靶向bcl-2基因的shRNA对肝星状细胞凋亡的影响

目的 研究短发夹RNA(shRNA)重组载体介导抑制大鼠肝星状细胞(HSCs)bcl-2基因的表达,观察其对HSCs凋亡的影响.方法 重组质粒载体pGPU6-GFP-shRNA由脂质体介导转染HSC-T6细胞株.荧光定量PCR和Western blotting鉴定bcl-2表达;CCK-8法观察质粒转染对HSCa生长和增殖的影响;Hoechst 33258染色观察细胞形态学改变;流式细胞术及caspase-3和caspase-9酶活性检测分析转染后细胞凋亡情况.结果 pGPU6-GFP-shRNA能抑制bcl-2 mRNA和蛋白表达;转染后HSC-T6体外生长明显受到抑制;转染后72 h时细胞凋亡率为33.34%,caspase-3和caspase-9酶活性显著增高.结论 shRNA重组载体pGPU6-GFP-shRNA能有效地抑制HSC-T6中bcl-2的表达,抑制细胞生长并促进凋亡.实验为进一步探索肝纤维化基因治疗提供了实验依据.     

靶向bcl-2基因转录shRNA重组质粒的构建和筛选

目的构建能高效抑制肝星状细胞(HSCs)bcl-2表达的小发夹RNA(shRNA)重组质粒。方法利用RNA干扰技术,设计有小发夹结构的3条DNA序列,经退火形成互补双链,克隆至转录载体psiRNA-hH1neo上构建重组质粒,予以酶切和测序鉴定。重组质粒转染HSC-T6细胞株,运用实时荧光定量PCR和Western blotting进行筛选鉴定。结果酶切及测序鉴定表明,成功构建重组质粒shRNA1、shRNA2和shRNA3。实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,shRNA1和shRNA2转染后显著抑制HSC-T6中bcl-2mRNA和蛋白表达(P<0.05),其中siRNA1的bcl-2表达抑制效率>80%。结论构建的重组质粒shRNA1能有效抑制HSCs中bcl-2的表达。实验为进一步探索肝纤维化基因治疗的新途径奠定了基础。     

靶向bcl-2基因转录shRNA重组质粒的构建和筛选

目的 构建能高效抑制肝星状细胞(HSCs)bcl-2表达的小发夹RNA(shRNA)重组质粒.方法 利用RNA干扰技术,设计有小发夹结构的3条DNA序列,经退火形成互补双链,克隆至转录载体psiRNA-hHlneo上构建重组质粒,予以酶切和测序鉴定.重组质粒转染HSC-T6细胞株,运用实时荧光定量PCR和Western blotting进行筛选鉴定.结果 酶切及测序鉴定表明,成功构建重组质粒shRNA1、shRNA2和shRNA3.实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,shRNA1和shRNA2转染后显著抑制HSC-T6中bcl-2 mRNA和蛋白表达(P＜0.05),其中siRNA1的bcl-2表达抑制效率＞80%.结论 构建的重组质粒shRNA1能有效抑制HSCs中bcl-2的表达.实验为进一步探索肝纤维化基因治疗的新途径奠定了基础.     

EZH2 shRNA真核表达载体的构建及其在卵巢癌A2780细胞系的稳定表达

目的 采用基因工程技术,构建EZH2 shRNA的真核表达载体,获得稳定表达干扰质粒的卵巢癌A2780细胞系.方法 合成特异性干扰EZH2的shRNA片段并定向克隆插入Supersilencing shRNA质粒表达载体pGPU6/GFP/Neo,获得表达载体pGPU6/GFP/Neo-shEZH2.脂质体介导重组质粒转染A2780细胞,经G418加压筛选获得稳定转染细胞株,Real time RT-PCR和Western blot检测转染后细胞系EZH2的表达.结果 测序结果证实重组载体构建成功,稳定转染shEZH2的A2780细胞EZH2的mRNA和蛋白水平下降(90.20±1.66)%和(73.80±5.49)%,P＜0.01,差异有统计学意义. 结论成功构建EZH2 shRNA表达载体,获得EZH2基因稳定沉默的A2780细胞系,为进一步研究以EZH2为靶点的卵巢癌治疗奠定实验基础.     

