shRNA沉默DNA-PKcs表达对肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU耐药性的影响

目的观察shDNA-PKcs沉默DNA-PKcs基因对肝癌耐药细胞Bel7402/5-FU耐药性的影响。方法采用双酶切、测序分析鉴定shDNA-PKcs干扰质粒;用阳离子脂质体法将shDNA-PKcs质粒转染BEL7402/5-FU细胞,根据荧光细胞数计算转染率,Real-time PCR及Western blot检测沉默效率;MTT法检测细胞药物敏感性;Real-time PCR和Western blot检测P-gp mRNA和蛋白表达。结果双酶切鉴定结果显示质粒约为6300bp,测序结果显示插入序列为shDNA-PKcs序列。荧光细胞计数显示质粒的转染率为62.2%。Real time PCR及Western blot检测结果显示DNA-PKcs mRNA及蛋白水平的沉默效率分别为82.6%、71.8%;MTT检测结果显示shDNA-PKcs实验组的ADM和5-FU的IC50值比对照组ADM、5-FU低（P〈0.05）,DDP和MMC的IC50值与对照组比无统计学意义（P〉0.05）。Real time PCR和Western blot检测结果显示实验组P-gp mRNA、蛋白表达水平均比对照组低（P〈0.01）。结论 shDNA-PKcs干扰质粒能够有效抑制BEL7402/5-FU细胞中DNA-PKcs表达,增加细胞对化疗药物的敏感性,其机制可能与P-gp蛋白的下调有关。     

小RNA干扰对高表达RegIα基因胃癌细胞株增殖的影响

目的:探讨小RNA干扰(small interfering RNA,RNAi)对胃癌细胞株RegIα基因表达的抑制作用及对细胞增殖和凋亡的影响。方法:RT-PCR检测6株胃癌细胞的RegIα基因mRNA表达水平;体外构建RegIα基因小RNA干扰的重组质粒,分别稳定转染RegIα高表达细胞株MKN45和AGS,并设空载体作为对照组;应用RT-PCR和Western blot测定转染后细胞RegIα基因及其蛋白的表达水平;应用MTT法和流式细胞仪检测RegIα小RNA干扰对细胞增殖抑制率和凋亡的影响。结果:RT-PCR显示:与空载体组相比,转染RegIα小RNA干扰质粒后,MKN45和AGS细胞的RegIαmRNA明显被抑制;Western blot结果显示:MKN45和AGS细胞的RegIα蛋白表达水平分别降低至空载体组的(44±4)%和(25±4)%;MTT结果显示:RegIα小RNA干扰后MKN45和AGS细胞增殖均受到抑制,凋亡率分别为(12.96±0.50)%和(11.59±1.10)%,与空载体组比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:小RNA干扰可有效抑制胃癌细胞株中RegIα基因的表达,具有抑...     

RNA干扰Survivin基因对Hela细胞凋亡及抗肿瘤药物敏感性的影响

目的:研究RNA干涉Survivin基因表达对人宫颈癌Hela细胞凋亡及抗肿瘤药物敏感性的影响.方法:将Sur-vivin SiRNA片段通过脂质体的介导转染宫颈癌Hela细胞系;RT-PCR检测Hela细胞中Survivin mRNA的表达,Western Blot检测Survivin蛋白表达;确定转染成功使干扰组细胞Survivin表达下调后,以流式细胞仪检测细胞凋亡率变化;细胞计数后绘制生长曲线观察细胞增殖能力变化;MTT法检测细胞对抗肿瘤药物的敏感性变化.结果:与对照组相比,两个Survivin基因干扰组的mRNA和蛋白表达抑制率分别为55%,60%和42%,55%,表达均下降(P<0.05);细胞凋亡率分别为19%和22%,较对照组高(P<0.05);生长曲线显示干扰组的细胞增殖能力下降;同一剂量药物作用下,各组细胞对抗肿瘤药物的敏感性均有提高,其中NVB组和PDD组有统计学意义(P<0.05).结论:Survivin SiRNA片段转染进入Hela细胞后,Survivin mRNA和蛋白表达水平均下降,Hela细胞的凋亡率增加,对抗肿瘤药物的敏感性增加.     

