托瑞米芬逆转乳腺癌耐药蛋白介导的多药耐药机制

目的 探讨托瑞米芬逆转乳腺癌耐药蛋白(BCRP)介导的多药耐药机制。方法 通过基因扩增,构建分别由BCRP启动子和巨细胞病毒(CMV)启动子启动表达BCRP的重组质粒pcDNA3-Promoter-BCRP和作为对照的质粒pcDNA3-CMV-BCRP,将其分别转染雌激素受体α（ERα）阳性的MCF-7和ERα阴性的MDA-MB-231乳腺癌细胞系,建立由BCRP启动子和CMV启动子启动表达BCRP的4种耐药细胞系MCF-7/Promoter-BCRP、MCF-7/CMV-BCRP、MDA-MB-231/PromoterBCRP和MDA-MB-231/CMV-BCRP。在耐药细胞培养基中加入托瑞米芬,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot、外排实验以及细胞毒性实验观察托瑞米芬对不同细胞系的耐药逆转效果。结果与空白对照组（未加药物）相比,托瑞米芬以剂量依赖方式抑制BCRP mRNA的表达,0.1、1和10 μmol/L托瑞米芬处理组MCF-7/Promoter-BCRP细胞中BCRP mRNA的表达水平分别下调29.5％(P＜0.05)、68.1％ (P＜0.01)和97.4％(P＜0.01);MCF-7/Promoter-BCRP细胞经托瑞米芬和17β-雌二醇联合处理后,细胞中BCRP mRNA的相对表达水平为64.2％±1.3％,明显高于托瑞米芬单独处理组(3.8％±0.2％,P＜0.01)。托瑞米芬对各组细胞系中BCRP蛋白表达的调控作用与mRNA相似。经托瑞米芬处理后,MCF-7/Promoter-BCRP细胞内米托蒽醌的荧光强度显著增强,外排米托蒽醌的能力降低了 47.3％ (P ＜0.05);经托瑞米芬和17β-雌二醇联合处理后,MCF-7/Promoter-BCRP细胞内米托蒽醌的荧光强度明显低于托瑞米芬单独处理组,外排米托蒽醌的能力升高了61.5％。托瑞米芬可有效逆转MCF-7/Promoter-BCRP细胞对米托蒽醌的耐药性。上述作用在MCF-7/CMV-BCRP、MDA-MB-231/Promoter-BCRP和MDA-MB-231/CMV-BCRP细胞中未能体现。结论 托瑞米芬可能通过ERot的介导与BCRP启动子上游调控序列中的ERE结合,负性调节BCRP的表达,抑制BCRP蛋白的功能,在体外有效逆转BCRP介导的多药耐药。     

姜黄素对乳腺癌细胞VEGF-C表达及增殖、侵袭性的影响

 目的探讨姜黄素对乳腺癌MCF-7细胞的增殖、侵袭性及VEGF-C表达的影响。方法MTT法,Transwell小室检测 姜黄素对MCF-7细胞增殖和侵袭性的影响;RT-PCR、Western blot方法检测姜黄素作用MCF-7细胞前后VEGF-C mRNA 及蛋白水平表达的变化。结果姜黄素能有效抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖,其IC50为37μmol/L,随浓度增高其抑制作 用增强（P＜0.05）,同时降低乳腺癌MCF-7细胞的侵袭性（P＜0.001）。不同浓度姜黄素可降低MCF-7细胞VEGF-C mRNA及蛋白水平的表达（P＜0.05）,40 μmol/L组比20 μmol/L组下降明显（P＜0.05）。结论姜黄素可以抑制乳 腺癌MCF-7细胞的增殖及侵袭性,其机制可能是通过下调VEGF-C的表达。     