稳定转染靶向bcl-2的shRNA对胃癌SGC-7901细胞株增殖影响

目的 探讨稳定转染靶向bcl-2的小发夹RNA(shRNA)对胃癌细胞株SGC-7901的长效影响.方法 构建针对bcl-2的shRNA质粒表达载体,转入SGC-7901细胞,筛选稳定转染的细胞克隆继续压力培养.RT-PCR方法检测稳定转染后SGC-7901细胞bcl-2 mRNA的表达以及对细胞增殖和凋亡的影响.结果 稳定转染shRNA后,SGC-7901细胞的bcl-2 mRNA表达明显下降;细胞增殖能力及凋亡率无明显变化.结论 稳定转染shRNA能长效抑制SGC-7901细胞bcl-2 mRNA的表达,为后续基因治疗研究提供了实验依据.     

沉默GPC-3基因质粒构建及对HepG2细胞增殖的抑制作用

目的:构建磷脂酰肌醇蛋白多糖(glypican,GPC)-3 shRNA质粒,观察GPC-3活化干扰对肝癌(HepG2)细胞的抑制作用。方法:设计与合成多条针对GPC-3序列的shRNA,插入pGPU6/GFP/Neo载体,构建、转染HepG2细胞、筛选高效质粒,观察沉默GPC-3表达对肝癌细胞增殖的抑制作用与机制。结果:经BamHⅠ或PstⅠ酶切鉴定,证实插入pGPU6/GFP/Neo载体GPC-3 shRNA序列正确,成功构建GPC-3 shRNA干扰质粒。以脂质体介导,将GPC-3shRNA1～4分别转染HepG2细胞,shRNA1沉默GPC-3 mRNA最高效率达89.3%,可有效抑制HepG2细胞增殖,在72 h达71.1%;shRNA1干扰使HepG2细胞周期阻滞在G1期,促进癌细胞发生凋亡(65.6%)。结论:shRNA可有效干预肝癌细胞GPC-3基因转录,促进凋亡并抑制增殖,GPC-3可望成为肝癌基因治疗的靶目标。     

慢病毒载体介导的Nrf2表达下调对肝星状细胞生物学行为的影响

目的观察重组慢病毒载体介导Nrf2表达下调对肝星状细胞生物学行为的影响,同时探讨其可能的作用机制。方法利用重组DNA技术将特异性shRNA序列插入慢病毒表达载体pGLV3.GFP中,形成pGLV3.GFP.Nrf2.shRNA,将其转染至293T细胞中,随后进行病毒包装、滴度测定、转染率计算。采用实时荧光定量、Western blot测定转染肝星状细胞株(HSC-T6细胞)Nrt2 mRNA及蛋白的表达情况,利用Tunel染色法检测HSC-T6细胞的凋亡情况,同时对HSC-T6细胞中PI3K、Akt、p-Akt、p-Bad、Bcl-2、Bax蛋白水平进行测定。结果构建的重组病毒载体LV3-H1-GFP-shRNA可有效感染293T细胞。激光共聚焦显示空白组细胞凋亡率低于A组和B组,与A组比较,B组的细胞凋亡率降低(P0.05)。实时荧光定量PCR法结果显示空白组Nrf2 mRNA水平高于A组和B组(P0.05),与A组比较,B组mRNA水平升高(P0.05)。Western blot法显示空白组Nrf2蛋白水平高于A组和B组(P0.05),与A组比较,B组蛋白水平升高(P0.05)。与空白组相比,A组和B组PI3K、p-Akt、p-bad、Bcl-2的蛋白表达量增加(P0.05),Bax蛋白减少(P0.05),其中A组PI3K、p-Akt、p-Bad、Bcl-2的蛋白水平较B组增加(P0.05),Bax蛋白水平低于B组(P0.05)。结论 Nrf2基因的shRNA慢病毒载体pGLV3.GFP.Nrf2.shRNA在体外可抑制肝星状细胞活化,其作用机制可能与通过抑制PI3K-Akt通路促肝星状细胞凋亡有关。     

RNA干扰抑制大鼠肝星状细胞CTGF表达的实验研究

目的构建针对结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)的RNA干扰重组质粒及其对照质粒,将其转染到体外培养的大鼠肝星状细胞(Hepatic Stellate Cells,HSC)中,进一步应用Real-time PCR方法检测CTGFmRNA的表达,观察RNA干扰对大鼠肝星状细胞CTGF表达的抑制作用,为临床基因治疗提供依据。方法①利用pGCsi载体构建介导CTGF短发夹RNA(shRNA)表达的质粒重组体,并通过基因测序分析进行鉴定。②将构建成功的4组重组质粒转染大鼠肝星状细胞株(HSC-T6),另设空白对照组,48 h后,共聚焦显微镜检测绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达,分析转染效果。③检测CTGFmRNA表达水平,筛选出有效抑制CTGF表达的序列。④应用SPSS 17.0软件对数据进行方差分析。结果成功构建了能表达CTGFshRNA的三组重组体pGCsi-CTGFshRNA。pGCsi-CTGFshRNA成功转染到肝星状细胞中。与空白对照组相比,pGCsi-CTGFshRNA1组及pGCsi-CTGFshRNA2组细胞CTGFmRNA不同程度下降,pGCsi-CTGFshRNA3组细胞及非特异性shRNA组mRNA表达水平无明显变化。结论本实验成功构建了pGCsi重组质粒。重组质粒成功转染到大鼠肝星状细胞中。筛选出两条有效抑制CTGF基因表达的序列,pGCsi重组质粒能高效抑制大鼠肝星状细胞中CTGF的表达。     

