诊断超声提高脂质体介导血管内皮生长因子基因转染的体外实验

目的 研究超声破坏微泡造影剂的方法提高脂质体介导的血管内皮生长因子(VEGF)基因在内皮细胞中转染率的可行性。方法 脂质体介导VEGF基因转染1h后，将6孔板中的内皮细胞每孔加入造影剂10μl或100μl或500μl，然后置于水槽中，暴露在超声下30s、60s、90s。2d后，用荧光显微镜观察标记基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达。结果 超声照射细胞30s和60s，EGFP基因表达显著提高，照射90s时杀死了大多数细胞。每孔加入微泡造影剂100μl时，其在超声作用下产生的空化作用提高了基因转染效率，造影剂为500μl时，细胞死亡率较高。结论 超声破坏微泡造影剂可以提高脂质体介导的基因细胞转染效率，为今后治疗基因的体内转染提供了经验。     

超声微泡造影剂联合survivin反义寡核苷酸对CHG-5细胞的阻断作用

目的探讨超声微泡造影剂联合survivin反义寡核苷酸对人胶质瘤细胞系CHG-5的阻断作用。 方法针对survivin基因序列设计合成survivin反义寡核苷酸,将实验分为4组。A组：survivin反义寡核苷酸（ASOND）并超声微泡造影剂联合超声照射;B组：survivin反义寡核苷酸（ASOND）并脂质体转染联合超声照射;C组：survivin反义寡核苷酸（ASOND）并脂质体转染;D组：空白对照组。利用免疫细胞化学及Western blotting检测survivin蛋白的表达变化,MTT法检测细胞增殖的变化。 结果采用超声微泡造影剂联合超声照射介导的survivin反义寡核苷酸基因组,CHG-5细胞中survivin蛋白表达无论是免疫组化检测结果还是Western blotting检测结果都较其他组明显降低（P〈0.05）,CHG-5细胞生长率也明显受到抑制（P〈0.05）。 结论超声微泡造影剂介导的survivin反义寡核苷酸转染是一种无创、新型、高效的基因转染方法。     

超声空化微气泡造影剂对人乳腺癌细胞影响的实验研究

目的观察不同浓度脂质体微气泡造影剂在超声照射下对体外培养的人乳腺癌细胞的影响。 方法12孔板培养人乳腺癌细胞并分为：（1）对照组；（2）单纯超声照射组；（3）单纯造影剂组；（4）造影剂＋超声照射组。不同造影剂浓度下，声波发射强度一3dB，照射时间60s。给予实验刺激后，原子力显微镜动态观察细胞膜形态的改变，PI染色后观察细胞的活性。 结果单纯超声照射组及造影剂组细胞膜形态与对照组比较无明显改变。造影剂＋超声照射组细胞膜出现大小不等的微孔，提高造影剂浓度，孔径增大，但细胞活性显著下降。 结论微气泡造影剂显著增强超声的空化效应，提高细胞的通透性，对细胞形态及细胞活性的影响与造影剂浓度有关。     

超声联合SonoVue微泡介导NET-1siRNA转染人肝癌细胞

目的探讨超声联合微泡造影剂介导NET-1siRNA在人肝癌细胞中的转染效果。方法将培养的HepG2细胞分为5组:A组为空白对照;B组培养瓶中仅加入NET-1siRNA;C组为加入脂质体及NET-1siRNA;D组为加入造影剂及NET-1siRNA并给予超声辐照;E组为加入脂质体、造影剂、NET-1siRNA,并给予超声辐照。之后以荧光显微镜检测NET-1siRNA转染率,RT-PCR法检测各组细胞NET-1 mRNA的基因表达,Western-Blotting法检测各组细胞NET-1表达情况,MTT检测HepG2细胞生长情况。结果与C组、D组相比,E组NET-1siRNA转染率明显提高(P<0.05);D组和E组细胞内NET-1mRNA及NET-1蛋白的表达抑制率均高于其他各组(P均<0.01),而转染后24～72hHepG2细胞增殖受到明显抑制。结论超声联合微泡造影剂能有效促进NET-1siRNA在肝癌细胞中的表达,并抑制肝癌细胞的增殖。     

