Neuropilin-1的干扰RNA对胃癌细胞株AGS生物学行为的影响

目的:探讨神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1,NRP-1)的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对人胃腺癌细胞株AGS某些生物学行为的影响.方法:通过脂质体lip-2000分别将NRP-1特异性siRNA、control siRNA转染入人胃腺癌AGS细胞株作为转染组、无意义序列组,加入PBS的细胞作为空白对照组,采用MTT法检测三组细胞24h、48h、72h的增殖情况;Transwell小室侵袭和迁徙实验检测细胞的迁徙和侵袭能力.结果:转染后,转染组细胞的增殖能力在24h、48h和72h与对照组相比,均显著下降(P=0.00).小室迁徙及侵袭实验表明:与对照组相比,转染组的胃癌AGS细胞迁徙能力显著下降,差异具有统计学意义(P＜0.05).转染组的胃癌AGS细胞侵袭能力显著下降,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:Neuropilin-1的siRNA能够明显影响人胃癌细胞株AGS的某些生物学行为.     

RNAi沉默KPNA2对人膀胱癌细胞系5637转移潜能的影响

目的 探讨RNA干扰技术(RNAinterference,RNAi)沉默KPNA2(karyopherin a2)基因表达对人膀胱癌细胞系5637迁移和侵袭能力的影响.方法 实验分为siRNA敲低组和阴性对照组.siRNA敲低组设计合成靶向KPNA2序列的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),用LipofectaminTM 2000方法瞬时转染膀胱癌细胞系5637;阴性对照组采用无关序列RNA采集.转染后48 h,应用蛋白质印迹法检测KPNA2的蛋白表达;Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力.结果 蛋白质印迹法检测结果显示,膀胱癌5637细胞转染KPNA2特异性siRNA 48 h,与阴性对照组相比较,敲低组细胞KPNA2蛋白表达水平下降92.1％,差异有统计学意义,P=0.004 3.Transwell实验检测结果显示,敲低组细胞迁移能力明显受到抑制,细胞抑制率为61.7％,差异有统计学意义,P=0.038;敲低组细胞侵袭能力也明显受到抑制,细胞抑制率为58.6％,差异有统计学意义,P=0.026.结论 靶向KPNA2的特异siRNA能够下调KP-NA2在膀胱癌5637细胞中的蛋白表达水平,有效抑制膀胱癌5637细胞的迁移和侵袭能力.以KPNA2为靶点的RNA干扰技术有望成为膀胱癌基因治疗的新方法.     

Galectin-3表达抑制对BT-549细胞系增殖和凋亡影响观察

目的：观察抑制Galectin-3表达与BT-549细胞系增殖和凋亡的关系,探讨利用RNA干扰技术作为三阴性乳腺癌基因治疗方法的可行性。方法：设计并化学合成Galectin-3小干扰片段并顺势转染乳腺癌细胞系BT-549（为Galec—tin-3siRNA组）,以未转染细胞为空白对照,以转染阴性干扰为阴性对照,荧光倒置显微镜和实时定量PCR验证干扰结果,XTT方法观察干扰后24、48、72和96h各组细胞增殖吸光度（A值）,流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况,划痕实验和Tral2swell实验比较不同组间细胞迁移和侵袭情况,以上实验均重复3次。结果：空白对照组、阴性对照组和Galectin一3siRNA组Galectin-3mRNA相对含量分别为（0．078±0．003）、（0．069±0．004）和（0．015±0．001）,差异有统计学意义,F=486．97,P〈O．001。XTT法检测结果显示,同一组不同时间点之间差异有统计学意义,P值均〈O．00l;同一时间点各组之间差异亦有统计学意义,P值均〈O．001。随着时间推移,空白组和阴性对照组细胞继续生长,Galectin-3siRNA组细胞生长抑制,数量逐渐减少,干扰时间和实验分组之间存在交互效应,F=26．43,P〈0．001。流式细胞仪检测结果显示,Galectin-3siRNA组、空白对照组和阴性对照组凋亡率分别为（26．83±2．15）％、（2．73土0．18）％和（5．86土0．51）％,差异有统计学意义,F=24537．92,P〈0．00l。空白对熙组、阴性对照组和Galectin-3siRNA组愈合率分别为（91．47±4．39）％、（82．36土3．68）％和（52．26士1．95）％,差异有统计学意义,F=213．71,P〈0。001。转染Galectin-3siRNA的乳腺癌细胞浸润穿过Matrigel膜的细胞数（169．36±23．71）要比空白对照组（480．80土30．80）和阴性对照组（320．70±28．12）的细胞数显著减少,差异有统计学意义,F=115．20,P〈0．001。结论：Galectin-3siRNA成功转染入BT-549细胞,并抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,降低其迁移侵袭能力,为三阴性乳腺癌基因治疗提供实验依据。     