米非司酮逆转人乳腺癌细胞MCF-7/ADR耐多柔比星机制的探讨

目的 探讨米非司酮对乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR的逆转耐药作用.方法 以亲本乳腺癌细胞MCF-7和耐多柔比星(阿霉素)乳腺癌细胞MCF-7/ADR为研究对象,分别应用MIF进行干预后,流式细胞仪检测MIF作用前后瘤细胞P-gp的表达、细胞内阿霉素蓄积量的变化以及细胞周期的分布.结果 (1)10 μmol/L MIF作用72小时后,MCF-7/ADR细胞P-gp表达率[(23.21±1.80)％]明显高于MCF-7细胞[(19.37±2.37)％,P＜0.05].(2)5 μmol/L ADR处理后,MCF-7/ADR细胞内ADR蓄积量为(47.13±4.11)％,低于MCF-7细胞[(60.24±2.61)％,P＜0.05].(3) 10 μmol/L MIF联合5 μmol/L ADR处理细胞,MCF-7/ADR和MCF-7细胞内ADR的蓄积量分别为(82.72±2.42)％及(88.63±2.75)％ (P ＞0.05);但均较单用ADR时升高(均P＜0.01).(4) MIF作用前,MCF-7/ADR细胞G0/G1期比例[(77.21±3.10)％]高于MCF-7细胞G0/G1期比例[(59.05±2.16)％,P＜0.05];MCF-7/ADR细胞S期比例明显低于MCF-7细胞(P＜0.05).经10 μmol/L MIF作用后,MCF-7细胞G0/G1期比例(75.28±2.53)％较MIF作用前明显升高(P＜0.05);S期比例则较MIF作用前显著降低(P＜0.05);MCF-7/ADR细胞G0/G1期比例和S期比例分别为(80.13±2.72)％及(13.52±1.03)％,与MIF作用前比较差异均无统计学意义(均P＞0.05);两种瘤细胞的G2/M期比例与MIF作用无关(P＞0.05).结论 (1)MIF可以逆转MCF-7/ADR的耐药性,其作用机制与降低细胞P-gp含量、增加细胞内ADR蓄积量有关.(2) 10 μmol/L浓度的MIF对MCF-7/ADR细胞周期分布影响不大.     

β-榄香烯对MCF-7／ADM细胞株中乳腺癌干细胞作用的初步研究

目的探讨乳腺癌耐阿霉素细胞株MCF-7／ADM与阿霉素敏感细胞株MCF-7／S中乳腺癌干细胞（BCSCs）含量及乳腺癌耐药蛋白（BCRP）和P-糖蛋白（P-gp）表达的差异,观察中药β-榄香烯（β-ELE）对BCSCs及BCRP和P-gp表达的影响。方法 应用无血清细胞培养法培养MCF-7／ADM和MCF-7／S细胞株,形态学观察不同细胞株无血清细胞球培养的成球率,RT PCR检测两种细胞株中BCRP和P-gp的mRNA水平,流式细胞仪检测BCRP和P-gp的阳性表达率及CD44+CD24^-／low细胞比例。应用15μg/ml β-ELE作用MCF-7/ADM细胞株48h后,检测细胞成球率及BCRP、P-gp基因与蛋白表达的变化。结果 与MCF-7／S细胞比较,MCF-7／ADM细胞的成球率及BCRP、P-gp mRNA水平较高。MCF-7／ADM细胞中BCRP和P-gp蛋白的阳性表达率分别为（77.78±9.55）％和（32.33±5.12）％,CD44+CD24-／low细胞比例为（64.79±11.78）％,均高于MCF-7／S细胞的（3.97±1.51）％、（14.26±2.51）％和（18.79±3.28）％,差异均有统计学意义（P＜0.01）。β-ELE能明显抑制MCF-7／ADM细胞的成球率及BCRP、P-gp基因与蛋白的表达（P＜0.01）。结论 MCF-7／ADM是BCSCs相对富集的一种耐药细胞株且高表达BCRP和P gp,β-ELE能够抑制MCF-7／ADM细胞中BCSCs比例及其成球率,并降低耐药蛋白的表达。     

