IL-1、IL-6和活化枯否细胞培养上清液对约氏疟原虫红外期发育的影响

目的:研究IL-1、IL-6和活化枯否细胞(Kc)产物对约氏疟原虫红外期(EEF)发育的影响.方法:大鼠腹腔注射IL-1、IL-6或合用,3 h后接种子孢子(Sp),42 h后观察EEF发育情况;建立大鼠肝细胞-约氏疟原虫体外培养模型,Sp接种后2 h加IL-1、IL-6及激活后Kc培养上清,观察对EEF发育的影响.结果:IL-1组、合用组Sp发育率明显降低,IL-6组无明显下降;IL-1、IL-6明显抑制培养的EEF发育;激活Kc培养上清也可抑制EEF发育,EEF成熟度低、体积小.结论:IL-1、IL-6在体内外和接种Sp前后均可抑制EEF的发育.     

约氏疟原虫动力素蛋白(PyDyn)的基因克隆及其结构域的免疫特性

目的 分离、克隆约氏疟原虫动力素蛋白(Plasmodium yoelii dynamin-like proteon,PyDyn)基因,并用其在原核表达的蛋白结构域产物做候选疫苗,研究其免疫保护性。方法 应用约氏疟原虫基因组数据库,设计特异引物,用RT—PCR法从约氏疟原虫红内期mRNA扩增PyDyn基因编码区;分析其序列特性;原核表达约氏疟原虫动力素结构域蛋白、IPA分析其免疫原性。结果 从鼠约氏疟原虫mRNA扩增的PyDyn基因编码区是一个全长为2433bp的cDNA克隆,编码811个氨基酸的蛋白肤链,具有典型的动力素蛋白家族的结构特性。该基因GeneBank登录号为AF458071。IFA表明该虫源性结构蛋白(PyDyn)的第1、3、5结构域的抗血清可以识别约氏疟原虫感染的红细胞。结论 经分离、克隆和表达的新PyDyn有望成为疟疾疫苗的候选抗原分子。     

约氏疟原虫红内期18S UrRNA和Pir基因扩增实验条件的研究

目的 扩增红内期约氏疟原虫相关基因方法的建立和优化.方法 收集约氏疟原虫感染昆明株小鼠抗凝全血,不处理或分别用淋巴细胞分离液去除白细胞、分离后破碎红细胞,提取总RNA,分别用Olig(dT)15和随机引物进行常规反转录,在不同的MgCl2浓度条件下,PCR扩增约氏疟原虫18S UrRNA和Pir基因.结果 经过淋巴细胞分离液分离处理组提取的RNA的纯度相对较高,可达1.9以上,但是3种处理方式在MgCl2浓度大于等于2 mmol/L条件下,可成功扩增出约氏疟原虫的Pir基因,但是只有随机引物进行反转录组才能成功扩增出18S UrRNA.结论 不处理疟原虫感染全血提取的RNA纯度较低,但是能在2 mmol/L MgCl2条件下成功扩增疟原虫相关基因;18S UrRNA只能从随机引物进行反转录组中成功扩增.     

约氏疟原虫感染对大劣按蚊PPO4基因转录与卵囊内Ca2+的影响

目的观察约氏疟原虫感染对大劣按蚊前酚氧化酶(prophenoloxidase, PPO)基因转录的影响与卵囊黑化期间囊内Ca2 的变化,探讨疟原虫感染不易感蚊种时卵囊黑化的相关机制.方法分别在大劣按蚊吸血感染约氏疟原虫前与感染后1、2、3和5 d抽提蚊总RNA进行RT-PCR,PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后扫描进行凝胶图像分析,并对所得数据进行统计学处理.在吸血感染后5、7、11和15 d解剖分离按蚊中肠,以荧光染料Fluo-3/Am作为卵囊内Ca2 指示剂,利用共聚焦扫描显微镜观察不同时期约氏疟原虫卵囊内Ca2 的分布及变化.结果吸血感染约氏疟原虫前大劣按蚊PPO4基因的RT-PCR扩增产物较少,但感染后明显增加(P<0.01),尤其在感染后1 d与2 d最为明显;约氏疟原虫未黑化卵囊内Ca2 为(137.15±7.02) nmol/L,完全黑化卵囊内Ca2 为(18.44±1.75) nmol/L、并在囊壁出现明显的钙沉着.结论吸血感染约氏疟原虫后大劣按蚊PPO4基因转录比感染前明显增强,黑化卵囊内Ca2 较未黑化卵囊明显减少,并有外排现象.     