bcl-2 RNAi表达载体的构建、鉴定及其对Raji细胞的干扰效果

目的 构建bcl-2特异性RNAi真核细胞质粒表达载体,并研究其对B细胞淋巴瘤Raji细胞的干扰效果.方法 根据GenBank提供的bcl-2 cDNA序列,设计并合成两对短发夹结构的互补DNA序列,经退火形成互补双链,克隆至载体pGenensil-1构建重组质粒,予以酶切和DNA测序鉴定.脂质体介导重组质粒转染Raji细胞,采用RT-PCR法观察重组质粒对bcl-2 mRNA表达的影响,流式细胞仪测定细胞凋亡.结果 酶切及测序鉴定表明,成功构建bcl-2 shRNA的质粒表达载体pGenesil-1-bcl-2-544和pGenesil-1-bci-2-1009.转染Raji细胞48 h后,RT-PCR结果显示Raji细胞中bcl-2 mRNA表达分别下调了(31.95±3.02)%和(47.57±2.88)%,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);流式细胞仪检测结果显示Raji细胞凋亡率分别为(14.25±0.84)%和(11.96±0.79)%,明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建bcl-2特异性RNAi真核细胞质粒表达载体,它能有效沉默bcl-2基因在B细胞淋巴瘤中的表达并促进B细胞淋巴瘤Raji细胞凋亡.     

bcl-2 shRNA表达载体的构建及其在K562细胞中的干扰作用研究

目的构建bcl-2shRNA表达载体，观察其在人白血病K562细胞系中对bcl-2基因的干扰作用。方法设计合成有短发夹结构靶位bcl-2基因的65个碱基的寡核苷酸，连接到载体pSIREN-Shuttle（pSS），构建了bcl-2shRNA表达载体，得到重组质粒pSS-shbcl-2-1、pSS-shbcl-2-2、pSS-shbcl-2-3和一个阴性对照，将其稳定转染K562细胞，分别用RT-PCR、Western-blot法检测转染后K562细胞bcl-2mRNA及蛋白质表达水平。结果成功构建了bcl-2shRNA的表达载体，并筛选到转染后K562细胞在pSS-shbcl-2-3组bcl-2基因的mRNA和蛋白质表达水平明显抑制。结论特异性的bcl-2shRMA可以干扰K562细胞中bcl-2基因的表达，针对bcl-2基因不同位点的不同shRNA也有干扰效果的差异。     

NDY1shRNA真核表达质粒构建及其在卵巢癌A2780细胞中的稳定表达

目的：构建NDY1 shRNA真核表达载体,并获得稳定表达shNDY1质粒的卵巢癌A2780细胞。方法根据Gen‐Bank数据库提供的NDY1基因核苷酸序列,设计并合成靶向干扰NDY1基因的小发夹RNA（shRNA）序列,插入表达载体获得重组质粒pGPU6／GFP／Neo‐shNDY1。重组质粒测序鉴定正确后,脂质体介导转染A2780细胞,经G418筛选及有限稀释法获得稳定转染细胞,采用实时定量聚合酶链反应法（RT‐qPCR）和蛋白免疫印迹法分别检测A2780稳定转染细胞NDY1 mRNA及蛋白表达。结果重组质粒测序正确,转染shNDY1后,A2780细胞mRNA及蛋白表达水平分别下降（72．89±4．83）％及（55．85±4．84）％,与对照组相比差异有统计学意义（ P＜0．05）。结论成功构建 pGPU6／GFP／Neo‐shNDY1真核表达质粒,并获得shNDY1稳定转染的卵巢癌A2780细胞,为细胞水平研究NDY1与卵巢癌的关系奠定实验基础。     

