GDNF对Nurr 1基因的大鼠骨髓源神经干细胞的诱导分化作用

目的:利用胶质细胞系源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)对经过转染核相关因子1 (nuclear related factor 1, Nurr 1)基因的大鼠骨髓源神经干细胞(bone marrow stromal cells derived from neural stem cells,BMSCs-D-NSCs)进行培养和诱导分化,研究其能否促进Nurr 1-BMSCs-D-NSCs向多巴胺能神经元转化. 方法:(1)构建AAV-pcDNA3.1-Nurr 1载体;(2)诱导SD大鼠BMSCs分化为成熟的神经元样细胞;(3)用脂质体法转染Nurr 1基因到大鼠BMSCs-D-NSCs后用GDNF进行培养和诱导分化.结果:(1)AAV-pcDNA3.1-Nurr 1载体携带预期的Nurr 1遗传信息;(2)Nurr 1基因成功转染到BMSCs-D-NSCs中并且持续表达;(3)Nurr 1-BMSCs-D-NSCs以GDNF培养后表达TH因子. 结论:GDNF能促进经过转染Nurr 1基因的大鼠BMSCs-D-NSCs向多巴胺能神经元定向分化.     

GDNF基因修饰的骨髓间充质干细胞对脑出血大鼠脑源性神经营养因子及其受体的影响

目的:观察GDNF基因修饰的骨髓间充质干细胞(BMSCs)对脑出血大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)及其受体的影响。方法:通过脑立体定位仪向SD大鼠脑尾壳核注射胶原酶和肝素建立脑出血动物模型,并随机分为BMSCs组、GDNF/BMSCs组和生理盐水组共3组,并于建模后第3d在脑出血部位分别移植BMSCs、GDNF/BMSCs以及生理盐水;各组又根据细胞移植后再喂养时间的不同(1周、2周)分为2个亚组,每亚组8只大鼠。采用RT-PCR法观察BDNF和受体TrkB mRNA的表达;免疫组织化学染色观察BDNF蛋白的表达。结果:与生理盐水组和BMSCs组相比,BDNF及受体TrkB mRNA的表达上调。在1周和2周时间点,GDNF/BMSCs组与BMSCs组和生理盐水组相比BDNF阳性细胞数明显增加。结论:GDNF基因修饰的BMSCs移植治疗脑出血大鼠能增强BDNF及其受体的表达,有利于大鼠神经功能恢复。     

神经生长因子对大鼠骨髓基质细胞增殖和向成骨分化的影响

目的:观察神经生长因子(NGF)对大鼠骨髓基质细胞(BMSC)增殖和向成骨分化的影响。方法:体外培养大鼠BMSC,流式细胞术鉴定表面标志物;加成骨培养液培养至第3代,分为对照组(不加NGF)和实验组(加入100 ng/ml NGF),测定第1、3、5天第3代BMSC细胞增殖活性(MTT法)和碱性磷酸酶(ALP)活性,应用Von Kossa染色比较2组成骨性能。结果:CD90、CD105为强阳性表达,CD34、CD45为阴性。MTT法测得实验组第1、5天细胞的平均吸光度与对照组差异均无统计学意义(P>0.05),而第3天实验组高于对照组(P<0.05),实验组ALP表达明显高于对照组(P<0.01);Von Kossa染色形成钙化结节也较对照组数量增多,面积增大。结论:NGF无明显促进大鼠BMSC增殖的作用,但可促进其向成骨细胞分化。     

