siRNA干扰FLOT2基因表达对肾细胞癌细胞增殖的影响

目的:探讨FLOT2在肾细胞癌细胞株中的表达,并观察小干扰RNA沉默FLOT2基因对肾细胞癌786-O细胞增殖能力的影响。方法:将化学合成的FLOT2的小干扰siRNA用脂质体 Lipofectamine2000转染至肾细胞癌786-O细胞;分别用RT-PCR、Western blot方法检测细胞转染前后FLOT2以及细胞增殖相关因子CCND1的表达。CCK-8与克隆形成实验检测其增殖情况。结果:转染FLOT2-siRNA的肾细胞癌786-O细胞,RT-PCR、Western blot检测显示FLOT2在基因及蛋白水平明显下调（P<0.05）;与对照组比较786-O细胞增殖能力明显下降（P<0.05）,细胞增殖相关因子CCND1明显下调（P<0.05）。结论:FLOT2在肾细胞癌细胞系中高表达,采用特异性FLOT2-siRNA 能够显著降低FLOT2和CCND1表达。干扰FLOT2表达能显著抑制786-O细胞的增殖,FLOT2基因可能参与了肾细胞癌的生物学行为。     

LNX1通过调控TIAM1/ERK信号通路抑制肾透明细胞癌细胞的增殖、侵袭和迁移

目的：探讨泛素链接酶LNX1(ligand of numb-protein X 1)对肾透明细胞癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响及其可能的分子作用机制。方法：利用基因表达谱交互分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA）数据库分析LNX1 m RNA在肾透明细胞癌组织中的表达水平,及其与肾透明细胞癌患者预后的相关性。采用慢病毒感染的方法将携带特异性针对LNX1基因的shRNA(shLNX1)转入肾透明细胞癌细胞786-O和ACHN中;采用瞬时转染的方法将重组质粒flag-LNX1转入786-O和ACHN细胞中。分别采用CCK-8实验和细胞集落形成实验检测沉默或过表达LNX1对786-O和ACHN细胞增殖能力的影响,Transwell小室实验检测沉默或过表达LNX1对786-O和ACHN细胞侵袭和迁移能力的影响。采用生物信息学分析法筛选LNX1的下游靶基因,采用蛋白质印迹法检测沉默或过表达LNX1对T淋巴瘤侵袭和转移诱导蛋白1(T-lymphoma invasion and metastasis-inducing prote...     

反义survivin基因对786-O细胞的体外作用及其对表阿霉素诱导细胞凋亡作用的观察

的研究survivin反义寡核苷酸（ASODN）转染对肾透明细胞癌786-O细胞的survivin蛋白表达、细胞凋亡、增殖的影响,及其对表阿霉素诱导细胞凋亡的作用。方法设计并合成特异性靶向survivjn的ASODN及正义寡核苷酸（SODN）,将其转入786-O细胞。设空白对照组、脂质体对照组、SODN组和600nmol／L ASODN组,处理24h后收获各组细胞。透射电子显微镜观察细胞形态变化,免疫组化法检测各组细胞survivin表达情况,流式细胞术检测各组细胞增殖和凋亡指数。结果ASODN组的细胞呈典型凋亡的形态学改变,而对照组细胞生长良好;ASODN组细胞survivin表达减弱,凋亡指数明显升高（P〈0．05）;转染ASODN 24h后,表阿霉素诱导786-O细胞凋亡的作用明显增强。结论survivin ASODN能下调survivin蛋白表达,诱导肾透明细胞癌786-O细胞凋亡,抑制786-O细胞增殖,并增强表阿霉素诱导的细胞凋亡。     