shRNA沉默TPX2基因对肺腺癌细胞A549紫杉醇敏感性的影响

目的观察靶向Xklp2靶蛋白(TPX2)-短发夹状RNA(shRNA)对肺腺癌A549细胞TPX2基因以及紫杉醇敏感性的影响。方法将靶向TPX2基因的片段插入载体后构建重组质粒,经Lipofectamine 2000将其导入A549细胞,并进行筛选及克隆化培养。细胞分3组培养:(1)转染组;(2)阴性对照组;(3)空白对照组。反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白印迹法(Western Blot)分析转染前后TPX2基因的表达情况。MTT法检测转染干扰载体后A549细胞对紫杉醇化疗的敏感性变化。RT-PCR检测肺耐药蛋白(LRP)及多药耐药相关蛋白(MRP)mRNA表达水平的变化。结果与对照组相比,转染重组质粒后,TPX2基因的表达明显降低,MTT法显示转染TPX2-shRNA载体质粒的A549细胞对紫杉醇的敏感性明显增加;RT-PCR检测相关基因显示,LRP、MRP mRNA表达水平与空白对照组相比无明显改变(P>0.05)。结论 TPX2-shRNA干扰载体能有效抑制肺腺癌细胞系A549中TPX2基因的表达,并增强其对化疗药物的敏感性。     

shRNA抑制COX-2基因表达对肝癌细胞HepG2生长的影响

目的:应用RNA干扰技术抑制COX-2基因,观察其对肝癌细胞HepG2生长的影响.方法:构建靶向抑制COX-2基因表达的短发夹双链RNA(shRNA)真核表达载pshRNA-COX-2,转染肝癌细胞HepG2,用RT-PCR和Western Blot分别从mRNA和蛋白水平检测其对COX-2的抑制效应,MTT法检测对HepG2细胞生长的影响.结果:与未转染组相比,pshRNA-COX-2重组表达质粒抑制了HepG2细胞COX-2 mRNA及蛋白表达,抑制率分别为69.9%和50.3%;并可抑制HepG2细胞生长,72 h后有统计学差异(P＜0.05).结论:pshRNA-COX-2重组表达载体能显著抑制肝癌细胞COX-2基因表达,从而抑制肿瘤细胞增殖.     

RNA干扰ERCC1基因表达对卵巢癌顺铂敏感性的影响

目的研究ERCC1基因表达与卵巢癌顺铂耐药的关系。构建携带ERCC1基因小发夹干扰RNA的重组质粒表达载体,观察RNA干扰ERCC1基因表达对卵巢癌顺铂敏感性的影响。方法RT-PCR方法检测COC1、COC1/DDP细胞中ERCC1基因表达,基因重组技术构建携带ERCC1小发夹干扰RNA的重组质粒表达载体,脂质体法转染COC1/DDP细胞,RT-PCR及westernblot方法检测转染后细胞内ERCC1mRNA和蛋白的表达,MTT法检测转染后细胞对顺铂敏感性的改变。结果COC1/DDP细胞中ERCC1基因表达明显高于COC1细胞。重组质粒转染后,COC1/DDP细胞中ERCC1mRNA和蛋白表达显著下调。转染后细胞对顺铂的敏感性显著增加。结论COC1/DDP中ERCC1基因表达增强与卵巢癌顺铂耐药相关。RNA干扰抑制ERCC1基因表达能增加卵巢癌耐药细胞COC1/DDP对顺铂的敏感性。     