大鼠骨髓基质干细胞向神经元样细胞的分化

目的:体外定向诱导大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）向神经元样细胞的分化。方法： 用DMEM培养液冲洗骨髓,收集骨髓细胞接种在培养瓶中体外扩增、纯化。用诱导剂诱导BMSCs分化为神经元样细胞。用免疫组化ABC法鉴定神经丝蛋白（NF-200）、微管相关蛋白（MAP-2）、神经元特异核蛋白（NeuN）、巢蛋白(Nestin) 、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、GAD和ChAT的表达。结果： BMSCs经诱导后,胞体增大,并伸出细长突起,与神经元形态相似。免疫组化显示大部分细胞NF-200,MAP-2,NeuN和Nestin表达阳性,(3±0.8)%的细胞GAD表达阳性,(5±0.3)%的细胞ChAT表达阳性,而GFAP 表达阴性。结论： BMSCs可被诱导分化为神经元样细胞,部分细胞可表达GAD与ChAT。     

相互间非接触性共培养对神经干细胞和骨髓基质细胞的影响

目的 观察在神经干细胞培养液下非接触性共培养对骨髓基质细胞和神经干细胞的影响.方法 采用Transwell构建共培养体系非接触性共培养方式培养细胞,进行形态学和免疫化学染色方法观察.结果 共培养组:神经干细胞贴壁、伸出长突起,随培养时间延长,彼此交织成网;免疫组化显示细胞分化为神经元、胶质细胞、少突胶质细胞.骨髓基质细胞则大部分悬浮生长形成大的球状,此球状细胞分化的细胞表达神经元、胶质细胞、少突胶质细胞标志性蛋白.对照组:神经干细胞组细胞仍呈悬浮球状生长;骨髓基质细胞组细胞则部分悬浮生长形成小的球状,部分贴壁生长.结论 在神经干细胞培养液下非接触性共培养,骨髓基质细胞和神经干细胞能相互促进向神经细胞的分化,表明骨髓基质细胞和神经干细胞均可能分泌一些营养因子,为彼此提供一种生存分化的微环境.     

骨髓基质干细胞移植对大鼠脊髓损伤区NGF与BDNF表达的影响

目的研究骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）移植对大鼠脊髓损伤（SCI）后神经生长因子（NGF）与脑源性神经营养因子（BDNF）表达的影响。方法大鼠SCI后10minBMSCs移植入损伤区,应用west-ern blot观察BMSCs移植后,大鼠脊髓损伤区NGF和BDNF蛋白表达的变化。结果各时间点上NGF、BDNF蛋白在BMSCs移植组较对照组表达明显增强。NGF表达水平在3d达高峰后开始下降,BDNF3d达高峰后到14d仍然维持在较高水平。结论脊髓损伤后BMSCs移植可上调脊髓损伤区NGF、BDNF的表达,是修复脊髓损伤的机制之一。     

GDNF基因修饰对骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的影响

目的:探讨胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)基因修饰的骨髓间充质干细胞在体外诱导分化为神经元样细胞的潜能。方法:密度梯度离心和贴壁培养相结合分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)并鉴定,分别用GDNF基因重组腺病毒(pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-GDNF)和空质粒腺病毒(pAdEasy-1-pAdTrack-CMV)感染BMSCs建立BMSCs/GDNF和BMSCs/GFP两种细胞。两种细胞用DMSO/β-ME/ATRA进行诱导分化,观察细胞形态变化,采用Hoechst染色和免疫荧光细胞化学染色检测细胞凋亡和分化情况。结果:与BMSCs/GFP组相比,BMSCs/GDNF组的BMSCs经诱导后细胞凋亡率降低,NF-200阳性细胞率上升,但GFAP阳性细胞率无明显变化。结论:GDNF基因修饰有利于BMSCs抗细胞凋亡和分化为神经元样细胞,这为进一步研究GDNF基因修饰的BMSCs应用于中枢神经系统疾病的治疗奠定了基础。     