桧木醇诱导人肾透明细胞癌786-O细胞凋亡及其机制研究*

目的：探讨桧木醇（hinokitiol ）对人肾透明细胞癌786-O细胞株的增殖抑制作用及诱导凋亡效应,初步阐明其机制。方法：采用CCK-8 法检测桧木醇对肾癌786-O细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测细胞凋亡情况;转染EGFP-LC3 后镜下观察细胞自噬状态;采用Western blot对细胞Caspase- 3 剪切体、LC3 和P62蛋白表达量进行检测。结果：桧木醇可以显著抑制肾癌786-O细胞增殖,通过激活Caspase途径诱导细胞凋亡。桧木醇诱导肾癌786-O细胞发生自噬,LC3 蛋白表达显著上调,而P62蛋白表达下调。结论：桧木醇可显著抑制肾癌786-O细胞的增殖并通过过度激活细胞自噬促进肾癌细胞凋亡。     

肾透明细胞癌组织SMO表达与肾癌细胞增殖和凋亡的相关性

目的 Hedgehog信号通路参与了肿瘤的发生发展,本研究探讨该通路关键信号分子Smoothened(SMO)在肾透明细胞癌中的表达及对肾癌细胞增殖和凋亡的影响.方法 选取2012-01-01-2013-06-30青岛大学附属医院泌尿外科,行手术治疗的80例肾透明细胞癌患者的临床及病理资料,采用免疫组织化学方法检测SMO在肾透明细胞癌组织中的表达并分析其与临床病理特征间的关系.采用小干扰RNA下调SMO在人肾癌细胞786-O中的表达,分别应用CCK-8法、流式细胞术及蛋白质印迹法检测下调SMO表达对细胞增殖、凋亡及Gli1和Gli2表达的影响.结果 SMO在73例(91.25％)肾透明细胞癌组织中有表达,其在高级别肾癌中表达(80.49％)较低级别(56.41％)显著升高,x2 =5.39,P=0.02.RT-PCR 检测结果显示,SMO在人肾癌细胞系786-O中表达量为0.704±0.059;蛋白质印迹结果显示,SMO在786-O中表达量为0.651±0.074.在786-O细胞中应用小干扰RNA沉默SMO表达后,实验组细胞相较于对照组其活力百分比在48、72和96 h分别为92.7％、80.9％和79.9％,3个时间点差异有统计学意义(P=0.003),细胞凋亡显著增加,t=-29.2,P＜0.001;与空白对照组和阴性对照组相比,其下游分子Gli1和Gli2蛋白表达明显减少(Gli1:3.2 vs 2.9 vs1;Gli2:2.5 vs 2.1vs 1).结论 SMO可能通过调控细胞增殖和凋亡,以及调节Gli蛋白表达参与了肾癌的发生发展.     

TET1对肾癌786-O细胞增殖的影响及其相关机制

目的:应用小干扰RNA(small interferingRNA,siRNA)沉默TET1(ten-eleven translocation1)基因表达,探索其对人肾癌786-O细胞增殖的影响及其可能的机制。方法:采用脂质体转染法将靶向TET1基因的TET1-siRNA转染人肾癌786-O细胞,实验设空白对照组、阴性对照组和干扰组(TET1-siRNA组)。分别采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测转染TET1-siRNA后,786-O细胞中TET1、SUZ12(suppressor of zeste12)、EZH2(enhancer of zestehomolog 2)和EED(embryonic ectoderm development)mRNA及其蛋白的表达;MTT法和克隆形成实验检测786-O细胞的增殖活性和克隆形成率;FCM检测786-O细胞周期。结果:与空白对照组比较,转染TET1-siRNA后,786-O细胞中TET1 mRNA及其蛋白的表达水平分别下降了(85.13±0.03)%和(56.41±0.09)%,差异有统计学意义(P<0.05);786-O细胞的增殖受到抑制,克隆形成能力明显下降,G0/G1期细胞百分比明显增加(P<0.05);SUZ12 mRNA及其蛋白表达水平下调(P<0.05),EED和EZH2蛋白表达水平变化不明显(P>0.05)。结论:TET1-siRNA可显著下调肾癌786-O细胞中TET1蛋白的表达水平,明显抑制786-O细胞的增殖,并使细胞阻滞于G1期,其机制可能与TET1调控SUZ12的表达,影响其靶基因对PRC2(polycomb repressive complex 2)的招募有关。     