c-Met siRNA 对食管鳞癌细胞CE81T-4生物学特性的影响

[目的]探讨c-Met siRNA对食管鳞癌细胞CE81T-4生物学特性的影响.[方法]利用siRNA技术,采用带有荧光的慢病毒包装的c-Met siRNA稳定转染CE81T-4,并设立转染慢病毒包装的c-Met siRNA的CE81T-4为实验组,转染空慢病毒作为阴性对照,未转染CE81T-4细胞作为空白对照.于荧光倒置显微镜下观察转染效果.采用qRT-PCR检测三组细胞中c-Met mRNA的表达量,Western blot检测c-Met蛋白表达.利用MTT、划痕实验、Transwell及流式细胞术分别检测细胞的增殖、迁移、侵袭、周期及凋亡.[结果]转染c-Met siRNA后,荧光倒置显微镜下可见广泛绿色荧光表达;实验组c-Met mRNA的表达量(0.1758±0.0150)显著低于阴性对照组(0.3384±0.0346)和空白对照组(0.3759±0.0252)(P＜0.05).实验组c-Met蛋白表达显影较空白对照组及阴性对照组低;实验组细胞的增殖能力显著降低,与阴性对照组和空白对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).Transwell体外侵袭实验提示实验组的侵袭迁移个数为135±11.79,显著低于空白对照组(186±14.98)及阴性对照组(178±12.53)(P＜0.05).实验组细胞凋亡率(17.87％±1.60％)高于阴性对照组(4.93％±2.49％)及空白对照组(4.37％±1.60％)(P＜0.05).实验组G0/G1期细胞比例(48.57％±4.91％)较阴性对照组(38.13％±3.23％)和空白对照组(37.07％±2.32％)显著增多(P＜0.05).[结论]c-MetsiRNA可增加食管鳞癌细胞的凋亡率,阻滞细胞周期在G0/G1期,降低细胞增殖、迁移及侵袭能力.     

Sox4表达抑制对宣威地区女性肺癌细胞凋亡影响及其机制的探讨

目的:研究靶向抑制sox4基因的表达对宣威地区女性肺癌细胞凋亡的影响,并初步探讨其作用机制.方法:构建靶向抑制转录因子sox4的shRNA重组载体pGFP-V-RS-sox4shRNA并转染宣威地区女性肺癌细胞XWLC-05,以转染pGFP-V-RS-scramshRNA的XWLC-05细胞及亲本XWLC-05细胞作为对照,研究sox4表达抑制对Caspase-3表达、细胞形态、细胞周期和凋亡率等凋亡指标的影响.使用Caspase-3抑制剂z-VAD-FMK处理转染细胞,检测上述细胞凋亡指标.结果:成功构建了能高效抑制sox4基因表达的pGFP-V-RS-A-sox4shRNA重组载体；转染后48及72 h,实验组细胞sox4 mRNA表达水平分别为0.09±0.018及0.44±0.06,比转染后24 h降低了88％和40％,与同一时段中的阴性对照及空白对照组相比表达水平明显降低(P＜0.05),其中以转染后48 h的抑制最为明显,而Caspase-3 mRNA表达与阴性对照及空白对照组相比均明显升高(P＜0.05),以48 h升高最明显；空白对照组与阴性对照组间比较,转染48及72 h后sox4 mRNA(P=0.071；P=0.063)和Caspase-3 mRNA(P=0.103;P=0.229)的表达水平差异无统计学意义；抑制sox4基因的表达后细胞出现典型的凋亡形态学改变；流式细胞术(FCM)检测显示,转染干扰质粒后48 h,细胞出现明显的亚二倍体峰,实验组细胞的凋亡率平均为(34.8±3.37)％,显著高于阴性对照组(0.45±0.05)％及空白对照组(0.44±0.06)％,P均为0.000.经z-VAD-FMK阻断Caspase-3酶活性后,实验组细胞中活化的Caspase-3 (13.6±1.76)％显著低于阴性对照组(50.5±6.15)％,差异有统计学意义,P=0.000；实验组细胞的凋亡率(10.8±1.05)％也明显低于阴性对照组细胞(38.3±3.16)％,P=0.000.结论:抑制sox4的表达可促进宣威地区女性肺癌细胞凋亡；转录因子sox4可能通过抑制Caspase-3依赖的凋亡途径而促进宣威地区女性肺癌的发生发展.     