Tautomycetin诱导乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR的凋亡及其机制

目的:研究tautomycetin对乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR增殖及凋亡的影响及其机制.方法:MTr法检测tautomycetin对MCF-7/ADR细胞增殖的影响,流式细胞术检测MCF-7/ADR细胞的凋亡,Western blotting法检测tautomycetin对MCF-7/ADR细胞caspase相关蛋白、Bcl-2、Cyto-C、P53蛋白表达和Akt磷酸化的影响.结果:Tautomycetin可剂量(0.01～100μmol/L)依赖性地抑制MCF-7/ADR细胞的增殖(P＜0.05),IC50值为(1.26±0.12)μmol/L;与对照组相比,tautomycetin (1 μmol/L)可诱导MCF-7/ADR细胞凋亡,早期凋亡比例由(0.67±0.18)％升高至(17.2±3.8)％,晚期凋亡比例由(0.96±0.23)％升高至(28.4±5.7)％(P＜0.05).Tautomycetin可活化MCF-7/ADR细胞中caspase-7和caspase-9,降低Bcl-2蛋白的表达,促进线粒体释放Cyto-C,降低p-Akt的水平,但对caspase-8和P53的表达没有影响.结论:Tautomycetin可阻断Akt活化,以P53非依赖的方式通过Cyto-C介导的通路诱导MCF-7/ADR细胞凋亡.     

ATF5蛋白对食管鳞癌细胞耐药性影响

目的 食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)多药耐药严重影响化疗效果,其分子机制仍未阐明.本研究通过构建不同ATF5蛋白表达量的食管癌Eca-109细胞模型,探究过表达ATF5及低表达ATF5对食管癌Eca-109细胞耐药性及凋亡的影响.方法 利用脂质体载体转染技术对食管癌细胞株进行转染,建立高、中(转染空质粒的对照组)、低3组不同ATF5蛋白表达量Eca-109细胞模型.蛋白质印迹法检测3组细胞ATF5蛋白表达水平.MTT实验和平板克隆实验观察3组细胞对紫杉醇、顺铂耐受性的变化;DAPI染料核染色后观察3组细胞在紫杉醇、顺铂作用下凋亡反应的差异;分析ATF5蛋白对食管鳞癌Eca-109细胞耐药的影响.结果 利用转染技术成功构建的3组不同ATF5蛋白表达量的Eca-109细胞模型,表达模型组细胞中ATF5蛋白相对表达量为85.9±2.66,对照组为64.35±2.54,低表达模型组为45.3±3.11,3组差异有统计学意义,F=532.323,P＜0.001.MTT实验显示,紫杉醇、顺铂作用72 h后,3组细胞存活率差异有统计学意义,F紫=163.382,P＜0.001;F顺 =579.36,P＜0.001;同一组细胞不同浓度对存活率的影响差异有统计学意义,F紫=616.32,P＜0.001;F顺 =2 558.05,P＜0.001;不同浓度的紫杉醇、顺铂作用3组细胞后,过表达组细胞的半数抑制率浓度(IC50)分别为4.16±2.21和1.54±0.67;对照组分别为1.54±0.92和1.27±0.65;低表达组细胞的半数抑制率浓度分别为0.33±0.21和0.53±0.62,3组差异有统计学意义,F紫=198 330.768,P＜0.001;F顺=64 298.048,P＜0.001;表明过表达ATF5的细胞对紫杉醇、顺铂的药物耐受性均明显升高而低表达模型组细胞对紫杉醇、顺铂的药物耐受性均明显降低.DAPI染色实验显示,紫杉醇、顺铂作用3组细胞后,过表达组细胞的凋亡率分别为(14.04±1.66)％和(11.75±2.09)％;对照组分别为(26.44±2.99)％和(34.07±3.42)％;低表达组细胞的凋亡率分别为(54.85±5.88)％和(66.66±2.81)％,3组差异有统计学意义,F紫=283.976,P＜0.001;F顺=954.464,P＜0.001.提示过表达ATF5蛋白细胞在紫杉醇、顺铂作用下凋亡细胞均减少,低表达ATF5细胞在紫杉醇、顺铂作用下凋亡细胞均增加.平板克隆形成实验显示,紫杉醇、顺铂作用3组细胞后,过表达组细胞的克隆形成率分别为(56.09±1.37)％和(62.67±1.41)％;对照组分别为(38.7±1.37)％和(34.83±3.09)％;低表达组细胞的克隆形成率分别为(25.22土1.58)％和(18.17±3.64)％,3组差异有统计学意义,F紫 =1157.447,P＜0.001;F顺=612.595,P＜0.001.表明过表达ATF5蛋白细胞在紫杉醇、顺铂作用下克隆形成数均更多,低表达ATF5蛋白细胞在紫杉醇、顺铂作用下克隆形成数减少.结论 上调ATF5蛋白的表达能增加食管鳞癌Eca-109细胞对紫杉醇、顺铂的耐药性,而下调ATE5蛋白的表达则能降低Eca-109细胞对紫杉醇、顺铂的耐药性,提示食管鳞癌细胞的耐药性可能与ATF5蛋白的表达量相关,食管鳞癌细胞中ATF5蛋白的表达情况可能能间接干扰临床药物化疗的效果.     