5种疟原虫红内期可溶性蛋白质图谱比较

目的　比较 5种疟原虫 (间日疟原虫、恶性疟原虫、食蟹猴疟原虫、约氏疟原虫、伯氏疟原虫 )红内期可溶性蛋白电泳图谱。方法　用 1%NP - 40提取 5种疟原虫红内期可溶性蛋白组分。各种蛋白提取物经十二烷基硫酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS -PAGE)后氨银染色 ,所得蛋白图谱经光密度扫描进行分析。结果　 5种疟原虫蛋白区带波峰位置和大小各不相同 ,显示较大差异。但有两个区带为 5种疟原虫共有区带 ,其分子量分别为 72KD和6 4KD。在 5种疟原虫中 ,以伯氏疟原虫与约氏疟原虫蛋白区带相似性最高。结论　 5种疟原虫红内期蛋白组分差异较大 ,伯氏疟原虫与约氏疟原虫种间进化关系较接近     

恶性疟原虫红内期SSUrRNA编码基因的克隆与序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株红内期小亚单位核糖体核糖核酸SSUrRNA编码基因(SSUrDNA)片段，并进行序列分析。方法根据献报道恶性疟原虫基因序列设计1对特异性引物，采用聚合酶链反应(PCR)方法从海南恶性疟患血样核酸提取物中扩增出恶性疟原虫SSUrDNA目的基因片段，纯化后与PUC19m-T质粒载体连接构建重组子，并导入大肠杆茵JM109；阳性克隆经双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定序列，并采用ExPASy Proteomicstools软件分析。结果 恶性疟原虫SSUrDNA扩增片段大小约为431bp；阳性克隆重组质粒作双酶切及PCR扩增均得到预期大小的基因片段；测定的SSUrDNA插入片段核酸序列与巴西恶性疟原虫IMTM／7G8相同基因序列对比。未发现碱基的插入或缺失去，同源性为99．3％；第353位碱基由C取代了G，第371位碱基由T取代了C，其余序列相同。结论 成功克隆了恶性疟原虫海南株红内期SSUrDNA基因片段，该序列在不同恶性疟原虫虫株间相对保守。     

大劣按蚊AdS7基因的克隆及分析

目的克隆AdS7基因cDNA序列,为大劣按蚊基因定量研究提供内参照.方法采用RT-PCR扩增、TA克隆技术获得AdS7 cDNA部分序列,标记地高辛AdS7探针,从大劣按蚊cDNA文库中筛选得到AdS7全长克隆,以半定量RT-PCR方法研究血餐和约氏疟原虫感染对其表达水平的影响.结果从大劣按蚊cDNA克隆得到长464 bp的AdS7基因cDNA部分序列,从大劣按蚊cDNA文库筛选获得了长871 bp的AdS7基因全长克隆,大劣按蚊吸血和感染约氏疟原虫后24 h,AdS7表达水平没有显著变化.结论 AdS7基因可作为大劣按蚊基因定量研究的内参照.     

约氏疟原虫卵囊与唾液腺子孢子不同时相点的CSP与MAEBL基因表达研究

目的为研究约氏疟原虫在蚊体内发育过程中,卵囊子孢子与唾液腺子孢子不同时相点的环子孢子蛋白(circumsporozoite protein, CSP)与红细胞结合蛋白(erythrocyte binding protein, MAEBL)基因表达水平的变化.方法分别在约氏疟原虫感染斯氏按蚊后5、7、10 d取蚊腹部、12、15、18 d取蚊头胸部分离疟原虫总RNA,以rRNA 28S为对照,通过RT-PCR法半定量分析CSP与MAEBL mRNA表达量.结果蚊期疟原虫子孢子CSP与MAEBL转录显著上调(P<0.01),在侵入唾液腺后达到峰值.结论疟原虫唾液腺子孢子CSP和MAEBL mRNA高水平表达,提示CSP和MAEBL可能与侵入脊椎动物宿主密切相关.     