泌乳素诱导蛋白表达下调对乳腺癌MDA-MB-453细胞迁移、粘附和侵袭的影响

目的 探讨泌乳素诱导蛋白（PIP）表达下调对乳腺癌MDA-MB-453细胞迁移、粘附和侵袭能力的影响。方法 采用脂质体法转染PIP-siRNA至乳腺癌MDA-MB-453细胞作为实验组,同时设阴性对照组（转染control-siRNA）和空白对照组（未转染）,荧光显微镜观察转染效率,逆转录PCR和免疫细胞化学技术检测转染48h各组的PIP表达。通过细胞实验分别检测转染PIP-siRNA 48h乳腺癌细胞的迁移、粘附和侵袭能力。结果 乳腺癌MDA-MB-453细胞的转染效率为90％。转染PIP-siRNA 48h,实验组乳腺癌细胞PIP-mRNA和蛋白表达分别为0.035±0.003和483.3±59.8,均低于阴性对照组和空白对照组（P＜0.05）。转染PIP-siRNA 48h,实验组迁移细胞数量为21.0±5.3,低于阴性对照组（124.0±15.4）和空白对照组（118.0±12.5）,差异均有统计学意义（P＜0.05）;实验组接种30min和60min的细胞粘附率较阴性对照组分别降低（42.6±2.7）％、（48.5±3.1）％,差异均有统计学意义（P＜0.05）;实验组穿过基质膜的细胞数为31.0±4.2,低于阴性对照组（119.0±12.5）和空白对照组（127.0±13.7）,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 下调PIP基因表达可明显抑制乳腺癌MDA-MB-453细胞的迁移、粘附和侵袭能力,提示PIP在乳腺癌细胞的转移潜能中发挥重要作用。     

E6-AP基因在乳腺癌MDA-MB-231细胞中调节膜联蛋白A2的表达

目的检测E6-AP基因及膜联蛋白A2(Annexin A2)在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达,探讨其对癌细胞增殖、凋亡及浸润转移的影响。方法设计1条无关序列Negative-siRNA作为阴性对照组和针对E6-AP基因的3条特异性E6-AP-siRNAs片段转染至MDA-MB-231细胞内作为实验组,未经处理细胞作为空白对照组,加入脂质体处理的细胞为脂质体组,利用RT-PCR检测干扰E6-AP后在MDA-MB-231细胞中E6-AP和Annexin A2 mRNA相对表达水平。选择出转染效率最高的E6-APsiRNA1组及阴性对照组、空白对照组继续行后续实验。Western blot检测干扰E6-AP后E6-AP和Annexin A2在MDA-MB-231细胞中的蛋白的相对表达水平。利用CCK-8试剂盒法、流式细胞术、Transwell小室侵袭实验分别检测干扰E6-AP后MDA-MB-231细胞的增殖、凋亡、侵袭能力。基因的mRNA及蛋白表达水平、细胞凋亡率及细胞数的组间比较采用方差分析,两两比较采用LSD法,吸光度比较采用重复测量的方差分析。结果转染72 h后,E6-AP基因干扰后各实验组(E6-AP-siRNA1组、E6-AP-siRNA2组、E6-AP-siRNA3组)及空白对照组、阴性对照组及脂质体组中的E6-AP mRNA相对表达水平分别为0.159±0.003、0.325±0.006、0.229±0.007、0.593±0.031、0.594±0.012、0.612±0.016,Annexin A2 mRNA相对表达水平分别为0.929±0.017、1.013±0.082、0.992±0.024、1.341±0.037、1.323±0.010、1.326±0.012,差异均有统计学意义(F=850.792、417.447,P均0.050)。转染72 h后,E6-AP-siRNA1组、空白对照组和阴性对照组中E6-AP及Annexin A2蛋白相对表达水平为分别为0.271±0.017、0.492±0.018、0.477±0.016及0.447±0.034、0.887±0.022、0.849±0.033,组间差异均有统计学意义(F=256.850、350.149,P均0.050)。转染24、48、72、96 h后,E6-AP-siRNA1组、阴性对照组和空白对照组间比较,不同时间点之间比较,细胞吸光度差异均有统计学意义(F=524.828,P0.001;F=904.079,P0.001);分组与时间点存在交互作用(F=28.116,P0.001)。转染72 h后,空白对照组、阴性对照组、E6-AP-siRNA1组的凋亡率分别为2.959±0.117、3.097±0.070、10.812±0.199,组间差异有统计学意义(F=3110.005,P0.050)。Transwell检测E6-AP-siRNA1组、空白对照组、阴性对照组中细胞穿透Matrigel胶到达Transwell下室的细胞数分别为99±5、96±6、62±7,组间差异有统计学意义(F=55.404,P0.001)。结论干扰E6-AP基因可使Annexin A2表达下调,同时可诱导MDA-MB-231细胞的凋亡,其增殖、侵袭能力也受到抑制。     