HAI-1对肾细胞癌细胞自噬及凋亡调控的初步研究

摘 要：［目的］ 研究肝细胞生长因子激活因子1型抑制因子（hepatocyte growth factor activator inhibitor type 1,HAI-1）对肾细胞癌细胞自噬和凋亡的影响,探讨其发挥作用的可能机制。［方法］ QRT-PCR检测HAI-1在肾细胞癌组织和细胞系中的表达水平,选择低表达的肾细胞癌细胞系进行HAI-1过表达质粒的转染,分为对照组（NC组）和过表达质粒组（OE-HAI-1组）。QRT-PCR检测NC组和OE-HAI-1组细胞中HAI-1的表达水平;MTS实验检测NC组和OE-HAI-1组细胞的增殖率;Western blot法检测HAI-1对肾细胞癌细胞中自噬相关蛋白表达水平的影响;流式细胞仪检测NC组和OE-HAI-1组细胞凋亡率;Western blot法检测NC组和OE-HAI-1组细胞中caspase3、Bax和Bcl-2蛋白的表达水平。［结果］ QRT-PCR结果显示HAI-1在肾细胞癌组织中的表达低于其在癌旁组织中的表达,HAI-1在肾细胞癌细胞系ACHN、786-O和A-498中的表达低于其在肾小管上皮细胞HK-2中的表达（P＜0.05）。选择HAI-1表达最低的肾细胞癌细胞系786-O转染HAI-1过表达质粒,qRT-PCR结果显示OE-HAI-1组细胞中HAI-1的表达增加（P＜0.05）;与NC组相比,OE-HAI-1组786-O细胞增殖能力下降。与NC组比较,OE-HAI-1组和加入自噬激活剂Rapamycin的OE-HAI-1+Rapamycin组细胞中Beclin1和LC3-Ⅱ蛋白表达降低,LC3-Ⅰ蛋白表达增加。与OE-HAI-1组相比,OE-HAI-1+Rapamycin组Beclin1和LC3-Ⅱ蛋白表达增加,LC3-Ⅰ蛋白表达降低。与NC组相比,OE-HAI组细胞凋亡增加,细胞中caspase3和Bax蛋白表达增加,Bcl-2蛋白的表达降低。［结论］ HAI-1在肾细胞癌组织和细胞系中表达降低,并促进肾细胞癌细胞自噬和凋亡的发生。HAI-1可能是治疗肾细胞癌的候选分子靶标。     

miR-27a下调肾癌细胞FOXO1表达并促进其细胞增殖

目的 探讨microRNA-27a(miR-27a)在肾癌细胞中的作用及调控机制.方法 应用miR-27a反义寡核苷酸(ASO)在体外转染786-O和Caki-1细胞;qRT-PCR法检测miR-27a及FOXO1 mRNA的表达情况,Western blot检测FOXO1蛋白的表达水平;CCK8检测miR-27a ASO对细胞增殖的影响.结果 786-O和Caki-1细胞中miR-27a表达高于HK2正常肾小管上皮细胞(P<0.05);利用miR-27a ASO抑制786-O和Caki-1细胞miR-27a表达后,发现两个细胞株FOXO1 mRNA和蛋白表达的升高及增殖能力的降低(P<0.05).结论 miR-27a 可能通过调控FOXO1表达在肾癌中起致癌作用.miR-27a ASO可抑制肾癌细胞的增殖,因此miR-27a有可能作为肾癌基因治疗的候选靶点.     