microRNA-21对乳腺癌MCF-7/ADR细胞株多柔比星耐药性影响的研究

目的:探讨microRNA-21(miR-21)基因表达改变对乳腺癌细胞多柔比星化疗耐药的影响.方法:人工合成miR-21模拟序列或干扰序列,以脂质体为载体,转染乳腺癌细胞MCF-7及其多柔比星耐药细胞株MCF-7/ADR;应用荧光定量RT-PCR检测miR-21的表达;应用MTT法检测细胞转染前后对多柔比星的耐药性;应用流式细胞仪检测细胞凋亡;应用蛋白质印迹法检测PTEN、BAX及Bcl-2蛋白的表达.结果:MTT检测结果示,MCF-7及其耐药株MCF-7/ADR细胞多柔比星半数抑制浓度(IC50)分别为(0.28±0.03)和(17.5±0.12) μmol/L.miR-21表达上调,MCF-7细胞对多柔比星的IC50明显增高为(3.65±0.12) μmol/L;miR-21表达下调,MCF-7/ADR细胞对多柔比星的IC50明显降低为(7.53±0.11) μmol/L.流式细胞分析显示,miR-21下调后MCF-7/ADR细胞凋亡率明显增加.同时,细胞内PTEN、BAX蛋白表达水平增加,Bcl-2表达降低.结论:miR-21在乳腺癌化疗耐药中具有重要作用,抑制miR-21的表达可以逆转乳腺癌多柔比星耐药细胞株对多柔比星的耐药性.     