沉默锌指蛋白217基因对食管鳞癌EC9706细胞增殖和侵袭能力的影响

目的 探讨锌指蛋白217基因(ZNF217)在食管鳞癌侵袭转移中的作用.方法 合成ZENF217基因的siRNA序列并转染对数生长期食管鳞癌EC9706细胞.设置转染无义序列siRNA和未转染EC9706细胞为阴性对照和空白对照.半定量RT-PCR和Western blot方法分别检测转染48 h后3组细胞ZNF217 mRNA和蛋白的表达变化;侵袭小室检测3组细胞穿膜细胞数变化;MTT法分析3组细胞增殖能力的变化.结果 与空白对照组和阴性对照组比较,转染ZNF217 siRNA组EC9706细胞ZNF217 mRNA和蛋白表达均显著下降,差异有统计学意义(P＜0.05);转染ZNF217 siRNA组EC9706细胞穿膜细胞数显著下降,差异有统计学意义(P ＜0.05);ZNF217 siRNA能明显抑制EC9706细胞体外增殖能力(P＜0.05).结论 ZNF217基因表达下降能显著抑制EC9706细胞体外侵袭力和增殖能力,ZNF217基因有望成为食管癌基因治疗的有效靶点.     

Cathepsin B表达对肝癌细胞系HepG2转移潜能影响的观察

目的:探讨小干扰RNA降低组织蛋白酶B(Cat B)基因表达对HepG2细胞增殖、运动及侵袭能力的影响。方法:将肝癌HepG2细胞分为Cat B siRNA干扰组、阴性对照siRNA干扰组(阴性对照组)、空脂质体组和空白对照组。脂质体转染法将Cat B siRNA转染入HepG2细胞;半定量RT-PCR和蛋白质印迹法检测转染后48hCat B的表达变化;收集转染后48h的细胞,再分别以CCK-8法、划痕实验和Transwell侵袭实验检测各组细胞增殖、运动及侵袭能力的变化。结果:半定量RT-PCR和蛋白质印迹法检测Cat B mRNA和蛋白水平表达变化,Cat B siRNA干扰组较其余各组均明显降低,差异有统计学意义,P<0.05。CCK-8法测细胞生长曲线示,将转染后48h的细胞种入96孔板后12h,Cat B siRNA干扰组增殖能力较对照组明显降低,差异有统计学意义,P<0.05。划痕实验中,Cat B siRNA干扰组细胞迁移距离较对照组明显降低,差异有统计学意义,P<0.05。Transwell侵袭实验中,Cat B siRNA干扰组穿膜细胞数较对照组明显降低,差异有统计学意义,P<0.05。结论:特异性干扰Cat B基因表达可抑制HepG2细胞的增殖、运动及侵袭能力。     

S100A4调节MMP-13表达对甲状腺癌细胞侵袭能力的影响

目的探讨靶向S100A4对甲状腺癌细胞侵袭和转移的影响。方法以甲状腺癌BCPAP细胞或暴露于MMP-13抗体24h后的BCPAP细胞为研究对象,将S100A4基因小干扰RNA(siRNA)或S100A4/cDNA通过脂质体转染法转染BCPAP细胞;48h后采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测S100A4mRNA、MMP-13mRNA和蛋白水平;Transwell侵袭实验和划痕实验检测BCPAP细胞侵袭能力的改变。结果转染S100A4siRNA 48h后,siRNA组S100A4mRNA表达量为(0.25,0.12),阴性对照组(NC)为(1.19,0.41),空白对照(Blank)组为(1.22,0.38),差异有统计学意义,H=13.68,P<0.05;siRNA组S100A4蛋白表达量为(0.40,0.21),NC组为(0.88,0.29),Blank组为(0.91,0.36),差异有统计学意义,H=15.74,P<0.05;siRNA组MMP-13mRNA表达量为(0.23,0.13),NC组为(1.08,0.28),Blank组为(1.12,0.37),差异有统计学意义,H=14.92,P<0.05;siRNA组MMP-13蛋白表达量为(0.42,0.16),NC组为(1.03,0.35),Blank组为(1.07,0.41),差异有统计学意义,H=17.64,P<0.05。质粒瞬时转染48h后,S100A4cDNA组S100A4蛋白表达量为(0.96,0.34),pCMV2-Myc组为(0.35,0.19),Blank组(0.37,0.22),差异有统计学意义,H=19.76,P<0.05。S100A4cDNA组MMP-13蛋白表达量为(1.21,0.47),pCMV2-Myc组为(0.38,0.21),Blank组为(0.37,0.23),差异有统计学意义,H=21.53,P<0.05;anti-MMP-13组蛋白表达量为(0.25,0.14),与S100A4cDNA组相比差异有统计学意义,z=5.89,P<0.05。细胞转染siRNA 48h后,Blank组穿膜细胞数为(37.86,3.52),NC组为(38.59,4.74),siRNA组为(11.38,2.16),差异有统计学意义,H=16.28,P<0.05;Blank组划痕48h后宽度为(0.24,0.11)cm,NC组为(0.28,0.05)cm,siRNA组为(1.98,0.13)cm,差异有统计学意义,H=16.65,P<0.05。质粒瞬时转染细胞48h后,Blank组穿膜细胞数为(39.68,3.76),pCMV2-Myc组为(41.66,8.02),S100A4cDNA组为(70.14,7.85),差异有统计学意义,H=19.24,P<0.05;anti-MMP-13组为(43.56,7.86),与S100A4cDNA组相比差异有统计学意义,z=5.87,P<0.05;Blank组划痕48h后宽度为(0.31,0.11)cm,pCMV2-Myc组为(0.29,0.09)cm,S100A4cDNA组为0,差异有统计学意义,H=21.84,P<0.05;anti-MMP-13组为(1.96,0.17)cm,与S100A4cDNA组相比差异有统计学意义,z=12.03,P<0.05。结论S100A4通过调节MMP-13表达影响甲状腺癌细胞的侵袭能力,靶向S100A4可下调MMP-13表达抑制甲状腺癌的侵袭转移。     