沉默EMMPRIN对肾透明细胞癌增殖的影响

目的:探讨细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（EMMPRIN）在肾透明细胞癌增殖中的作用。方法:利用免疫组化、实时定量PCR(RT-PCR)和蛋白印迹(Western blot)等方法检测肾癌组织与肾透明细胞癌细胞株中EMMPRIN的表达情况。通过小分子干扰核糖核酸（siRNA）EMMPRIN在786-O细胞中的表达,研究EMMPRIN下调后对786-O肾癌细胞株生物学功能的影响。结果:EMMPRIN在肾癌组织中高表达,肾癌细胞系中EMMPRIN的表达高于正常的肾小管上皮细胞。通过小干扰RNA来敲除EMMPRIN的表达,并影响肾透明细胞癌的增殖。结论:EMMPRIN在肾肿瘤组织和肾癌细胞株中皆呈现出过表达的状态。下调其表达可以降低肾细胞癌的增殖水平,表明EMMPRIN的高表达可能是肾细胞癌患者预后较差的指标,可被视为肾癌治疗的潜在靶点。     

肾透明细胞癌组织中 Notch1的表达及意义

目的:研究Notch1在肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma,ccRCC）组织中的表达变化情况,并探讨其相关临床意义。方法:采用免疫组化、实时荧光定量PCR技术检测52例肾透明细胞癌、40例癌旁肾组织中Notch1蛋白和mRNA的表达。结果:肾透明细胞癌及癌旁组织中Notch1蛋白阳性表达率分别为80.8%(42/52)、30.0%(12/40)（P<0.05）;Notch1蛋白表达与肾透明细胞癌的TNM分期、Fuhrman分级、远处转移有关(P<0.05);肾透明细胞癌及癌旁组织中Notch1 mRNA相对表达量分别为0.317±0.044、0.153±0.038（P<0.05）。结论:Notch1蛋白及mRNA在肾透明细胞癌组织中表达明显增高。但在肾透明细胞癌发生、发展过程中的作用仍有待探讨。     

沉默HOXC10基因促进骨肉瘤MG-63细胞凋亡及其机制

目的:探讨沉默同源框C10（Homeobox C10,HOXC10）基因表达对骨肉瘤细胞MG-63细胞增殖和凋亡的影响,并初步探讨可能的作用机制。方法:采用脂质体转染法将特异性针对HOXC10基因的shRNA转入骨肉瘤MG-63细胞（HOXC10-shRNA组）,同时以转染Scramble-shRNA作为对照组（Scramble-shRNA组）,分别应用实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测HOXC10 mRNA及蛋白的表达水平。转染处理后,分别采用CCK-8法及FCM法检测骨肉瘤MG-63细胞的增殖抑制率及凋亡情况,采用蛋白质印迹法检测HOXC10、ATM和核因子-κB（nuclear factor kappa B,NF-κB)及凋亡相关蛋白Survivin和Caspase-3的表达水平。结果:HOXC10-shRNA转入MG-63细胞后,HOXC10 mRNA和蛋白的表达水平均明显下调（P均<0.05）。与Scramble-shRNA组细胞活力（0.95±0.12）%和凋亡率（4.35±0.52）%相比,HOXC10-shRNA组细胞活力（0.38±0.06）%明显下降,细胞凋亡率为（18.19±3.76）%明显升高（P均<0.05）;ATM/NF-κB信号通路中相关蛋白ATM、NF-κB及Survivin的表达水平均明显下调（P均<0.05）,而Caspase-3表达明显上调（P<0.05）。结论:沉默HOXC10基因表达后可抑制骨肉瘤MG-63细胞增殖并促进其凋亡,其机制可能与调控ATM/NF-κB信号通路的活化相关。     