miR-130a靶向调节PTEN基因对人乳腺癌细胞多柔比星敏感性影响的观察

目的:探讨miR-130a对PTEN基因表达的调控,及其与乳腺癌MCF-7细胞株多柔比星耐药的关系。方法:利用miRNA芯片结合RT-qPCR的方法筛选到miR-130a在亲代敏感MCF-7/S细胞与多柔比星耐药细胞(MCF-7/Adr)中表达差异;通过靶基因预测软件预测PTEN与miR-130a基因的关系;通过miR-130a模拟物和抑制物转染实验结合四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、RT-qPCR和蛋白质印迹法观察miR-130a的表达变化对乳腺癌细胞多柔比星耐药性的影响及其与PTEN基因表达间的关系。结果:与MCF-7/S相比,miR-130a在MCF-7/Adr中的表达水平明显增高(116 834.70±4 728.32)倍,t=19.035,P=0.000;但在多西紫杉醇耐药株MCF-7/Doc中的表达差异无统计学意义,t=0.703,P=0.521。MCF-7/S细胞转染miR-130amimics后,与阴性对照组相比,其miR-130a表达水平明显增高(17.686±1.057)倍,t=8.360,P=0.001;MCF-7/S空白对照组、阴性对照组和实验组对Adr的IC50分别为(0.240±0.099)、(0.181±0.060)和(0.606±0.164)mg/L;与阴性对照相比,转染miR-130amimics后细胞的IC50显著增高,t=5.200,P=0.007。同时PTEN mRNA和蛋白表达水平明显下调,PTEN mRNA水平是阴性对照组的(0.362±0.076)倍,t=2.927,P=0.043;蛋白表达水平是阴性对照组的(0.386±0.020)倍,t=20.713,P=0.000 3;而MCF-7/Adr转染miR-130ainhibi-tors后,其miR-130a表达水平是阴性对照组的(0.169±0.035)倍,t=12.036,P=0.000 2;MCF-7/Adr空白对照组、阴性对照组和实验组对Adr的IC50分别为(50.793±3.970)、(46.206±1.963)和(23.366±1.304)mg/L;与阴性对照相比,转染miR-130ainhibitors后细胞的IC50显著降低,t=16.784,P=0.000 7;同时PTEN mRNA和蛋白表达水平均明显上调,PTEN mRNA水平是阴性对照组的(3.564±0.336)倍,t=4.122,P=0.015;蛋白表达水平是阴性对照组的(2.019±0.268)倍,t=8.999,P=0.000 8。结论:miR130a可能通过靶定PTEN基因来增强乳腺癌细胞对多柔比星的耐药性。     

Med19基因敲减增加乳腺癌细胞化疗敏感性及其可能的机制

目的:研究中介体(mediator,Med) 19对乳腺癌化疗敏感性的影响并分析其分子机制.方法:选用多柔比星(adriamycin,ADM)耐药的人乳腺癌细胞MCF-7/ADM和亲本细胞MCF-7(NC组),采用慢病毒载体介导RNA干扰方法构建Med9稳定低表达的MCF-7/ADM与MCF-7细胞株(KD组),并用Real-time PCR和Western blotting方法验证干扰效果.CCK-8法检测慢病毒介导的Med19敲减前后两种细胞对ADM、顺铂(cisplatin,DDP)和紫杉醇(taxinol,TAX)药物敏感性的变化.Real-time PCR和Western blotting检测Med19敲减对多药耐药基因1(multidrug resistance 1,MDR1)和细胞凋亡基因Bcl2、Bax及Caspase-3、active Caspase-3的表达的影响.流式细胞术检测敲减Med19及ADM处理对细胞凋亡的影响.结果:与MCF-7相比,MCF-7/ADM细胞对ADM、DDP和TAX均具有耐药性.成功构建Med19稳定低表达的MCF-7/ADM与MCF-7细胞株,并且其对ADM、DDP、TAX的敏感性增加,药物作用IC50显著降低(均P＜0.05).MCF-7/ADM细胞Med19 mRNA和蛋白表达显著高于MCF-7细胞,Med19的敲减可降低MCF-7/ADM细胞中MDR1 mRNA与蛋白表达水平(均P＜0.05)并可增加MCF-7/ADM及MCF-7细胞中凋亡相关active Caspase-3、Bax的蛋白表达,降低Bc12的蛋白表达(均P＜0.05).此外,与NC及NC+ ADM组相比,KD组及KD+ ADM组凋亡水平显著增加(均P＜0.05).结论:Med19高表达参与乳腺癌化疗耐药,其机制可能与Med19调节MDR1的表达并影响细胞凋亡有关.     