不同浓度GDNF诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化研究

目的观察不同浓度胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对神经干细胞(NSCs)向多巴胺(DA)能神经元分化的影响。方法取新生鼠脑组织体外分离培养NSCs,第2代NSCs诱导培养基中分别加入0、5、10、20 ng/mL GDNF进行诱导。用逆转录-聚合酶链反应检测诱导后细胞酪氨酸羟化酶(TH)mRNA的表达,免疫细胞化学染色鉴定NSCs,检测NSCs向DA能神经元分化率。结果各诱导组均表达TH mRNA。神经球具有自我更新和表达巢蛋白的能力,诱导分化后的细胞能表达神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞特异性抗原。与空白对照组比较,GDNF诱导组TH阳性细胞率均明显升高(P<0.05);且10、20ng/mL GDNF诱导组升高幅度明显高于5 ng/mL GDNF诱导组(P<0.05),10、20 ng/mL GDNF诱导组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论从新生鼠脑组织分离出NSCs。不同浓度的GDNF均能促进NSCs向DA能神经元分化,GDNF浓度从10ng/mL提高到20 ng/mL时TH阳性细胞率无明显变化。     

诱导兔骨髓基质细胞向神经干细胞分化的初步实验研究

目的：观察兔骨髓基质细胞体外培养的生长行为及增殖、分化情况，探讨由骨髓分离培养神经干细胞的可行性和有效性。方法：无菌条件下行骨穿术，密度梯度离心分离获取骨髓基质细胞，利用多种增殖、分化诱导因子和神经干细胞培养液进行培养、分化诱导，用免疫细胞化学方法进行鉴定。结朵：骨髓基质细胞在体外培养中能形成NESTIN抗原阳性的细胞克隆团，进一步分化，部分细胞胞体增大并出芽，逐渐发育成为较成熟的长突起细胞，长突起相互连接、交织成网并建立纤维联系。结论：骨髓基质细胞具有较强的自我更新能力和多向分化潜能，易于取材、体外培养和增殖，在一定诱导条件下可以生成神经干细胞。     

脑源性神经营养因子基因转导对骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的影响

动物实验表明骨髓问充质干细胞(MSC)移植到脑组织中可长期存活，并可向包括神经元在内的神经细胞分化。但MSC移植也面临一个问题：移植细胞多分化为胶质细胞，分化为神经元的数量较少。本研究旨在观察外源基因转入MSC后，持续稳定高表达的脑源性神经营养因子(BDNF)对MSC向神经细胞分化的作用。     

大鼠骨髓基质细胞体外诱导分化的研究

目的:探索骨髓基质细胞体外定向诱导分化为神经细胞的可能性。方法:取大鼠的骨髓基质细胞在体外培养,用免疫组化方法检测正常脊髓提取液和脑源性神经生长因子诱导分化,观察诱导后细胞的形态。结果:骨髓基质细胞在体外培养呈梭形。诱导后细胞呈神经元样细胞改变。神经元烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白染色阳性。结论:骨髓基质细胞可在体外诱导分化。     

脑源性神经营养因子体外诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的 探讨脑源性神经营养因子(BDNF)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化成神经元样细胞的作用及其对诱导后的神经元样细胞保护作用,为治疗神经系统疾病提供更优良的细胞。方法 体外培养MSCs至第5代后,分别用BDNF、β-巯基乙醇(β-ME)诱导MSCs,诱导后的第1、3和6小时计算两组神经元样细胞数,对各时间点两组神经元样细胞阳性率进行了比较;诱导后行神经细胞标记抗体的免疫细胞化学、RT-PCR及蛋白质印迹鉴定。结果 两组诱导剂诱导后的细胞均呈神经元样细胞的形态;BDNF组诱导分化后细胞的存活时间远较β-ME组长;BDNF组在诱导后6h近于诱导高峰,而β-ME在诱导2h即达高峰,但随后神经元样细胞渐死亡。免疫细胞化学结果显示在两组诱导后细胞的巢蛋白(Nestin)、神经细胞特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白-2(MAP-2)、神经丝蛋白(NF)表达均呈阳性,而胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达呈阴性;RT-PCR显示NSE、NFL,MAP-2的mRNA表达阳性,GFAP有较弱的表达;蛋白质印迹可见两组诱导剂诱导的细胞均表达神经元的特异性标记抗体NSE。结论 BDNF能单独诱导MSCs分化形成神经元样细胞,而且分化后细胞的存活时间长,有望用于治疗脑缺血、神经变性等疾病。     