RNA干扰下调人胆管癌细胞系Hucct-1乳酸脱氢酶-A表达的体外研究

目的:体外实验观察乳酸脱氢酶-A(lactate dehydrogenase-A,LDHA)短发夹RNA对胆管癌细胞系Hucct1 LDHA表达的抑制效果,筛选出针对LDHA基因有效的干扰靶点,并检测LDHA表达下调后,细胞增殖活力的改变情况?方法:设计合成干扰LDHA表达的寡核苷酸片段,经退火?连接等步骤克隆到线性化pGPU6/GFP/Neo真核表达载体,转化入DH-5α大肠杆菌中扩增,经质粒抽提纯化后测序鉴定?重组质粒用脂质体法转染胆管癌细胞系,荧光显微镜观察转染效率;并分别利用RT-PCR及Western blot技术检测LDHA mRNA及蛋白表达,验证短发夹RNA的干扰效果?将干扰效率最高的质粒转染Hucct-1,MTT法检测干扰组较对照组细胞增殖的变化?结果:成功构建了靶向LDHA基因的3个shRNA质粒表达载体,脂质体法平均转染效率为(80 ± 5)%?荧光定量RT-PCR和Western blot显示瞬时转染si-LDHA-1?si-LDHA-3的Hucct1细胞LDHA mRNA和蛋白表达均较阴性对照组有不同程度的下降,其中si-LDHA-3干扰效果尤为明显?MTT法检测显示转染组Hucct1细胞较阴性对照组增殖减慢,转染后96 h两组差异具有统计学差异(P < 0.05)?结论:重组质粒能有效干扰胆管癌细胞Hucct1中LDHA基因的表达,经瞬时转染筛选出了有效干扰靶位,下调LDHA的表达,明显抑制胆管癌细胞系Hucct-1的增殖活力?     

Skp2 shRNA表达质粒的构建及其对肺癌细胞生长的影响

目的 构建Skp2基因的RNAi真核表达质粒,观察其对SIC-A-1肺癌细胞内Skp2基因表达及细胞生长的影响.方法 根据GenBank中Skp2cDNA序列设计针对Skp2基因的shRNA序列,合成序列并克隆人pGenSil-1质粒中,构建skp2 pshRNA重组质粒.脂质体介导重组质粒转染SPC-A-1肺癌细胞.RT-PCR检测肺癌细胞Skp2 mRNA的表达,Western blot检测Skp2蛋白表达.MTT检测各纽细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞周期改变.结果 重组质粒经酶切鉴定和测序,证实表达干扰质粒构建成功.转染重组质粒的肺癌细胞Skp2 mRNA和蛋白的表达明显下降(P<0.05),细胞生长增殖受到抑制,阻滞在G0/G1期的细胞比例增加,而进入S期的细胞比例明显下降(P<0.05).结论 构建的Skp2 shRNA表达质粒能有效下调Skp2基因的mRNA及蛋白的表达、抑制细胞的生长增殖.     

DNA-PKcs影响肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU耐药性的机制

目的利用RNA干扰技术探讨DNA-PKcs基因沉默影响肝癌细胞BEl7402/5-FU耐药性的机制。方法将靶向DNA-PKcs的干扰质粒shDNA-PKcs转染肝癌耐药细胞BEL7402/5-FU,利用实时荧光定量PCR及Western blot法检测转染干扰质粒后DNA-PKcs基因的沉默效率;Western blot检测Artemis、磷酸化Artemis蛋白水平的表达。结果实时荧光定量PCR及Western blot检测结果显示转染shDNA-PKcs后,DNA-PKcs mRNA及蛋白水平表达均下调（P〈0.05）;Western blot检测结果显示shDNA-PKcs转染组Artemis蛋白表达水平与对照组相比均有所降低（P〈0.05）,磷酸化Artemis蛋白表达水平在转染前后无明显变化（P〉0.05）。结论 ShDNA-PKs干扰质粒能抑制Bel-7402/5FU细胞中DNAPKcs、Artemis蛋白的表达、但对P-Artemis的表达无影响。     

Reversal of multidrug resistance in renal cell carcinoma by short hairpin RNA targeting MDR1 gene

目的 研究RNA干扰（RNA interference,RNAi）对肾癌细胞多药耐药基因(MDRl)表达的抑制作用,并分析干扰前后肾癌细胞对化疗药物敏感性的变化。方法 根据MDRl基因设计3条小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）序列,在质粒的介导下转染肾癌A498细胞,RT-PCR法分析转染前后MDR1 mRNA表达水平,筛选出干扰效率最高的siRNA序列;进而利用慢病毒包装siRNA重组质粒,感染A498细胞,RT-PCR法筛选沉默效果最好的细胞株进行克隆,Western bolt法检测MDR1蛋白表达水平,MTT法对比干扰前后多种化疗药物对细胞半抑制浓度（IC50）的变化;相关数据统计通过SPSS10.0软件进行。结果 3条siRNA序列均能不同程度地抑制细胞MDR1基因的表达,其中siRNA-1序列能更有效地封闭MDRl基因,使MDRl mRNA表达水平下降;筛选出的稳转细胞株与未干扰细胞株相比,MDR1蛋白表达量明显下降,并使多种化疗药物对细胞的IC50明显降低。结论 RNAi技术可有效抑制肾癌A498细胞MDRl基因的表达,并可显著增加其对多种化疗药物的敏感性,从而使肾癌细胞化疗耐药逆转成为可能。     