Ad-p53逆转乳腺癌细胞株多药耐药性及其对P-gp、TOPOⅡ和GST-π表达的影响

背景与目的肿瘤细胞对抗癌药物产生耐受性是化疗失败的主要原因,突变型p53基因与肿瘤多药耐药密切相关.本研究旨在探讨腺病毒介导的p53基因(Ad-p53)对人乳腺癌多柔比星(阿霉素)耐药细胞株MCF-7/Adr多药耐药的逆转作用及其对耐药相关蛋白P-gp、TOPOⅡ和GST-π表达的影响.方法以人乳腺癌MCF-7细胞及其多柔比星耐药株MCF-7/Adr为实验对象,cck-8法观察Ad-p53对多药耐药的逆转作用,Western blot检测P-gp、TOPOⅡ和GST-π蛋白表达的变化.结果50 MOI Ad-p53能使多柔比星对MCF-7/Adr细胞IC50由(4.54±0.91) μg/ml降到(0.26±0.11) μg/ml,逆转耐药倍数为18.1倍(P〈0.001);P-gp、GST-π蛋白表达量下降,TOPOⅡ未见明显变化.结论Ad-p53能够逆转MCF-7/Adr多药耐药,下调P-gp和GST-π表达.     

转铁蛋白修饰多柔比星脂质体靶向抑制乳腺癌细胞增殖的研究

目的：利用转铁蛋白（TF）修饰多柔比星脂质体,并探讨其对乳腺癌细胞增殖的影响。方法采用薄膜超声法制备脂质体,利用硫酸梯度法制备多柔比星脂质体,然后采用后插入法制备 TF修饰多柔比星脂质体。激光共聚焦显微镜检测乳腺癌细胞 MCF-7和 MDA-MB-231对 TF-多柔比星脂质体的摄取,四甲基偶氮唑盐比色法（MTT 法）检测 TF-多柔比星脂质体靶向作用 MCF-7和 MDA-MB-231细胞后的杀伤能力,软琼脂克隆集落实验检测 TF-多柔比星脂质体对 MCF-7和 MDA-MB-231细胞的生长抑制作用。结果激光共聚焦显微镜观察显示,MCF-7细胞和 MDA-MB-231细胞对 TF-多柔比星脂质体摄取率显著高于多柔比星脂质体;MTT 法检测结果则显示,TF-多柔比星脂质体对 MCF-7细胞[（20．8±3．2）μmol／L]和 MDA-MB-231细胞[（20．1±3．0）μmol／L]杀伤的 IC50显著低于多柔比星脂质体[（158．6±24．6）μmol／L;（160．1±25．1）μmol／L）]和游离多柔比星[（161．7±26．2）μmol／L;（166．9±27．0）μmol／L）],差异有统计学意义（F ＝116．03,P ＜0．001;F ＝75．29,P ＜0．001）。软琼脂克隆集落实验显示,TF-多柔比星脂质体对克隆集落的生长抑制显著优于多柔比星脂质体、游离多柔比星及对照组[MDA-MB-231细胞直径：（60．5±10．4）μm、（94．3±16．8）μm、（131．8±22．6）μm、（162．8±30．3）μm;MCF-7细胞直径：（31．8±5．5）μm、（62．1±11．1）μm、（108．6±18．6）μm、（157．4±29．3）μm],差异有统计学意义（F ＝87．17,P ＜0．0001;F ＝178．23,P ＜0．0001）。结论 TF-多柔比星脂质体对乳腺癌细胞体外增殖具有显著的抑制作用,能够高效、特异地杀死乳腺癌细胞,为体内治疗乳腺癌提供了一定的理论依据。     