下调RRM1基因增强胃癌AGS细胞对奥沙利铂敏感性的实验研究

目的 探讨下调RRM1基因对人胃癌AGS细胞奥沙利铂敏感性的影响。方法 人工构建RRM1 siRNA1、RRM1 siRNA2、RRM1siRNA3 3条特异性干扰片段转染至胃癌AGS细胞,同时设空白对照组和阴性对照组（非特异性干扰片段siRNA）;实时荧光定量PCR及蛋白印迹法检测转染后胃癌AGS细胞RRM1 mRNA及蛋白表达,并筛选出转染效果最佳的干扰片段;CCK-8检测不同浓度奥沙利铂处理后各组胃癌细胞的增殖抑制率并计算半数抑制浓度（IC50）;流式细胞仪检测奥沙利铂处理后各组胃癌细胞的凋亡率。结果 RRM1 siRNA1、RRM1 siRNA2、RRM1 siRNA3 3组胃癌AGS细胞RRM1 mRNA表达水平较空白对照组分别下调28％、40％和82％。干扰效果最佳的RRM1 siRNA3组AGS细胞RRM1蛋白相对表达量为0.135±0.017,明显低于空白对照组及阴性对照组的0.641±0.003、0.636±0.056（P＜0.05）,故选择siRNA3干扰片段用于后续实验。不同浓度奥沙利铂作用于各组AGS细胞24 h,RRM1 siRNA3组的细胞增殖抑制率均显著低于空白对照组及阴性对照组（P＜0.05）,3组胃癌AGS细胞的IC50分别为3.34、5.85和5.13 μmol／L。经3 μmol／L奥沙利铂处理上述3组细胞24 h后,RRM1 siRNA3组的凋亡率为（35.84±2.0）％,显著高于空白对照组和阴性对照组的（27.32±2.6）％和（28.26±1.5）％,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论 下调RRM1基因可增加胃癌细胞对奥沙利铂敏感性,为预测胃癌以奥沙利铂为基础的化疗方案的疗效及制订个体化治疗方案提供了一定的理论依据。     

沉默mGluR5对卵巢癌SKOV3细胞生物学特性的影响及其机制研究

目的 探讨小干扰RNA（siRNA）靶向代谢型谷氨酸受体5（mGluR5）对卵巢癌SKOV3细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响及可能的机制。方法 采用靶向mGluR5表达的特异siRNA 转染卵巢癌SKOV3细胞（转染组）,同时设置转染无义序列的阴性对照组。转染48 h,采用实时荧光定量PCR（QPCR）检测siRNA对mGluR5的沉默效果;采用CCK-8法、EdU细胞荧光染色实验、Hoechst 33342细胞染色实验、划痕实验检测沉默mGluR5表达后SKOV3细胞的活性、增殖、凋亡和迁移情况;采用Western blotting检测PTEN／Akt信号通路相关蛋白的表达情况。结果 QPCR检测显示,转染组中mGluR5 mRNA的表达水平降至（18.3±2.3）％,显著低于阴性对照组（P＜0.05）。CCK-8法检测显示,转染72 h阴性对照组的吸光值为4.1±0.2,高于转染组的2.4±0.3（P＜0.05）。EdU免疫荧光染色实验显示,转染48 h阴性对照组的细胞增殖率为（22.4±2.3）％,高于转染组的（9.2±1.2）％（P＜0.05）。Hoechst 33342细胞染色实验显示,转染48 h阴性对照组的细胞凋亡率为（6.2±1.3）％,低于转染组的（28.2±2.2）％（P＜0.05）。划痕实验显示,阴性对照组的相对划痕愈合比例为（100.0±2.1）％,显著高于转染组的（48.6±4.3）％（P＜0.05）。Western blotting检测显示,转染组PTEN蛋白的表达增加,p-Akt蛋白的表达降低（P＜0.05）;而Akt蛋白无明显变化（P＞0.05）。结论 沉默mGluR5表达能显著抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖,促进凋亡,降低细胞迁移能力,该过程可能与激活PTEN／Akt信号通路有关。     

