较以电泳印迹取代毛细渗吸法对65例肝炎肝癌病人的101份肝内组织DNA进行尼龙膜快速转移和HBV DNA杂交,结果检出HBV DNA分子状态里整合型15份、游离型31份、整合型合并游离型30份。其中12例乙型肝炎标本为经生物素探针杂交检测,结果全部检出游离型HBV DNA。还有3例乙型肝炎标本和2例其它肝炎标本为经重复杂交检测,即先用~(32)P探针杂交继去探针再用生物素探针杂交,结果乙型肝炎标本两次杂交HBV DNA都阳性,其它肝炎标本两次均阴性。阳性者表现为3.2kb和2.3kb电泳位置呈现杂交带,代表HBV之松弛环状和超螺旋状结构。由于两种探针各含不同序列,故结果可对待检基因进行初步序列分析。本实验表明,上述3项技术对临床医学研究有广泛的应用价值。     

肝细胞内HBV DNA原位杂交的研究

应用生物素标记HBV DNA(乙肝病毒脱氧核糖核酸)作探针,对129例肝病患者肝组织作原位杂交研究。HBV DNA在慢性活动性肝炎中检出率最高(80.7％),显著高于肝硬化、慢性小叶性肝炎、急性肝炎及原发性肝癌组。具有乙肝复制指标阳性患者的肝细胞内HBV DNA检出率(82.0％)明显高于非复制组(63.0％),P<0.05。本研究观察到;HBB DNA阳性肝细胞与肝细胞坏死灶关系密切,多位于肝细胞坏死灶中间或(和)周边,其中以局灶型分布的HBVDNA阳性肝细胞与肝细胞坏死灶关系密切。提示HBV复制与肝细胞坏死有关。     

HBsAg阳性母亲的胎儿肝内HBVDNA整合研究

自1985年以来,国内先后有多篇文章报告了HBV官内感染的研究,即在胎儿肝脏提取物和心脏血清中检出HBV标志,为HBV宫内感染提供了理论依据。本文以39例流产胎儿的肝脏为研究材料,提取肝组织DNA,经EcoRI,BamHI限制酶消化,Southern转移DNA后与HBV各类型片断探针杂交,研究HBsAg阳性母亲胎儿肝脏中HBVDNA的存在状态。     

乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸在人原发性肝癌及癌旁组织中存在状态和与肝癌的关系

应用纯化的不含载体质粒顺序的~(32)P-HBV DNA探针(3.2Kb),分析了66例人原发性肝癌中的DNA存在状态,发现34例(51.5％)有不均一的HBV DNA整合;14例(21.2％)存在复制型的游离HBV DNA;11例(16.7％)同时存在整合及游离HBV DNA,7例(10.6％)未见到HBVDNA痕迹。同时对20例癌及癌旁肝组织同时存在有整合型HBV DNA的病例,比较了癌与癌旁肝组织的HBV整合谱型,发现15例(75％)显示不同的整合区带;5例(25％)具有相似的整合谱型。     

肝硬变组织内HBV DNA和HBsAg的分布及意义

作者用原位杂交和免疫组织化学PAP法双标记,在51例人肝硬变石蜡组织切片中检测HBV DNA和HBsAg.共检出HBV DNA 21例(41.2％),HBsAg 43例(84.3％),二者同时检出共19例(37.3％).HBVDNA阳性颗粒主要分布于肝细胞的胞浆或同时分布于胞核及胞浆内,少数仅位于核内或沿胞膜内侧分布.51例肝硬变患者中,活动性肝硬变与静止性肝硬变组织中HBV DNA的阳性检出率分别为52.8％和13.3％,HBV DNA和HBsAg二者均阳性的检出率分别为47.2％和13.3％,均以活动性肝硬变为高(P<0.05).结果说明,HBV的感染以及HBV DNA在肝组织中的存在和持续活动是肝硬变发生发展的重要因素之一.     