帕米膦酸二钠抑制人肝癌细胞增殖及诱导凋亡机制研究

目的 肝癌是常见的恶性肿瘤之一,寻找其低毒有效的化疗药物具有重要的临床价值.本研究旨在探讨一种临床常用的骨吸收抑制剂帕米膦酸二钠对人肝癌HepG2及Bel-7402细胞体外增殖和凋亡的影响及其机制.方法 采用MTS法检测不同浓度的帕米膦酸二钠对HepG2和Bel-7402细胞体外增殖的影响;以TUNEL末端标记法和Annexin-Ⅴ-FITC双标记流式法检测帕米膦酸二钠对细胞凋亡的影响采用蛋白质印迹法检测帕米膦酸二钠对凋亡相关蛋白:聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)、Caspase-9、Caspase-3、active-Caspase-3、Bax及Bcl-2表达的影响.结果 MTS检测显示,帕米膦酸二钠对HepG2及Bel-7402细胞均具有明显抑制作用,并呈剂量依赖性,药物的半数抑制浓度(50％inhibitory concentration,IC50)分别为46.12和51.35 μmol/L.流式细胞术检测发现,帕米膦酸二钠可诱导肝癌细胞剂量依赖性凋亡,20、40和60 μmol/L作用HepG2细胞24 h凋亡率分别为(25.70±6.00)％、(43.53±4.06)％和(74.73±2.90)％,与对照组的(3.43土1.07)％相比差异有统计学意义,F=175.5,P＜0.001;20、40和60 μmol/L作用Bel-7402细胞24 h凋亡率分别为(25.50±3.00)％、(48.30±1.02)％和(68.97±4.90)％,与对照组(3.33±0.05)％相比差异有统计学意义,F=81.97,P＜0.001.蛋白质印迹法检测结果显示,帕米磷酸二钠可诱导细胞内凋亡相关蛋白Caspase-9、Caspase-3及PARP的活化,促凋亡蛋白Bax的上调,抑凋亡蛋白Bcl-2的下调.结论 帕米膦酸二钠可以明显抑制人肝癌HepG2及Bel-7402细胞的体外增殖,其机制可能与线粒体凋亡途径的激活而诱导癌细胞发生凋亡相关,帕米膦酸二钠可能成为潜在的肝癌治疗药物.     

蟾毒灵与顺铂协同抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖的机制探讨

目的 探讨蟾毒灵（Bufalin）联合顺铂对乳腺癌MCF-7细胞增殖及凋亡的影响,并探讨可能的协同机制。方法 采用MTT法检测空白对照组（仅培养液）、单纯细胞对照组和实验组的细胞增殖率,实验组加入不同浓度的顺铂或Bufalin单药或以固定比例（Bufalin∶顺铂=1 nmol／L∶1 μmol／L）联合作用24 h。分别采用20 nmol／L Bufalin、20 μmol／L顺铂单药或联合作用24 h,用流式细胞术检测细胞凋亡,并用Western Blotting检测活化的Met（p-Met）、Met、活化的Src（p-Src）、Src、PARP及其裂解cleaved PARP蛋白的表达。结果 MTT法检测显示,顺铂和Bufalin均以剂量依赖方式抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖。在顺铂≥0.1 μmol／L和Bufalin≥0.1 nmol／L时两药联合作用可协同抑制MCF-7细胞增殖（0＜CI＜0.433）。流式细胞术检测显示,20 μmol／L顺铂作用24 h可诱导（10.7±4.8）％ 的MCF-7细胞凋亡,而20 nmol／L Bufalin作用24 h未明显诱导细胞凋亡,20 nmol／L Bufalin与20 μmol／L顺铂联合作用24 h后可诱导（40.8±8.5）％的MCF-7细胞凋亡。Western Blotting检测显示,顺铂作用后可导致Met和Src活化,Bufalin与顺铂联合作用后可抑制顺铂诱导的Met和Src活化,同时上调PARP裂解。结论 Bufalin可能通过抑制顺铂诱导的Met和Src活化与顺铂协同抑制MCF-7细胞增殖,增强顺铂诱导的细胞凋亡。     