Wilms瘤基因1低表达和过表达乳腺癌细胞模型的建立

目的 应用RNA干扰（RNAi）和RNA激活（RNAa）技术,分别构建小干扰RNA（siRNA）和双链RNA（dsRNA）,建立Wilms瘤基因1（WT1）低表达和过表达的乳腺癌细胞模型.方法 以国外学者提供的3条序列（siRNA-516 、siRNA-803、siRNA-1029）构建WT1 siRNA干扰表达WT1,以研究已证实可上调WT1表达的序列（dsRNA-319）构建dsRNA过表达WT1,通过脂质体（LipofectamineTM2000）分别将siRNA和dsRNA转入MDA-MB-321和MCF-7细胞.WT1有效siRNA筛选实验分为6组：WT1siRNA-516、WT1 siRNA-803、WT1 siRNA-1029、阴性对照、脂质体组和空白细胞组;观察转染效率的时间点为转染后24、48、72 h.WT1 dsRNA的筛选实验分为3组：WT1 dsRNA-319、阴性对照组和空白细胞组;观察转染效率的时间点为转染后48、72、96 h.通过实时定量PCR（qRT-PCR）和Westem Blotting筛选作用效果最明显的siRNA和dsRNA.使用单因素方差分析进行统计学分析.结果 成功构建WT1siRNA-516、WT1 siRNA-803和WT1 siRNA-1029共3个siRNA,并转染到MDA-MB-231细胞中,转染效率达90％以上.上述3个WT1 siRNA均能够抑制WT1 mRNA和蛋白的表达,以转染后48 h WT1 siRNA-1029的效果最为显著[WT1 siRNA-1029组WT1 mRNA表达水平与空白细胞组相比显著降低（0.49±0.02比1.00±0.08,P=0.00）,其蛋白表达水平也明显降低].成功将WT1 dsRNA-319转染到MCF-7细胞中,转染效率达90％以上.50 μmol/L的WT1 dsRNA-319转染后96 h,MCF-7细胞的WT1过表达最为显著[WT1 dsRNA-319组的WT1 mRNA表达水平与空白细胞组相比显著升高（319.06±14.84比1.00±0.07,P=0.00）,其蛋白表达水平也明显升高].结论 成功建立低表达WT1的MDA-MB-231细胞和过表达WT1的MCF-7细胞模型,为后续进一步研究WT1在乳腺癌中的生物学行为奠定了基础.     

FAM21对绒毛膜癌细胞系JEG-3迁移和侵袭功能的影响

目的 探讨FAM21对人绒毛膜癌细胞系JEG-3迁移和侵袭功能的影响。方法 设计并合成2条FAM21特异性小分子干扰RNA（siRNA 1和siRNA 2）及1条随机序列siRNA（control siRNA）,瞬时转染JEG-3细胞,依次设为siRNA1组、siRNA 2组和control siRNA组。同时选取未行转染的JEG-3细胞作空白对照（空白组）。普通PCR法检测正常胎盘滋养细胞株HTR-8/Sveno和JEG-3细胞中FAM21 mRNA水平。分别于转染后24、48h采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测各组FAM21的mRNA和蛋白水平,Transwell法检测各组转染24h后的细胞迁移和侵袭能力,实时荧光定量PCR检测各组转染24h后的迁移侵袭相关基因（KISS 1、BRMS1和INSL4）的mRNA水平。结果 JEG-3细胞的FAM21 mRNA水平高于HTR-8／Svneo细胞（P＜0.05）。siRNA 1组和siRNA 2组转染24h后的FAM21 mRNA和转染48h后的FAM21蛋白水平均低于control siRNA组和空白组（P＜0.05）,转染24h后的迁移和侵袭能力均低于control siRNA组和空白组（P＜0.05）。siRNA 1组和siRNA 2组转染24h后的KISS-1和BRMS1 mRNA水平降低,而INSL4 mRNA水平升高,与其余两组比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）;control siRNA组和空白组上述指标的差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论 FAM21在人绒毛膜癌JEG-3细胞中具有调节迁移和侵袭的功能,在绒毛膜癌的病理机制中发挥了重要的作用。     