海南省恶性疟原虫裂殖子表面蛋白3的分型研究

目的 了解海南省恶性疟原虫裂殖子表面蛋白3(pfMSP3)等位基因型的分型特征。方法 采用套式PCR法扩增pfMSP3基因的可变区序列,对海南省恶性疟原虫分离株进行基因分型,并对其代表株的基因片段进行序列分析。结果 41份血样扩增出51个pfMSP3基因片段,以3D7型为主导型(78．4％),K1型为次要型(21．6％),其中,混合感染率为24．4％。序列分析表明,海南省恶性疟原虫虫株的3D7型和K1型的可变区序列与3D7和K1原型序列具有高度同源性。结论 海南省恶性疟原虫的MSP3存在3D7型和K1型两种等位基因型,以3D7型为优势虫株。     

对约氏疟原虫不同易感性的大劣按蚊和斯氏按蚊基因组RAPD序列比较

目的分析对约氏疟原虫不易感的大劣按蚊和易感的斯氏按蚊基因组RAPD谱带并测序,探讨媒介按蚊基因型与疟原虫基因型间的相互关系。方法用已筛选的一条随机引物,随机扩增大劣按蚊和斯氏按蚊成蚊的基因组DNA,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,对相同迁移率的DNA条带克隆、测序,并采用相关在线程序及软件进行序列比较分析。结果大劣按蚊和斯氏按蚊RAPD谱带具有明显的种间差异,但有4对相同迁移率的条带。序列分析显示4对DNA条带在序列长度和组成上呈现多态性,序列的GC含量和简单重复序列存在差异,序列相似性介于48％～52％之间。结论大劣按蚊和斯氏按蚊之间存在不同的遗传背景,其基因多态性可能与产生对约氏疟原虫的易感性不同有关,为进一步研究按蚊与疟原虫之间的相互作用奠定了基础。     

基于CRISPR/Cas9的PALM基因敲除约氏疟原单克隆虫株的构建

目的：基于CRISPR/Cas9技术构建并鉴定Plasmodium yoelii 17XNL PALM基因敲除单克隆虫株。方法：根据PlasmoDB数据库中的约氏疟原虫P.yoelii 17XNL PALM基因序列信息,设计引物与sgRNA。PCR扩增左、右同源臂,将同源臂和sgRNA与载体pYCm-golden-blue连接,构建用于基因敲除的CRISPR工具质粒pYCm-PALM KO。pYCm-PALM KO CRISPR质粒电转染至P.yoelii 17XNL裂殖体,尾静脉注射感染小鼠,24 h后采血查获疟原虫后,给予小鼠6 mg/mL乙胺嘧啶喂水进行药物压力筛选基因敲除疟原虫。此后每2天鼠尾采血涂片镜检疟原虫,喂药8 d时提取疟原虫基因组DNA进行PCR鉴定,最终经测序确定是否发生PALM基因敲除。将已证实存在PALM基因敲除疟原虫的鼠血采用有限稀释法接种小鼠,8 d后采血镜检疟原虫,PCR鉴定,筛选获取单克隆虫株。将获取的PALM基因敲除的单克隆虫株和P.yoelii 17XNL各接种至6只昆明小鼠体内,每只接种1×10⁵感染疟原虫的红细胞(iRBC)...     

约氏疟原虫红外期相关蛋白识别及质谱分析

目的对混和于宿主蛋白的约氏疟原虫红外期蛋白进行初步研究。方法制备针对疟原虫唾液腺子孢子的免疫血清,通过免疫印迹识别肝细胞内疟原虫裂殖体的相关蛋白,并对识别的蛋白进行肽指纹图谱分析。结果通过免疫印迹成功地识别了疟原虫相关的蛋白,经MALDI-TOF-MS获得肽指纹图谱,以Mascot软件分析并在疟原虫蛋白数据库中检索到了相匹配的多肽。结论应用免疫印迹与肽指纹图谱相结合的方法,可以对存在于复杂混和物中的红外期疟原虫蛋白进行初步分析。     

蒿甲醚对约氏疟原虫在斯氏按蚊体内发育影响

目的 研究蒿甲醚对约氏疟原虫在大劣按蚊体内发育的影响及其机制.方法 本课题利用已经建立的斯氏按蚊-约氏疟原虫模型,通过吸饲蒿甲醚糖水的方法,观察蒿甲醚是否影响约氏疟原虫在斯氏按蚊体内的发育.通过RT-PCR方法,分析NOS、TEP1和PPO三个斯氏按蚊重要的免疫反应相关基因的表达变化,以了解青蒿素类药物蒿甲醚影响疟原虫...     