Smac/DIABLO增强子宫内膜癌细胞对紫杉醇化疗敏感性的机制研究

目的:研究上调Smac/DIABLO基因在人子宫内膜癌Ishikawa细胞中的表达,对紫杉醇化疗增敏方面的作用及可能机制。方法:构建Smac/DIABLO的过表达质粒pcDNA3.1-Smac,应用脂质体法转染人子宫内膜癌Ishikawa细胞,实验分为过表达组、空载体对照组和空白对照组。转染48 h后,应用qRT-PCR和Western blot法检测Smac/DIABLO mRNA及蛋白表达情况。将转染pcDNA3.1-Smac的Ishikawa细胞暴露于终浓度为0.1 μmol/L紫杉醇中,实验分为pcDNA3.1-Smac+紫杉醇组、紫杉醇组和空白对照组,CCK-8法检测暴露紫杉醇24,48,72,96 h,3组细胞增殖能力的变化。应用Western blot检测Ishikawa细胞过表达Smac/DIABLO并暴露于紫杉醇后,Caspase-3,Caspase-7,Caspase-9蛋白的表达情况。结果:转染48 h后,过表达组较空载体对照组、空白对照组,Smac/DIABLO mRNA及蛋白相对表达量均明显增加（F=152.056,P=0.002;F=697.953,P=0.001）。CCK-8实验结果显示,过表达Smac/DIABLO并暴露于紫杉醇后,pcDNA3.1-Smac+紫杉醇组较紫杉醇组和空白对照组,细胞增殖能力受到抑制（P＜0.05）。Western blot检测到pcDNA3.1-Smac+紫杉醇组Caspase-3,Caspase-7,Caspase-9蛋白的相对表达量比较另外两组明显增加（FCaspase-3=434.277,FCaspase-7=392.401,FCaspase-9=88.936,P＜0.05）。结论:上调Smac/DIABLO表达可增强Ishikawa细胞对紫杉醇的化疗敏感性,其机制可能通过线粒体和死亡受体两条途径,解除凋亡抑制蛋白家族对Caspase的抑制作用。     

RNAi沉默p53基因对HeLa细胞核转录因子3表达及其对细胞增殖和侵袭能力的影响

目的：探讨RNAi沉默p53基因对宫颈癌HeLa细胞核转录因子3（STAT3）的表达,及对HeLa细胞增殖和侵袭能力的影响。方法：构建3种靶向p53基因的shRNA1~3序列,并转染HeLa细胞,采用逆转录PCR和Western blot检测细胞p53 mRNA和蛋白的表达,以筛选有效沉默p53的shRNA序列。将筛选的序列转染HeLa细胞后,采用逆转录PCR和Western blot检测STAT3 mRNA和蛋白的表达;采用四甲基噻唑蓝法（MTT）检测细胞增殖;采用Transwell检测细胞侵袭能力。结果：构建的3种p53-shRNA均可沉默宫颈癌HeLa细胞p53的表达,尤以shRNA3的沉默效果最好,转染shRNA3后,HeLa细胞p53 mRNA和蛋白的表达量分别为0.23±0.05和0.41±0.11,显著低于未转染组、空质粒组、p53-shRNA1组和p53-shRNA2组（P均 < 0.05）,故后续试验均以shRNA3转染HeLa细胞。将shRNA3序列转染HeLa细胞沉默p53基因后,p53-shRNA3组STAT3 mRNA和蛋白表达量分别为1.09±0.21和1.46±0.25,显著高于未转染组（0.53 ±0.10和0.74±0.14）及空质粒组（0.55±0.11和0.73±0.15）（P均 < 0.05）。MTT法分析结果显示,在孵育24、36、48和72 h时,p53-shRNA3组HeLa细胞增殖能力均显著大于未转染组和空质粒组（P均 < 0.05）。Transwell法分析结果显示,转染12 h后p53-shRNA3组穿膜细胞数目（59.36±5.33）显著高于未转染组（15.73±1.29）和空质粒组（16.01±1.34）（P均 < 0.05）。结论：RNAi沉默p53基因能够上调宫颈癌HeLa细胞STAT3的表达,并促进细胞的增殖及侵袭能力。     