RNA干扰YWHAZ基因对结肠癌HCT-8细胞增殖的影响

目的:探讨中RNA干扰YWHAZ基因对结肠癌HCT-8细胞增殖的影响,阐明其作用机制。方法:构建靶向基因YWHAZ的siRNA载体重组质粒pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-792、pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-733、pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-612和pGPU6/GFP/Neo-YWHAZ-505作为RNA干扰质粒组,同时设立阴性对照质粒组(pGPU6/GFP/Neo-shNC质粒);采用荧光定量PCR检测YWHAZ mRNA的表达水平和表达抑制率;采用MTT法检测HCT-8细胞的增殖率。结果:倒置荧光显微镜下观察,细胞转染率为60%。荧光定量PCR检测,RNA干扰组YWHAZ mRNA表达水平低于阴性对照组(P<0.01),平均抑制率为52.86%。MTT检测,与阴性对照组比较,RNA干扰质粒组细胞增殖率明显降低(P<0.01),平均细胞增殖率为68.75%。结论:干扰YWHAZ可抑制该基因的转录,并抑制HCT-8细胞的增殖。     

shRNA介导胰岛素样生长因子Ⅰ类受体基因沉默诱导人肺癌A549细胞凋亡的体内外研究

目的评价RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术对人肺癌A549细胞系中胰岛素样生长因子Ⅰ类受体（IGF-IR）表达的抑制作用及其体内外抑瘤效应。方法将IGF-IR特异shRNA转染人肺癌A549细胞株,检测IGF-IR表达水平和bcl-2及caspase-3的表达变化;MTT法检测体外培养细胞的生长抑制率;流式细胞技术检测细胞增殖周期;Western印迹法分析Akt和ERK磷酸化程度;荷瘤裸鼠肺癌模型中观察瘤内注射的抑瘤效应及凋亡情况。结果IGF-IR表达抑制率达89．8％,bcl-2表达为对照组的46％±6％,caspase-3激活为对照组的156％±8％,Akt、ERK磷酸化分别为对照组的20％和36％±3％;肿瘤细胞活力明显下降;直接瘤内注射后肿瘤体积减少至对照组的40％-50％,并促进肿瘤细胞凋亡。结论运用RNAi技术能有效抑制A549细胞IGF-IR的表达,使细胞增殖能力减弱,凋亡增加,瘤体生长受抑。     

转染金属硫蛋白基因1A促进大鼠肝星状细胞增殖

目的: 观察金属硫蛋白基因1A(MT1A)对肝星状细胞(HSCs)增殖的影响.方法: 构建MT1A基因真核表达质粒,转染HSCs.通过RT-PCR、Western blotting法检测导入的质粒在HSCs中的表达,采用AgNOR染色法及Ki-67抗原免疫细胞化学染色检测 HSCs增殖指数.结果: MT1A基因在HSCs中过表达;转染MT1A基因组每个细胞AgNOR颗粒数(5.43±0.45)较pcDNA3.1组(3.94±0.39)及非转染组(4.14±0.34)均高(P<0.05);免疫细胞化学染色结果显示,转染MT1A基因组细胞Ki-67染色呈阳性,而对照组为阴性.结论: 外源MT1A基因在HSCs中过表达可促进其增殖.     

大蒜素诱导人膀胱癌细胞株BIU87细胞凋亡的研究

[目的]探讨大蒜素对人膀胱癌细胞株BIU87细胞凋亡的影响.[方法]MTT法检测大蒜素对BIU87细胞生长的影响;倒置显微镜、TUNEL法观察细胞形态变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期的变化;半定量RT-PCR法检测凋亡相关基因bcl-2,bax,caspase-3 mRNA表达的变化,比色法测定caspase-3活性变化.[结果]大蒜素能明显抑制BIU87细胞的生长,与大蒜素的浓度和作用时间有关,5 mg/L大蒜素作用5 d可以杀死50%以上的细胞;可诱导BIU87细胞凋亡,细胞周期阻滞在S-和G2期;凋亡相关基因bcl-2表达减少,bax无明显变化,caspase-3表达及活性增高.[结论]诱导细胞凋亡是大蒜素发挥抗瘤效果的一种重要机制;凋亡发生可能与细胞周期阻滞、bcl-2和caspase-3基因表达及活性变化有关.     