小干扰RNA沉默Bcl-2表达增强食管癌细胞放射敏感性研究

目的 探讨Bcl-2基因的特异性小干扰RNA (siRNA)对食管癌细胞(EC9706细胞)Bcl-2蛋白表达和凋亡的影响及放射增敏作用。方法 化学合成Bcl-2基因的siRNA,通过脂质体转染法转入EC9706细胞。流式细胞仪检测转染前后Bcl-2蛋白表达及细胞凋亡,成克隆分析siRNA联合X线照射对EC9706细胞的放射敏感性影响。结果 Bcl-2 siRNA1、Bcl-2 siRNA2、Bcl-2 siRNA3转染后Bcl-2蛋白在EC9706细胞中的阳性表达率分别为25.13％、38.87％、30.55％,较对照组的84.28％明显下降(t =4.01、3.04、3.64,P均＜0.05)。Bcl-2 siRNA1转染组凋亡率为33.86％,明显高于空白对照组的5.51％(t=6.55,P＜0.01)和阴性siRNA1转染组的5.59％(t=6.54,P＜0.01);Bcl-2 siRNA1联合X线照射的细胞凋亡率为56.76％,明显高于单纯照射组的24.51％(t=3.59,P＜0.05)。成克隆分析的Bcl-2 siRNA1转染加照射组D0、Dq、SF2值均低于单纯照射组,放射增敏比为1.33(D0值之比)。结论 Bcl-2基因的特异性siRNA可明显增强EC9706细胞的放射敏感性,具有良好临床应用前景。     

GOLPH3沉默对顺铂诱导的人上皮性卵巢癌 A2780／DDP 细胞凋亡的影响

目的：探究 GOLPH3对顺铂诱导的人上皮性卵巢癌 A2780／DDP 细胞凋亡的影响。方法：不同浓度顺铂处理 A2780和 A2780／DDP 细胞72h,MTT 检测半数抑制浓度 IC50,Western blot 检测 GOLPH3的表达。将培养细胞分为4组：A2780组及 A2780／DDP 组（对照组、Scrambled siRNA 组、GOLPH3 siRNA 组）。40μmol／L顺铂处理48h 后,MTT 检测对细胞活性的影响,流式细胞术检测对细胞凋亡的影响,Western blot 检测对Caspase －3、p －Akt 和 p －mTOR 蛋白表达的影响。Western blot 检测 mTOR 抑制剂雷帕霉素（Rapamycin）和PI3K／Akt 抑制剂（LY294002）对 Caspase －3蛋白表达的影响。结果：顺铂处理72h 时,A2780和 A2780／DDP细胞的 IC50分别为9．8μmol／L 和60．14μmol／L。与 A2780组相比,A2780／DDP 组 GOLPH3蛋白表达明显增加（P ＜0．05）。GOLPH3 siRNA 转染可显著下调 A2780／DDP 细胞中 GOLPH3蛋白的表达（P ＜0．05）。顺铂处理后,与 A2780／DDP 对照组相比,A2780组和 A2780／DDP 细胞 GOLPH3 siRNA 转染组细胞活性显著降低,顺铂敏感性增加,细胞凋亡率和 Caspase －3蛋白表达上调,p －Akt 和 p －mTOR 蛋白表达下调;LY294002和 Ra-pamycin 处理均显著增加 Caspase －3蛋白表达（P ＜0．05）。结论：GOLPH3沉默可通过抑制 Akt／mTOR 激活促进顺铂诱导的 A2780／DDP 细胞凋亡。     

微小RNA-92a靶向PTEN／Akt信号通路对鼻咽癌细胞增殖与凋亡的影响

目的 探讨微小RNA-92a（miR-92a）通过靶向PTEN／Akt信号通路对鼻咽癌HONE1细胞增殖与凋亡的调控作用。方法 采用Lipofectamine脂质体法向HONE1细胞转染miR-92a抑制剂（miR-92a组）和阴性对照（NC组）,设不行转染的HONE1细胞为对照组。转染成功后用实时荧光定量PCR（QPCR）检测miR-92a在不同细胞组中的表达情况;MTT法检测各组细胞的增殖率;流式细胞技术检测各组细胞的凋亡率;Western blotting实验检测PTEN／Akt信号通路中PTEN和p-Akt蛋白的表达量。结果 转染48 h miR-92a组与对照组和NC组相比,miR-92a的表达量明显降低（P＜0.05）,而对照组和NC组的差异无统计学意义（P＞0.05）。miR-92a组转染24、48、72、96 h的细胞增殖率分别为（84.51±2.74）％、（77.21±3.55）％、（62.07±3.57）％和（49.25±4.15）％,其中72、96 h的细胞增殖率低于对照组和NC组（P＜0.05）;miR-92a组转染48 h的细胞凋亡率为（46.12±1.79）％,高于对照组的（6.99±0.72）％和NC组的（8.42±0.81）％,差异有统计学意义（P＜0.05）;miR-92a组转染48 h PTEN和p-Akt蛋白的表达水平分别为0.61±0.12和0.37±0.09,对照组分别为0.41±0.11和0.73±0.14,NC组分别为0.39±0.08和0. 68±0.07,与对照组和NC相比,miR-92a组细胞的PTEN表达升高,p-Akt表达降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 通过抑制miR-92a的表达来抑制鼻咽癌细胞增殖且促进其凋亡,可能是通过负调控PTEN／Akt信号通路来实现的。     