短发夹RNA沉默促肝细胞再生磷酸酶-3基因表达对乳腺癌MCF-7细胞生长和侵袭能力的影响

目的构建以促肝细胞再生磷酸酶-3（PRL-3）为靶基因的短发夹状小干扰RNA（short hairpin RNA,shRNA）表达载体,并探讨PRL-3-shRNA表达载体对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响。方法 构建PRL-3基因特异性shRNA表达载体,使用脂质体法将PRL-3-shRNA表达载体转染入MCF-7细胞。采用Real-ti me PCR和Western blot分别检测转染后MCF-7细胞中PRL-3基因mRNA和蛋白的表达;运用四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）比色法检测转染后MCF-7细胞的增殖水平,用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况;采用Transwell小室法检测细胞侵袭力变化。计量资料采用单因素方差分析或重复测量方差分析。结果 酶切鉴定和测序分析证实PRL-3-shRNA表达载体成功构建。转染成功后,shRNA-1~3组PRL-3基因mRNA表达分别为（0.31±0.27）、（0.15±0.14）和（0.31±0.03）,与空白组和阴性组（1.00±0.00、0.98±0.18）相比,差异有统计学意义（P〈0.05）。PRL-3-shRNA-2组PRL-3蛋白的表达量明显低于阴性组和空白组（0.50±0.02比0.91±0.03和0.89±0.02,P〈0.05）;PRL-3-shRNA-2转染入MCF-7细胞后能明显降低其增殖水平（P〈0.05）;PRL-3-shRNA-2组凋亡率明显高于空白组和阴性组[（8.37±1.85）%比（1.60±1.58）%和（0.16±0.05）%,P〈0.05];Transwell小室侵袭实验显示,PRL-3-shRNA-2组穿膜细胞数明显低于阴性组和空白组（P〈0.05）。结论 沉默PRL-3基因表达可抑制MCF-7细胞的增殖,促进凋亡,抑制其侵袭能力     