脉冲超声辐照微泡增强脂质体介导基因转染的体外实验研究

目的 探讨脉冲超声辐照微泡超声造影剂提高脂质体介导增强型绿色荧光蛋白质粒在肝癌,细胞(HepG2)中转染率的可行性.方法 将HepG2接种在24孔板中,随机分为以下6组:①空白对照组;②质粒+脂质体组;③超声+质粒组;④超声+质粒+微泡组;⑤超声+质粒+脂质体组;⑥超声+质粒+脂质体+微泡组.荧光显微镜及流式细胞仪检测增强型绿色荧光蛋白表达及转染效率;MTT法检测此转染方法对HepG2生长活性的影响.结果 超声+质粒+脂质体组的转染效率最高,并对细胞活性无明显影响;而超声+质粒+脂质体+微泡组转染效率与超声+质粒+脂质体组比较差异无统计学意义(P＞0.05),但细胞活性与空白组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 脉冲超声辐照可介导基因转染,并能提高脂质体基因转染效率.同时,在一定条件下,超声微泡造影剂可提高超声介导基因转染效率,此方法可为基因转染提供新的思路.     

超声辐照微泡声学造影剂增强脂质体介导肝细胞基因转染的体外实验研究

目的研究超声破坏微泡声学造影剂提高脂质体介导肝细胞生长因子质粒（plRES—EGFP—HGF）在肝细胞中转染率的可行性。 方法将培养的肝细胞分为4组：（1）单纯对照组，（2）脂质体转染组，（3）超声辐照脂质体转染组，（4）超声辐照微泡＋脂质体转染组。第（4）组按照每孔加入造影剂剂量又分为1）10μl组，2）20μl组，3）30μl组，4）40μl组4亚组。超声辐照微泡＋脂质体转染组在脂质体介导肝细胞生长因子转染肝细胞1h后，在24孔板中每孔加入微泡声学造影剂10，20，30或40μl，超声辐照60s。24h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况、MTT法检测肝细胞增殖率和流式细胞仪检测基因转染率。 结果超声频率1MHz，功率0．5W／cm。辐照60S，每孔加入造影剂30μl时肝细胞基因转染效率最高，与脂质体转染组比较有显著性。 结论在一定条件下，超声辐照微泡声学造影剂可明显提高脂质体介导肝细胞基因转染效率，为基因治疗提供了新的思路。     

超声波与微泡声学造影剂增强体外培养肿瘤细胞基因转染实验研究

目的观察超声波与微泡声学造影剂能否增强体外培养肿瘤细胞基因转染及其转染效率,初步摸索适宜的超声辐照条件.方法将培养的HepG2细胞分为3组,第1组为单纯造影剂转染组:加入5 μg绿色荧光蛋白质粒(PEGFP-C1)与微泡声学造影剂混合液进行转染;第2组为脂质体转染组:用相同浓度PEGFP-C1质粒进行常规脂质体转染;第3组为造影剂加超声辐照转染组:加入5 μg PEGFP-C1质粒与微泡声学造影剂混合液,然后分别用0.25 W/cm2、0.5 W/cm2、1.0 W/cm2超声波经培养板底部辐照10 s.24 h后用荧光显微镜观察各转染组细胞荧光蛋白表达情况,计录每高倍视野(400×)荧光蛋白表达阳性细胞数.结果单纯造影剂转染组未见荧光蛋白表达阳性细胞,造影剂加超声辐照转染组可见不同程度荧光蛋白表达,其中以0.5 W/cm2超声辐照组表达最强,每高倍视野绿色荧光蛋白表达阳性细胞数为(20.7±3.2)个/HP,高于0.25 W/cm2与1.0 W/cm2超声辐照组[分别为(4.8±1.9)个/HP;(9.9±2.3)个/HP],与脂质体转染组[(22.1±3.5)个/HP]比较无显著差异(P>0.05).结论微泡声学造影剂加一定强度的超声辐照能显著增强体外培养肿瘤细胞的基因转染与表达,超声辐照条件是影响转染率的重要因素,适宜条件时其转染效率与常规脂质体转染方法无显著差异.     