NDRG1干扰载体的构建及稳定过表达NDRG1人脑微血管内皮细胞的建立

目的：构建N-myc下游调节基因1 (NDRG1)的shRNA干扰载体和过表达载体,转染人脑微血管内皮细胞（hCMECs）后验证干扰和过表达效果并获得稳定过表达NDRG1的细胞。方法：将pGPU6-GFP质粒采用Bam HⅠ和BbsⅠ双酶切后,分别与设计的8条shRNA连接构建pGPU6-GFP-NDRG1 shRNA干扰载体,经测序鉴定后采用Lipofectamine 2000转染hCMECs,采用荧光显微镜观察载体转染效率,将PCR扩增的NDRG1编码区序列与pMD19-T连接,经测序正确后将重组质粒与pcDNA3.1空质粒采用限制性内切酶Bam HⅠ和HindⅢ双酶切,连接后构建pcDNA3.1-NDRG1过表达载体,采用Lipofectamine 2000将测序正确的过表达载体转染hCMECs,采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测干扰和过表达的hCMECs中NDRG1 mRNA表达水平,Western blotting法检测hCMECs中NDRG1蛋白表达水平,采用新霉素筛选出阳性克隆hCMECs。结果：pGPU6-GFP载体经双酶切后,电泳结果显示完全线性化,测序...     

靶向leptin基因的siRNA对大鼠肝星状细胞生物学特性的影响

目的 构建具有特异性瘦素（leptin）基因小于扰RNA（small interfering RNA，siRNA）功能的表达质粒，研究靶向leptin基因的siRNA对大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）中leptin表达及HSC生物学特性的影响。方法 以leptin为目的基因，以产生siRNA质粒载体psiRNA-hHlneo为表达模板，细胞内转录合成4对特异的siRNA和1对对照siRNA。构建能在真核细胞中表达的重组质粒leptinsi RNA，用酶切方法和测序法对重组体进行鉴定。应用脂质体介导重组质粒转染HSC。RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学法检测HSC的leptin表达情况，用MTT法检测细胞增殖，用流式细胞仪分析细胞凋亡。结果 酶切和序列测定表明，成功构建了leptinsiRNA表达质粒；外源重组质粒siRNA3和siRNA4能够抑制leptinm RNA和蛋白表达（均P〈0．01）；HSC增殖活性显著降低（P〈0．05），凋亡增加（P〈0．01）。与未转染组相比，consiRNA、siRNA1和siRNA2转染组没有显著改变（均P〉0．05）。结论 构建的leptinsi RNA表达载体可减少leptin的表达，抑制HSC增殖并诱导其凋亡。为肝纤维化基因治疗提供了新的靶点。     

RNA干扰survivin对卵巢癌HO-8910PM细胞周期的影响

目的 探讨RNA干扰survivin基因对卵巢癌HO-8910PM细胞周期的影响.方法 实验分3个组：siR-NA组,采用脂质体法将靶向survivin siRNA荧光真核表达质粒载体pGPU6-GFP-survivin-shRNA转染卵巢癌HO-8910PM细胞;空白对照组,单纯细胞培养;阴性对照组,用表达与survivin序列无同源性的siRNA片段质粒pGPU6-GFP-NC转染细胞.于转染后48 h和72 h,用PI单染法流式细胞术检测各组HO-8910PM细胞周期的变化以及Western blot检测survivin蛋白的表达情况.结果 PI单染流式细胞仪检测细胞周期结果表明,与空白对照组和阴性对照组相比较,2个时间点siRNA组转染后的G0/G1期细胞比例明显增加,而G2/M期细胞比例均下降（P＜ 0.05）;Western blot结果证实,siRNA组的HO-8910PM细胞survivin蛋白的表达量明显下调.结论 导入survivin基因特异性的siRNA可导致卵巢癌HO-8910PM细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞增殖受阻,且细胞sur-vivin蛋白表达量下降.     

CXCR4 shRNA对胶质瘤细胞U251增殖和侵袭能力的影响

目的 探讨CXCR4 shRNA对胶质瘤细胞U251体外增殖和侵袭能力的影响,为CXCR4 shRNA治疗胶质瘤提供实验依据. 方法 用脂质体LipofectimineTM2000将CXCR4-shRNA转染U251细胞,MTT实验检测转染细胞的增殖,Transwell侵袭实验检测转染细胞的迁移和侵袭能力. 结果 与转染非特异的pGPU6/GFP/NC组和未转染组比较,转染CXCR4-shRNA载体pGPU6/GFP/Rac 1-421组的U251细胞CXCR4 mRNA显著降低(P＜0.05),并且细胞体外增殖能力减弱(P＜0.05),侵袭到滤膜底面的细胞数为36.67±9.76,分别低于对应的pGPU6/GFP/NC组和未转染组(P＜0.05). 结论 CXCR4 shRNA载体pGPU6/GFP/Rac1-421可下调U251细胞CXCR4的表达,抑制U251细胞的增殖和迁移侵袭能力,提示CXCR4在胶质瘤发展过程中具有重要作用.