乙型肝炎病毒抗原抗体模式、病毒载量与临床疾病普关系

目的探讨和研究血清乙型肝炎病毒抗原抗体表现模式、病毒载量、临床疾病普的关系。方法有肝组织病理学检查的HBsAg阳性病例360例和无肝组织病理学检查的病例130例进行HBV—M、HBV DNA及常规肝功检查、B超检查。结果血清HBV DNA水平与HBV—M表现模式有关，HBeAg的存在影响HBV DNA水平变化，血清乙型肝炎病毒抗原抗体表现模式、病毒载量与疾病普无关。E抗原阴性在肝硬化、肝癌患者中分布增多。结论任何一种阳性或阴性HBV—M状态可能存在不同程度的HBV复制，相同的HBV—M状态、等量的HBV—DNA可能有不同的病理学改变和不同的临床疾病普，早期肝硬化、失代偿期肝硬化、肝癌患者中E抗原阴性HBV感染者占优势。重视E抗原阴性慢性活动性肝炎自然史。     

慢性乙肝患者流产绒毛检出整合型HBV DNA

应用Southern plot,对24例慢性乙肝患者(夫妇中至少有1个是乙肝患者)的流产绒毛、胎肝、胎儿内生殖系统组织进行HBVDNA检测和研究。22例流产绒毛中检出整合型合并游离型HBV DNA 1例,阳性率4.5％,2例胎肝DNA中检测出1例整合型合并游离型HBV DNA。以上结果除以分子生物学角度证实HBV宫内感染外,还高度提示:HBV存在经生殖细胞垂直传递子代的可能。     

同一HBV感染者外周血单个核细胞与肝组织中HBV DNA

用聚合酶链反应(PCR)及Southern印迹杂交检测了16例慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者外周血单个核细胞(PBMCs)及肝组织中HBV DNA.有13例同时在PBMCs及肝组织中检出HBV DNA,1例仅在PBMCs中检出,1例只在肝组织中检出。结果表明,在慢性HBV感染过程中PBMCs可同时被感染。     

用原位杂交对HBV和AFB_1与树鼩肝癌发生关系的研究

用生物素标记的HBV DNA探针对经83～158周实验的55只树鼩肝组织的福尔马林固定、石蜡包埋的切片进行原位杂交研究。有45只树鼩接种过HHBV,在肝细胞检出HBV DNA的有30只,另15只肝内HBV DNA阴性。这55只树鼩,有41只摄入了AFB_1,其中肝HBV DNA阳性的A组22只有10只发生PLC;19只HBV DNA阴性的B组,只发现2例PLC。两组差别显著(P<0.05)。未接触过AFB_1的14只树鼩中,肝内HBVDNA阳性的8只(C组),有1例出现PLC;而HBV DNA阴性的6只(D组)无PLC发生。结果表明:HHBV和AFB_1在PLC发生中起协同作用,支持了HHBV感染与PLC存在病因学关系的观点。     

基因芯片检测肝炎肝硬化患者肝组织中HBVDNA

目的 :研究病毒性肝炎基因芯片的制备 ,用肝炎基因诊断芯片 ,免疫组织化学法和原位分子杂交法 ,检测 99例乙型肝炎后肝硬化肝组织中 HBV DNA,比较各种方法优缺点。方法 :将 PCR扩增的 HBVDNA探针用点样仪点于玻片介质上 ,并经过点样处理后制备成基因芯片 ;收集肝炎后肝硬化肝组织标本 99份 ,分别用基因芯片、原位分子杂交法、免疫组织化学法检测 HBVDNA和 HBc Ag。结果 :5 3例 HBc Ag、HBVDNA阳性组织中基因芯片检测阳性 40例 ;HBc Ag阳性 2 2例中基因芯片检测阳性 6例 ;32例 HBc Ag HBVDNA阴性组织中基因芯片检测均阴性。结论 :肝炎基因诊断芯片可以检测肝组织中 HBVDNA,准确率可达 75 % ,假阳性率低。     

DNA分子杂交检测肝癌病人血清及其肝组织中HBVDNA的应用研究

本文采用目前国内较先进的DNA分子杂交技术,使用~(32)P探针检测92例肝癌病人血清、92例对照病人血清及4例肝癌病人肝组织中的HBVDNA,从分子水平来探讨肝炎与肝癌的关系.肝癌病人血清中HBVDNA的检出率为23.91%,对照病人血清仅4.35%,两组比较P<0.01,差异显著.4例肝组织中HBVDNA检出1例.HBVDNA在肝癌病人血清和肝组织中检出,证明HBVDNA已整合于病人肝细胞中,HBV感染作为肝癌病因之一更加明朗.     

各型乙型肝炎肝组织内HBV抗原的免疫组化检测

本文采用单克隆抗体，以较灵敏的免疫组化方法——IGSS法和ABC法检测了65例各型乙型肝炎患者肝活检组织中的HBsAg和HBcAg。两种方法的灵敏性近似。HBsAg 65例检出43例（66.1％），粗膜型HBsAg的检出与病情活动和严重程度一致。HBcAg 59例检出17例（28.8％），核型、浆型和膜型HBcAg均被检出，浆、膜型HBcAg的存在可能反映了病变的活动性。