不同转染方法对荧光蛋白质粒转染人胚肾293T细胞影响的实验研究

目的:探讨荧光蛋白质粒转染人胚肾293T细胞的最佳转染方法.方法:以脂质体转染法、超声辐照法、微泡造影剂SonoVue联合超声辐照及脂质体中加入微泡造影剂SonoVue并予以超声辐照4种转染方法,将含有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-N1转染人胚肾293T细胞,48 h后以荧光显微镜观察293T细胞中的绿色荧光蛋白表达情况并用流式细胞仪测算转染率.结果:脂质体 SonoVue 超声辐照法的转染效果最好(23.10±2.11%).脂质体 SonoVue 超声辐照法的转染率分别与脂质体转染法、超声辐照法、微泡造影剂SonoVue联合超声辐照法的转染率比较均有显著差异(P<0.01).结论:脂质体中加入微泡造影剂SonoVue并予以超声辐照能显著提高荧光蛋白质粒在人胚肾293T细胞中的转染效果.     

超声辐照SonoVue增强脂质体介导pEGFP-N1转染乳腺癌细胞

目的 探讨超声辐照SonoVue介导增强型绿色荧光蛋白报告基因质粒(pEGFP-N1)转染乳腺癌MCF-7细胞的最优条件以及超声联合微泡造影剂增强脂质体转染的效果.方法 体外培养人乳腺癌MCF-7细胞,按照不同的辐照条件分组:不处理组,超声辐照十质粒组,微泡浓效组,超声声张组,辐照时间组及工作周期组.分别进行超声辐照,辐照后以MTT法测细胞存活度,流式细胞仪测pEGFP-N1瞬时转染率,取得最佳的辐照条件.重新准备细胞后先以脂质体转染细胞,2 h后加入超声微泡并以最佳条件辐照,用同样的方法测细胞存活率及转染率.结果 20%的造影剂浓度、1.5 W/cm2的声强、90 s的辐照时间、20%的工作周期(占空比)为超声辐照SonoVue介导pEGFP-N1转染MCF-7细胞的最优条件,转染率为(14.21±2.55)%,细胞存活率为(84.60±2.85)%.在增强脂质体转染的实验中,超声微泡脂质体组的转染率最高(22.15±2.69)%,与其他各组相比差异有统计学意义(P<0.05),此时细胞存活率为(80.13±3.61)%.结论 20%的造影剂浓度、1.5 W/cm2的声强、90 s的辐照时间、20%的工作周期是MCF-7细胞的最佳转染条件,超声联合微泡能够增强脂质体转染的效果.     

超声介导微泡破裂法对VEGF体外转染成纤维细胞蛋白表达影响的实验研究

目的利用ELISA检测法观察诊断剂量的超声介导微泡破裂法对VEGF体外转染成纤维细胞蛋白表达的影响并探讨该种转染方法的最佳超声条件。方法实验分组:单纯VEGF质粒转染组;超声 造影剂微泡 VEGF质粒转染组,该组并根据MI(机械指数)分为三组1.2;1.4;1.6。转染后利用ELISA法对各组成纤维细胞的VEGF蛋白表达进行定量检测;利用锥虫蓝染色法比较不同超声强度对细胞活性的影响。结果VEGF质粒转染成纤维细胞后,24h开始即有较高水平的VEGF蛋白表达,表达量于48 h7、2 h呈下降趋势;超声 造影剂微泡 VEGF质粒组(MI1.4、1.6)细胞VEGF蛋白表达量最高,但2组间差异无显著性(P>0.05);以上2组与单纯质粒转染组及MI为1.2组比较有显著性差异(P<0.01);超声 造影剂(MI1.2)组与单纯质粒转染组亦有显著性差异(P<0.05)。锥虫蓝染色法显示:随着超声强度的增加,细胞死亡率呈上升趋势。结论诊断剂量的超声介导微泡破裂转染法能够提高VEGF体外转染成纤维细胞蛋白的表达;使用的超声剂量大,转染率高,但细胞损害大;反之,细胞损伤小,转染率低。     

低频超声联合微泡造影剂增强脂质体介导pEGFP-N1基因转染体外前列腺癌细胞

目的探讨低频超声联合微泡造影剂增强脂质体介导增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-N1)转染前列腺癌细胞的可行性,并对超声微泡浓度参数进行优化。方法将前列腺癌PC-3细胞悬液分为空白对照组、超声组、微泡组、微泡+超声组、脂质体组、脂质体+微泡组、脂质体+超声组、脂质体+微泡+超声组,其中脂质体+微泡+超声组根据微泡体积浓度不同分为(0、10%、20%、30%、40%和50%)6个亚组。经超声辐照,24h后用荧光显微镜观察细胞中基因表达情况,并用流式细胞仪检测转染率。结果脂质体+微泡+超声组基因转染效率最高,与其他组比较差异均有统计学意义(P均<0.05);在脂质体+微泡+超声亚组中,微泡浓度为20%亚组基因转染率最高。结论低频超声联合微泡能有效增强脂质体介导pEGFP-N1基因在体外前列腺癌细胞中的转染率,20%是体外基因转染前列腺癌细胞的最佳微泡浓度。     