CXCL12对宫颈癌细胞放射敏感性影响的实验研究

目的 探讨趋化因子12（CXCL12）在调控宫颈癌放疗敏感性中的作用。方法 采用阳离子脂质体法将CXCL12 siRNA转染至宫颈癌HeLa细胞（siRNA转染组）,另设置空白对照组和阴性对照组。采用不同剂量（4、8 Gy）照射上述各组HeLa细胞, CCK-8法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率,ELISA法和实时荧光定量PCR（QPCR）检测CXCL12表达变化,流式细胞仪检测CD44表达。结果 接受4 、8 Gy照射后siRNA转染组的细胞存活率分别为62.0％和44.0％,低于阴性对照组的79.0％和59.0％,差异有统计学意义（P＜0.05）;接受4 、8 Gy照射后siRNA转染组的细胞凋亡率分别为28.0％和51.0％,高于阴性对照组的21.0％和39.0％,差异有统计学意义（P＜0.05）。接受4 、8 Gy照射后siRNA转染组的CD44蛋白表达量为1.33±0.02和1.40±0.01,低于阴性对照组的1.55±0.02和1.85±0.02,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 沉默CXCL12可通过抑制细胞增殖、促进细胞凋亡来增加宫颈癌细胞的放射敏感性,CXCL12可能为宫颈癌放疗提供新的增敏靶点。     

下调微小RNA 3917对肺腺癌A549细胞#br# 增殖及PER2表达的影响#br#

目的 探讨微小RNA 3917（miR 3917）对肺癌细胞增殖及对生物钟基因Period2（PER2）表达的影响。方法 取复苏后的肺腺癌A549细胞培养至对数生长期,采用脂质体法向A549细胞转染10、20、50 nmol／L靶向miR 3917的 siRNA表达载体pEGFP miR 3917 siRNA质粒,转染48 h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达;根据实验设计分为对照组、空载体组和干扰组,空载体组及干扰组的质粒浓度均为50 nmol／L,采用实时荧光定量PCR（QPCR）检测转染48 h后的miR 3917相对表达量,QPCR和Western blotting分别检测转染48 h后的PER2 mRNA和蛋白水平,采用CCK 8法检测各组转染24、48、72 h的A549细胞增殖抑制率,双荧光素酶靶标实验验证miR 3917与PER2的相互关系。结果 QPCR检测发现对照组、空载体组和干扰组的miR 3917相对表达量依次为1007±0.018、1.068±0.084和0.171±0.052,干扰组的miR-3917相对表达量低于对照组和空载体组,差异有统计学意义（P＜0.05）。对照组、空载体组和干扰组的PER2 mRNA相对表达量依次为1060±0.129、1.086±0.229和2.920±0.927,蛋白表达量依次为0.204±0.046、0.183±0.043和0.512±0.117,干扰组的PER2 mRNA和蛋白水平均高于对照组和空载体组,差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组和空载体组比较,干扰组的A549细胞增殖能力下降,转染24、48、72 h后的增殖抑制率依次为（34.192±5.268）％、（33.527±6.603）％和（30.591±7.788）％,均高于其余两组,差异有统计学意义（P＜0.05）。miR 3917可显著抑制野生型PER2 3’UTR质粒转染细胞的荧光素酶活性,而对突变型PER2-3’UTR质粒转染细胞的荧光素酶活性并无影响。结论 下调miR-3917可抑制肺癌细胞增殖并升高PER2水平,miR-3917对PER2有靶向调控作用,可作为肺癌防治的新靶点。     

小干扰RNA靶向MIF对胃癌细胞SGC 7901增殖和凋亡的影响#br#

目的探讨靶向巨噬细胞移动抑制因子（MIF）的小干扰RNA（siRNA）对胃癌细胞SGC 7901增殖和凋亡的影响。 方法取对数生长期的SGC 7901细胞，采用脂质体法分别转染靶向人MIF的siRNA（siMIF组）或阴性对照序列（NC组），48 h后采用Western blotting检测MIF蛋白的表达情况，MTT法观察转染后24、48、72 h的细胞增殖情况，流式细胞仪检测转染后72 h的细胞凋亡率，Western blotting检测凋亡相关蛋白Bcl 2和Bax的表达变化。 结果siMIF组转染48 h后的MIF相对表达量为0321±0104，低于NC组的1078±0212，差异有统计学意义（P＜005）。siMIF组转染48～72 h后的细胞增殖率低于NC组，差异有统计学意义（P＜005）。转染MIF siRNA 72 h后，siMIF组的细胞凋亡率为（235±36）％，高于NC组的（47±17）％，差异有统计学意义（P＜005）。siMIF组Bcl 2的相对表达量为0663±0209，低于NC组的1129±0178，而Bax相对表达量为0981±0225，高于NC组的0587±0254，以上差异均有统计学意义（P＜005）。 结论siRNA靶向沉默MIF能够降低SGC 7901细胞中MIF蛋白表达，抑制SGC 7901细胞的增殖并促进凋亡，在胃癌的靶向治疗中有一定前景。