siRNA敲减DNMT1表达对T-cadherin基因甲基化及结肠癌细胞生物学行为的影响

目的 肿瘤的发生、发展和侵袭转移是影响结肠癌治疗的重要原因,有研究发现DNA甲基化状态在肿瘤的发生、发展中起着重要作用,抑制T-cadherin表达可增强肿瘤细胞侵袭和迁移能力.本研究探讨siRNA敲减DNA甲基转移酶1(DNA methyl transferase 1,DNMT1)基因表达对结肠癌细胞T-cadherin基因甲基化及细胞生物学行为影响.方法 设计针对DNMT1的siRNA1、siRNA2和siRNA3重组质粒,分别转染HT-29、SW620和HCT116细胞系,采用实时荧光定量PCR检测DNMT1表达,以筛选敲减效率最高的DNMT1 siRNA和细胞系.用敲减效率最高的DNMT1 siRNA转染相应细胞系,采用甲基化特异性PCR检测T-cadherin甲基化水平,采用实时荧光定量PCR和蛋白印迹法检测T-cadherin表达.用敲减效率最高的DNMT1 siRNA转染相应细胞系,采用噻唑蓝比色法、流式细胞术、Transwell和细胞划痕实验检测细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移情况,观察敲减DNMT1对细胞生物学行为的影响;同时设置T-cadherin shRNA重组质粒转染组,观察同时敲减DNMT1和T-cadherin对细胞生物学行为的影响.结果 DNMT1 siRNA1重组质粒对HT-29细胞系DNMT1的敲减效果最好.DNMT1 siRNA1转染HT-29细胞后,DNMT1组T-cadherin基因甲基化水平明显低于空质粒组和空白组,DNMT1组与空质粒组(F=314.182)和空白组(F=283.625)差异有统计学意义,均P<0.001.DNMT1组和联合组DNMT1 mRNA表达量(0.27±0.08)和蛋白表达量(0.41±0.12)显著低于空质粒组和空白组.其中mRNA表达,DNMT1组与空质粒组(F=544.581)和空白组(F=525.811)组差异有统计学意义,均P<0.001;联合组与空质粒组(F=507.501)和空白组(F=494.958)也差异有统计学意义,均P<0.001.蛋白表达量,DNMT1组与空质粒组(F=217.550)和空白组(F=275.469)差异有统计学意义,均P<0.001:联合组与空质粒组(F=321.707)和空白组(F=407.225)也差异有统计学意义,均P<0.001:而DNMT1组和联合组比较mRNA(F=0.002,P=0.965)和蛋白表达量(F=0.811,P=0.394)均差异无统计学意义.DNMT1组T-cadherin mRNA表达量(1.17±0.34)和蛋白表达量(1.38±0.54)显著高于联合组、空质粒组和空白组.其中mRNA表达,DNMT1组与联合组(F=433.103)、空质粒组(F=313.768)、空白组(F=372.118)差异有统计学意义,均P<0.001.对于蛋白表达量,DN-MT1组与联合组(F=89.315)、空质粒组(F=156.745)、空白组(F=196.702)差异有统计学意义,均P<0.001.而联合组与空质粒组(F=1.310,P=0.262;F=0.144,P=0.714)和空白组(F=3.713,P=0.064;F=0.038,P=0.850)的mRNA和蛋白表达量比较差异无统计学意义.与联合组、空质粒组和空白组比较,DNMT1组第24、36、48、72 h的A值显著减小,F组别=14.479,P<0.001;F时间=37.755,P<0.001.DNMT1组与联合组(F=1004.194,P<0.001)、空质粒组(F=1190.815,P<0.001)、空白组(F=781.018,P<0.001)比较细胞总凋亡率显著升高;DNMT1组穿膜细胞数目为(61.3±10.7)个,与联合组(F=86.730,P<0.001)、空质粒组(F=282.962,P<0.001)、空白组(F=152.538,P<0.001)比较显著减少.DNMT1组细胞迁移距离为(235.8±6.3)μm,与联合组(F=2535.55,P<0.001)、空质粒组(F=9767.233,P<0.001)、空白组(F=8420.830,P<0.001)比较显著减少.而联合组与空质粒组和空白组比较,A值、细胞总凋亡率、穿膜细胞数目和细胞迁移距离均差异无统计学意义,P>0.05.结论 DNMT1 siRNA1可有效敲减HT-29细胞DNMT1表达,逆转T-cadherin高甲基化状态并上调其表达.敲减DNMT1可明显抑制HT-29细胞增殖,促进其凋亡,降低其侵袭和迁移能力;而同时敲减T-cadherin能够逆转此种现象,说明敲减DNMT1引起的细胞生物学行为改变可能是通过T-cadherin来实现的.     

Notch1基因表达对急性T淋巴细胞白血病SupT1细胞增殖、凋亡的影响及其机制

目的探讨Notch信号通路与急性T淋巴细胞白血病发生、发展的关系。方法利用携带Notch1特异性和非特异性shRNA的慢病毒载体包装成的病毒颗粒感染急性T淋巴细胞白血病SupT1细胞,采用CCK．8法检测细胞抑制率;采用流式细胞术检测细胞凋亡率（AnnexinV＋／7-AAD一和AnnexinV＋／7-AAD＋）;采用实时荧光定量PCR法检测Notch1受体基因及下游靶基因的表达水平。结果Notch1干扰组、空白对照组和空载体组96h的细胞增殖抑制率分别为0．902±0．013、0、0．486±0．084,干扰组较空白对照组、空载体组升高（均P〈0．05）;三组细胞早期凋亡率分别为（15．27±0．31）％、（5．57±0．25）％、（5．80±0．20）％,干扰组较空白对照组、空载体组升高（均P〈0．05）;而各组细胞晚期凋亡率无明显变化（均P〉0．05）。干扰组细胞中Notch1受体基因及其下游靶基因Hes1、c-myc、NF-κB在48、72、96h的mRNA相对表达量均较空白对照组及空载体组降低（均P〈0．05）。结论特异性Notch1-shRNA可有效下调Notch1mRNA的表达,并降低其下游靶基因的表达水平。Notch1表达下调可以抑制急性T淋巴细胞白血病SupT1细胞增殖,促进supT1细胞的早期凋亡。     