Effect of glial cell line-derived neurotrophic factor on peripheral nerve regeneration in adult rat

Objective: To study the effect of glial cell line-derived neurotrophic (GDNF) on adult peripheral nerve regeneration. Methods: Transectioned sciatic nerve in adult rats was sutured into silicone channel. GDNF or SAL solution was injected into the silicone channels during operation. Four weeks later, the effect of GDNF on axonal regeneration was evaluated by degenerative neurofiber staining and HRP retrograde tracing. Results: Compared with SAL group, the percentage of degenerative neurofiber areas decreased from 17.3% to 1.9% ( P＜0.01 ) and the ratio of labeled spinal somas number was significantly increased from 43.5% to 68.3% ( P＜0.01 ) in GDNF group. Conclusion: The results suggest that exogenous GDNF can obviously enhance adult peripheral nerve regeneration.     

骨髓基质细胞的体外培养和分化诱导

目的 :建立一种简单可靠的骨髓基质细胞 (BMSc)向成骨细胞转化的体外培养方法 ,探讨骨髓基质细胞向成骨细胞转化的机理。 方法:将兔 BMSc悬液进行体外培养 ,进行形态学观察和组织学检测。 结果:传代培养细胞的碱性磷酸酶 (AL P)阳性率达 80 %以上 ,表现为成骨细胞形态并形成钙结节。结论:地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素 C可促进 BMSc分化为成骨细胞 ,BMSc的分化和增殖是两个对立的状态。     

神经营养因子相关基因在骨髓基质细胞分化为神经元中的表达

目的:体外诱导骨髓基质细胞分化为神经细胞,并观察诱导分化前后神经营养因子及其受体相关基因的表达变化.以探索骨髓基质细胞诱导分化为神经细胞的可能机制.方法:体外培养经 Percoll(1.073 g/L)分离获得的大鼠骨髓基质细胞并传代扩增,用二甲亚砜(DMSO),丁羟回醚(BHA)诱导分化,采用倒置相差显微镜观察细胞形态学变化,分化后细胞用神经丝蛋白(NF)抗体,胶质源性纤维酸性蛋白(GFAP)抗体作细胞免疫荧光检测.采用半定量RT-PCR检测分化前和分化后2 h,6 h.12 h,24 h和48 h神经生长因子(NGF),脑源性神经因子(BDNF),神经营养因子-3(NT-3)及其相应受体TrkA,TrkB,TrkC和神经营养因子低亲和力受体p75NTR的表达变化.结果:①骨髓基质细胞体外诱导分化后2 h即出现形态学变化.表现为细胞胞体呈球形,突起增多,形态类似神经元.细胞免疫荧光检测显示神经丝蛋白(NF)抗体标记的神经元细胞阳性,GFAP阴性.②在骨髓基质细胞分化前后都有NGF和BDNF持续表达,但分化后NGF表达降低,TrkA,TrkB在分化前细胞中不表达.在诱导分化开始后12 h可以检测到他们的表达,而NT-3,TrkC 在分化前后都不表达.③p75NTR在诱导分化后6 h开始出现表达,12 h后显著降低并很快消失.结论:骨髓基质细胞在体外可以定向诱导为神经细胞,诱导分化前后神经营养因子(NT)及其 Trk 受体和p75受体的表达发生了显著变化,NT与Trk受体及p75受体作用的信号途径可能在骨髓基质细胞分化为神经细胞过程中起重要作用.     