超声辐照联合微泡造影剂介导人血管生成素-1基因体外转染293T细胞的研究

目的 探讨超声辐照联合微泡造影剂的基因转染系统介导人血管生成素-1(hAng-1)基因转染人胚肾293T细胞的转染效率.方法 将六孔板中的293T细胞悬液分为4组:A组,超声+质粒组,每孔加入10 μg目的 基因质粒;B组,超声+微泡+质粒组,每孔加入微泡和质粒混合液,终浓度分别为质粒10 μg/孔,微泡200 μl/孔;C组,脂质体+质粒组,每孔加入4 μl脂质体和5 μg质粒;D组,对照组,每孔仅加入10 μg目的 基因质粒.A组和B组均接受超声辐照,照射条件为连续波,声强1.5 W/cm2,作用时间为30 s.转染后48 h用荧光显微镜和流式细胞仪分别定性、定量观察基因的转染效率.结果 48 h后,荧光显微镜下观察到转染成功的细胞胞浆内发出绿色荧光,流式细胞仪检测A组、B组、C组、D组的基因转染效率分别为(3.5±0.4)%、(20.8±1.2)%、(18.0±0.9)%和(0.2±0.1)%.结论 超声本身即有促进基因转染的作用,超声辐照联合微泡造影剂后则增强了这种作用,明显增加了基因的转染效率.     

超声微泡介导自杀基因对卵巢癌细胞的抗瘤效应

目的探讨超声微泡介导自杀基因对卵巢癌SKOV3细胞抗瘤效应的机制。方法采用最适超声转染参数,以超声介导微泡转染pORF-HSV1TK质粒,将SKOV3细胞分成6组:阴性对照组(C组)、超声辐照组(U组)、脂质体组(L组,阳性对照组)、脂质体+超声辐照组(L+U组)、脂质体+微泡+超声辐照组(L+M+U组)和微泡+超声辐照组(M+U组)。以RT-PCR检测HSV1TK的表达,以MTT测定各组细胞增殖抑制率。光镜下观察各组转染细胞数量、形态变化,以流式细胞术(FCM)检测各组细胞凋亡率及细胞周期。结果L+M+U组HSV1TK基因表达最强,细胞增殖抑制率明显高于其他组(P均<0.05),且光镜下细胞数量减少最多,形态明显异常;其细胞凋亡率为(49.13±0.82)%,且大多数细胞周期被阻断于G1期(P<0.05)。结论超声介导微泡能增强HSV1TK/GCV系统抑制SKOV3增殖和诱导SKOV3凋亡的作用,且将SKOV3细胞周期阻断在G1期,从而发挥抗瘤效应。     

超声微气泡介导cy5ODN转染大鼠肾的研究

目的：探讨超声联合脂质体微气泡介导寡核苷酸cy5ODN靶向转染肾的有效性和安全性。方法：健康雄性Wistar大鼠30只，分为对照组、单纯cy5ODN组、造影剂＋cy5ODN组、超声＋cy5ODN组和超声＋造影剂＋cy5ODN组。予以实验刺激后，7d取肾组织检测荧光表达，光镜下观察肾组织病理改变，以评价该方法的副作用。结果：超声＋造影剂＋cy5ODN组cy5ODN基因转染率显著高于其余各组，实验各组均未见到明显肾小球损害。结论：超声联合类脂质体微泡能显著增强基因在肾组织的转染效率，可望为肾疾病的基因治疗提供一种新的安全、有效的转导方法。     