甲状腺激素受体βΔ对大鼠乳腺癌SHZ-88细胞增殖及凋亡的影响

目的 探讨甲状腺激素受体βΔ（thyroid hormone receptor βΔ, TRβΔ）对大鼠乳腺癌SHZ-88细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制。方法 将真核表达载体pcDNA3.1-TrβΔ及空载体pcDNA3.1分别转染体外培养的SHZ-88细胞,并给予10 nmol/L T3干预。CCK-8（Cell Counting Kit-8）法分析细胞的增殖活力;Annexin V/PI和JC-1荧光染色,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞线粒体膜电位变化;ELISA法检测细胞组蛋白/DNA碎片;定量PCR检测细胞半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-9（Cysteinylaspartate specific proteinase-9, Caspase-9）、Caspase-3基因表达;比色法检测Caspase-9和Caspase-3活性。结果 与空载体pcDNA3.1转染组相比,pcDNA3.1-TrβΔ转染组明显抑制SHZ-88细胞的增殖、增加细胞组蛋白/DNA碎片和凋亡细胞百分比、降低线粒体膜电位、上调Caspase-9、Caspase-3基因的表达并促进Caspase-9及Caspase-3的活化（P<0.05）;给予T3后可明显增强上述作用（P<0.05）。结论 TRβΔ可抑制SHZ-88细胞的增殖并促进其发生凋亡,该作用可能通过降低线粒体膜电位,激活Caspase-9及Caspase-3蛋白, 启动内源性细胞凋亡途径实现,且该作用受T3调节。     

miRNA-618对急性单核细胞白血病THP-1细胞增殖和凋亡调控的研究

目的探讨miRNA-618(miR-618)对急性单核细胞白血病THP-1细胞增殖和凋亡的影响。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测miR-618在THP-1细胞和健康人外周血分离的单核细胞中的相对表达量。构建过表达miR-618质粒载体,以空载体作为阴性对照,将二者分别转染THP-1细胞,设定为miR-618过表达组和阴性对照组。采用CCK-8法和流式细胞术分别检测各组THP-1细胞增殖和凋亡情况。采用TargetScan软件预测miR-618靶基因,通过荧光素酶报告基因实验对其进行验证。采用蛋白质印迹法检测miR-618过表达组或阴性对照组的THP-1细胞和健康人外周血单核细胞中预测的miR-618靶基因蛋白表达的水平。结果PCR结果显示,与健康人外周血分离的单核细胞相比,THP-1细胞中miR-618表达量低(P<0.05)。CCK-8法检测结果显示,与阴性对照组比较,miR-618过表达组THP-1细胞增殖能力降低(转染0、24、48、72 h细胞吸光度值:0.20±0.03比0.20±0.03、0.28±0.02比0.35±0.03、0.34±0.03比0.43±0.04、0.39±0.02比0.53±0.05,均P<0.05),细胞晚期凋亡率升高[(27.1±0.1)%比(14.9±0.1)%,t=2.13,P=0.03]。TargetScan软件预测miR-618靶基因为ARPP19。荧光素酶报告基因实验结果显示,转染野生型ARPP19基因质粒+miR-618基因质粒组的THP-1细胞相对荧光素酶活性均高于空白对照组和转染野生型ARPP19基因质粒+miR-618空载质粒组(0.170±0.003比0.100±0.004、0.100±0.001,均P<0.05)。蛋白质印迹法检测结果显示,miR-618过表达组THP-1细胞ARPP19蛋白表达水平低于阴性对照组,而两组健康人外周血单核细胞中ARPP19蛋白表达水平相近。结论miR-618可能通过抑制急性单核细胞白血病THP-1细胞ARPP19的表达而抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。