PUMA基因转染乳腺癌MCF-7细胞增强表柔比星致凋亡敏感性的研究

  目的  探讨PUMA基因转染是否增强乳腺癌MCF-7细胞对表柔比星致凋亡的敏感性。   方法  应用脂质体介导重组真核表达载体PUMA-pCDNA3和空载体pCDNA3质粒瞬时转染至乳腺癌MCF-7细胞中, G418筛选阳性细胞。将系列浓度(0.01~100μmol/L)的表柔比星分别作用于MCF-7、MCF-7/PUMA和MCF-7/pCDNA3细胞72 h, MTT法测定各组细胞的存活率并计算IC50, FCM、TUNEL法检测细胞凋亡情况, Western blotting检测各组细胞PUMA蛋白表达的变化。   结果  MCF-7、MCF-7/PUMA和MCF-7/pCDNA3细胞的表柔比星IC50分别为(13±1.4)、(1.8±0.2)和(10.7±1.3)μmol/L, MCF-7/PUMA细胞对表柔比星作用的敏感性增加了7.2倍。表柔比星以剂量依赖方式诱导MCF-7细胞凋亡, 但对MCF-7/PUMA细胞所诱导的凋亡比MCF-7和MCF-7pCDNA3更明显。低浓度表柔比星(0.1μmol/L)轻微引起MCF-7/pCDNA3[(1.15±0.26)%]和MCF-7细胞凋亡[(0.9±0.24)%], 但能诱导MCF-7/PUMA细胞明显凋亡[(6.44±1.46)%]; 高浓度表柔比星(1μmol/L)诱导各组细胞凋亡, 但表柔比星MCF-7/PU MA细胞凋亡率[(35.47±9.36)%]明显高于MCF-7[(12.6±3.73)%]和MCF-7/pCDNA3细胞[(15.2±5.17)%], 差异均有统计学意义(P < 0.01);FCM和TUNEL方法检测显示相同的结果。PUMA蛋白在MCF-7/PUMA细胞中的表达明显高于MCF-7和MCF-7/pCD NA3细胞。   结论  PUMA基因稳定转染明显地增强了乳腺癌MCF-7细胞增强表柔比星致凋亡作用的敏感性。      

高强度超声对人类乳腺癌细胞内游离钙的影响及对细胞生长的抑制作用

目的探讨高强度超声（HIU）对人类乳腺癌细胞内游离钙浓度的影响及对细胞生长的抑制作用。方法用HIU（50W／cm^2）干预体外培养的人类乳腺癌细胞MCF-7及MDA—MB-231。用钙离子（Ca^2＋）荧光探针检测干预后细胞内Ca^2＋浓度,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测干预后细胞生长抑制率,流式细胞术分析细胞周期分布及凋亡率。结果HIU干预10、20、30S后,细胞内Ca^2＋浓度随干预时间的增加而升高,MCF-7细胞分别为（572±20．1）、（670±18．9）、（815±16．3）nmol／L（F=663．65,P〈0．001）,MDA—MB-231细胞分别为（582±16．3）、（687±19．7）、（843±14．8）nmol／L（F=863．06,P〈0．001）;周期向G0～G1分布,二种细胞G0～G1比例为分别为（60．5±5．5）％、（66．3±7．0）％、（74．5±8．2）％（F=8．17,P=0．002）和（58．5±6．3）％、（66．1±6．3）％、（71．2±7．9）％（F=7．51,P=0．003）;凋亡率逐渐上升,二种细胞凋亡率分别为（7．3±1．7）％、（13．2±3．5）％、（19．3±3．7）％（F=18．73,P〈0．001）和（6．3±1．8）％、（11．4±2．3）％、（16．4±3．3）％（F=19．26,t9〈0．001）;干预后细胞生长抑制率明显增加,二种细胞生长抑制率分别为（9．2±2．2）％、（243±3．9）％、（48．6±5．5）％（F=117．16,P〈0．001）和（9．0±1。7）％、（22．3±3．5）％、（41．6±6．4）％（F=71．25,P〈0．001）。结论HIU干预在一定作用时间内使细胞内Ca^2＋浓度升高,促使细胞周期向G0～G1转化,凋亡率及细胞死亡率明显上升.