超声辐照微泡介导脂质体小干扰RNA转染视网膜色素上皮细胞

目的 探讨超声靶向破坏超声微泡介导脂质体小干扰RNA(siRNA)转染视网膜色素上皮(RPE)细胞的价值. 方法将人及大鼠RPE细胞隔孔接种于24孔板中(2×10~5/孔、1×10~5/孔),分5组处理:siRNA+超声(US)、siRNA+微泡(MBs)+US、siRNA+脂质体(L)、siRNA+L+US、siRNA+L+MBs+US.12小时后,荧光显微镜观察并应用流式细胞仪测定阳性细胞比例. 结果在无脂质体的条件下,超声或超声联合微泡不能促进siRNA转染人及大鼠RPE细胞.siRNA+L+US组siRNA转染人RPE细胞效率最高.siRNA+L+US+MB组siRNA转染人及大鼠RPE细胞的效率显著低于siRNA+L+US组. 结论超声辐照可促进脂质体介导的siRNA转染人RPE细胞.     

超声介导SonoVue微泡破裂对hAng-1基因完整性和表达效率的影响

目的 探讨超声联合SonoVue微泡介导hAng-1基因转染293T细胞的转染效率及基因完整性和表达状况.方法 构建eGFP-C3-hAn-1质粒,根据不同实验组的设计,应用相应的微泡联合超声辐照条件进行293T细胞的eGFP-C3-hAng-1基因转染,转染后48 h,以荧光显微镜观察到绿色荧光为转染成功标志;流式细胞术检测基因转染阳性细胞率,台盼蓝染色检测细胞生存率;RT-PCR和Western blot技术检测hAng-1基因的mRNA和蛋白表达;琼脂糖凝胶电泳检测经超声辐射后质粒的完整性.结果 ①微泡浓度为20%,DNA浓度为15 mg/L时进行基因转染可获较好转染效率和细胞生存率;②转染体系中血清的存在并不影响转染效率和细胞生存率;③最适转染条件下的超声辐照剂量不会影响DNA的完整性,且转染后的基因可正常表达mRNA并翻译目的蛋白.结论 微泡联合超声辐照能够介导体外细胞治疗性基因的转染,血清的存在并不影响基因的转染,转染后的基因能顺利地表达并具有正常功能.     

亚微米级超声微泡造影剂的制备及体外基因转染效率的实验研究

目的 探索制备亚微米级超声微泡造影剂的方法 ,以GFP作为目的 基因验证其作为一种新型基因载体的可行性.方法 以高剪切分散法制备超声微泡造影剂,透射电镜及激光粒度分析仪检测其形态及粒径;将超声微泡造影剂与不同剂量的绿色荧光蛋白质粒PShuttle-IRES-hrGFP-1结合后转染HepG2细胞,利用荧光显微镜观察并检测其基因转染效率.结果 自制超声微泡造影剂为均匀分散的圆泡,粒径分布在282.2～415.7 nm之间,平均值为(335±5)nm,达到亚微米级;该微泡能将GFP基因成功转运到HepG2细胞内并高效表达,转染效率达32.61%±3.42%.结论 自制亚微米级超声微泡造影剂粒径小、分散均匀,并能成功转运外源DNA进入细胞内,可作为一种新型基因载体.     

超声作用下CTGF-siRNA对大鼠肝纤维化基因治疗的实验研究

目的探讨利用超声微泡造影剂介导携带结缔组织生长因子-小干扰RNA(CTGF-siRNA)真核表达质粒转染大鼠肝细胞的有效性。方法 (1)构建CTGF-siRNA真核表达质粒;(2)将40只实验大鼠随机分为7组:正常组,实验对照组,CTGF-siRNA质粒组,超声联合微泡组,超声联合微泡介导基因低、中、高剂量组;(3)建立肝纤维化模型,基因治疗4周后处死大鼠,超声及病理切片HE染色评价肝纤维化程度,masson染色观察胶原纤维含量,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肝组织中CTGF、Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA表达。结果 (1)CTGF-siRNA基因治疗后超声及病理切片显示干预组纤维化程度降低;(2)masson染色显示超声介导微泡基因组胶原纤维含量表达量随着剂量增高而降低(P<0.05);(3)RT-PCR显示超声介导微泡基因组CTGF、Ⅰ型和Ⅲ型胶原的mRNA表达明显低于其他组,且随着质粒剂量增大而减少(P<0.05)。结论超声微泡作用下CTGF-siRNA基因能特异地作用于靶位点,有效抑制肝纤维化进程,提高对肝纤维化干预的特异度。