大鼠骨髓基质细胞体外增殖分化的实验方法研究

目的:研究大鼠骨髓基质细胞(MSC)在体外增殖分化为神经元样细胞的条件,为MSC的移植提供实验参考。方法:用DMEM冲洗SD大鼠四肢骨的骨髓腔,通过密度梯度离心获得有核细胞后接种于DMEM/10%胎牛血清培养液中,观察在培养液中加入神经生长因子后对MSC的增殖、分化及存活的影响,并以β-巯基乙醇(β-ME)作对照观察MSC分化及分化后的存活情况。结果:在DMEM/10%胎牛血清培养液中加入神经生长因子后MSC增殖速度加快,培养7~9 d后有神经元样细胞形成,表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)为(52±9.2)%,神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)为(15±7)%,细胞分化后继续培养仍可存活7 d以上。而用β-ME诱导MSC,6 h后表达NSE为(71.0±8.8)%,GFAP阴性,分化细胞24 h后逐渐死亡。结论:MSC在DMEM/10%胎牛血清培养液中加入神经生长因子后增殖速度加快,可以分化为神经元样细胞,分化细胞存活时间延长。     

初级纤毛介导的Shh信号对大鼠骨髓基质细胞神经元样细胞分化的影响

目的 探讨初级纤毛介导的Sonic hedgehog(Shh)信号对大鼠骨髓基质细胞(MSCs)神经元样细胞分化的影响。方法 全骨髓贴壁法分离培养大鼠MSCs。实验分为白藜芦醇正常培养组、白藜芦醇诱导组、Smoothened (Smo)激动剂SAG组、Smo抑制剂环巴明组,分别给予相应的药物处理。倒置显微镜下观察各组细胞形态; 免疫荧光法检测各组细胞初级纤毛及Shh信号通路相关蛋白\[Ac-Tu、Patched (Ptc)、Smo、Gli1\]的表达; RT-PCR检测各组细胞Smo、Gli1 mRNA的表达;蛋白质印迹法检测各组细胞Smo和Gli1蛋白的表达。结果 正常培养的大鼠MSCs不表达初级纤毛。经过预诱导或饥饿处理24 h后,MSCs表达初级纤毛及Ptc、Smo和Gli1蛋白,其中Smo和Gli1蛋白位于胞质,Ptc蛋白位于初级纤毛。正常培养时,白藜芦醇不能促使Smo移位及MSCs向神经元样细胞分化。当MSCs表达初级纤毛时,白藜芦醇及SAG可使Smo从胞质进入初级纤毛,同时伴随MSCs向神经元样细胞分化及 Smo、Gli1 mRNA和蛋白表达水平的增加(P<0.05); 加入抑制剂环巴明后,Smo仍主要表达于胞质,Smo、Gli1 mRNA和蛋白的表达水平降低(P<0.05),MSCs向神经元样细胞的分化受抑制。结论 MSCs表达初级纤毛并存在Shh信号,初级纤毛介导的Shh信号参与调控大鼠MSCs的神经元样细胞分化。     

骨髓基质细胞治疗大鼠缺血性脑梗死对神经生长因子的影响

目的探索骨髓基质细胞(BMSCs)移植治疗缺血性脑梗死的效果及机制,为临床治疗提供理论依据。方法从幼年(14d)大鼠的股骨和胫骨取原代BMSCs后扩增。改良的Longa栓线法制作大鼠大脑中动脉缺血模型(n=45),1h后再灌注,24h后治疗组(n=15)尾静脉注射3×106BMSCs,盐水对照组(n=15)尾静脉注射1mL生理盐水,空白对照组(n=15)不注射。缺血后3、7及14d采用神经损伤评分(NSS)检测大鼠神经系统功能,免疫组化方法检测BMSCs和神经生长因子(NGF)。结果治疗组的NSS在第7、14天与两个对照组有明显变化(P<0.05),而第3天和第7天无明显变化(P>0.05);治疗组NGF在不同时间点较两个对照组明显高(P<0.05)。结论静脉移植BMSCs治疗缺血性脑梗死是一种简单有效的方法。移植BMSCs后缺血脑组织中NGF的增加对神经功能的恢复起到了重要作用。