大劣按蚊血淋巴酚氧化酶与约氏疟原虫卵囊黑化关系的研究

目的：探讨大劣按蚊血淋巴酚氧化酶（PO）与约氏疟原虫卵囊黑化的关系。方法：以大劣按蚊/约氏疟原虫模型，利用聚丙酰凝胶电泳后的酶底物显色法，比较、分析血餐后5、7、11、15d时不吸血组、吸正常血组和感染组3组的雌大劣按蚊血淋巴酚氧化酶的单酚氧化酶（MPO）和双酚氧化酶（o-DPO)活性；同时观察感染组约氏疟原虫的感染度及其卵囊黑化比率。结果：感染组的血淋巴MPO和o-DPO酶活性明显高于不吸血组和吸正常血组（P＜0.05)；但是随着约氏疟原虫卵囊黑化比率的增高，感染组血淋巴MPO和o-DPO活性逐渐下降。另外，吸正常血组的MPO和o-DPO酶活性明显高于不吸血组（P＜0.05)。结论：吸血和约氏疟原虫的感染均能激活大劣按蚊前酚氧化酶级联反应，而大劣按蚊血淋巴酚氧化酶可能在大劣按蚊对黑化约氏疟原虫卵囊中发挥重要作用。     

IL-12在约氏疟原虫感染中作用的初步实验研究

目的:探讨IL-12在约氏疟原虫感染中的作用.方法:尾静脉注射法感染IL-12基因敲除小鼠和B6小鼠约氏疟原虫(17XNL),于感染后的第0、2或4、6天取小鼠尾静脉血,检测血清中的细胞因子;从感染后的第2天起,隔日检测小鼠虫体血症水平.结果:与B6小鼠相比,IL-12基因敲除小鼠在感染后虫体血症水平增长迅速且水平高;清除感染需时较长,但仍能完全清除虫体而存活.在感染后的第0、2、6天血清中无IL-12、IFN-γ,而B6小鼠IL-12、IFN-γ(D4)水平均较高.两者在TNF-α水平上无差别.结论:尽管IL-12对小鼠感染约氏疟原虫后的存活很重要,但无IL-12的小鼠感染约氏疟原虫后仍能存活.     

抗生素对重组约氏疟原虫BY265株感染斯氏按蚊的影响

目的 探讨抗生素对斯氏按蚊感染重组约氏疟原虫BY265-GFP株的影响.方法 在疟原虫感染斯氏按蚊前后分别饲含抗生素的糖水,分别于7 d、16 d观察蚊胃卵囊和唾液腺子孢子情况.结果 饲加入抗生素糖水组蚊胃感染度和感染率、唾液腺子孢子数量明显高于对照组.结论 抗生素可提高重组约氏疟原虫对斯氏按蚊的感染能力.     

与大劣按蚊先天免疫相关丝氨酸蛋白酶的克隆及分析

目的克隆及分析与先天免疫相关的大劣按蚊差异基因。方法利用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)方法克隆大劣按蚊差异基因,并对与先天免疫相关的差异基因(文中命名为T6基因)进行生物信息学分析及半定量实验,分析约氏疟原虫感染前后其转录的变化,探讨它与按蚊抗疟原虫感染的先天免疫反应的关系。结果目前克隆的差异基因包含以下几类:①与先天免疫相关的酶类;②与能量代谢有关的酶;③与信号传递和调节有关的因子。对与先天免疫相关的分子进行的半定量实验表明,大劣按蚊T6基因的转录与感染疟原虫相关。结论本研究成功地克隆了与先天免疫相关的大劣按蚊差异基因,进一步的实验分析提示该基因可能与按蚊抗约氏疟原虫感染的黑化反应相关。     

银染mRNA差异显示法在糖尿病早期大鼠背根神经节差异基因筛选中的初步应用

目的：建立银染mRNA差异显示方法，并初步应用于筛选糖尿病早期大鼠背根神经节中差异表达基因。方法：制备糖尿病模型大鼠，以锚定引物与随机引物组合分别对正常与模型大鼠背根神经节的mRNA行DD-PCR扩增，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，银染法显示差异片段。结果：建立了银染mRNA差异显示方法．初步筛选出一些糖尿病早期大鼠背根神经节中差异表达的基因。结论：银染mRNA差异显示方法是简便快捷、行之有效的筛选差异基因的方法。