Enhanced Chemotherapy Sensitivity of Human Colon Cancer Cells to 5-Fluorouracil by siRNA Recombinant Expression Vector Targeting Survivin Gene

Objective To investigate the effects of small interfering RNA （siRNA） recombinant expression vector targeting survivin gene on chemotherapy sensitivity of human colon cancer cells to 5-fluorouracil. Methods siRNA recombinant expression vector targeting survivin gene was constructed and transfected into human colon cancer cell lines LOVO. After 48 hours of transfection, cells were harvested for analysis of survivin mRNA and protein expressions using RT-PCR and Western blot. In addition, after human colon cancer cell lines were treated with Survivin siRNA and/or 5-fluorouracil, MTT assay and flow cytometry were used to analyze cell proliferation and apoptosis. Results Restriction endonuclease analysis confirmed that siRNA recombinant expression vector targeting survivin gene was successfully constructed. Inhibitory ratios of survivin mRNA and protein expressions by Survivin siRNA were 36.33% and 44.65%, respectively. Survivin siRNA combined with 5-fluorouracil significantly increased the cell proliferation inhibitory ratio and apoptosis ratio compared with 5-fluorouracil treatin~ alone （P〈0.05）. Conclusion The siRNA recombinant expression vector targeting survivin gene can inhibit the expression of survivin gene, and enhance chemotherapy sensitivity of human colon cancer cells to 5- fluorouracil.     

Western blotting检测survivin封闭载体转染大肠癌SW620细胞的实验研究

【目的】探讨KNA interferenece（RNAi）对survivin在大肠癌细胞SW620表达的影响及siRNA干扰后诱导survivin蛋白表达降低的机制。【方法】构建survivin特异性的RNA封闭性载体survivin，通过培养大肠癌细胞SW620，survivin封闭性载体转染SW620细胞；Hoechest染色大肠癌细胞，通过荧光显微镜观察细胞形态变化；Western blotting分析肿瘤细胞的蛋白表达情况。【结果】DNA测序证实表达质粒构建成功；免疫荧光显微镜可见细胞凋亡小体；Western blotting显示：大肠癌survivin的蛋白表达明显弱于对照组。【结论】Survivin与大肠癌的发生存在一定的关系，RNAi能够下调survivin的表达。     

Survivin基因siFNA表达载体的构建及其在食管癌EC109细胞中的表达

目的为研究survivin基因的功能及食管癌的基因治疗,构建针对survivin基因的siRNA的表达载体,转染细胞EC109后观察其对survivm基因表达的抑制作用.方法利用网站选择适当位点设计并合成针对survivin基因nRNA的寡核苷酸序列,插入质粒pBAsi-hU6中形成重组载体pBAsi-survlvin.重组载体经测序鉴定后转染食管癌细胞EC109,western blot检测转染前后survivin蛋白的表达情况.结果测序结果与所合成的寡核苷酸完全一致,证实成功构建了针对sLurvivin基因的siRNA表达载体.Westem blot检测显示转染食管癌细胞EC109后有效抑制了survivin基因的表达.结论针对surivivin基因的siRNA表达载体成功构建,并能有效抑制食管癌细胞EC109中survivin基因的表达.     

凋亡抑制因子survivin基因的克隆及在真核细胞中的表达

目的:克隆Survivin编码序列并在真核细胞中表达.方法:RT-PCR扩增Survivin编码序列,建立与绿色荧光蛋白(GFP)共表达的融合重组质粒,转染哺乳动物细胞,利用GFP绿色荧光和WesternBlot检测Survivin蛋白的表达.结果:RT-PCR扩增出421bp的Survivin编码序列,构建融合重组质粒pEGFP-C1-Survivin,利用GFP荧光和Western Blot证实Sur-vivin蛋白的表达.结论:成功克隆Survivin基因并在真核细胞中表达.     

存活蛋白反义寡核苷酸诱导食管癌细胞凋亡的研究

目的观察存活蛋白反义寡核苷酸转染对食管癌细胞凋亡、增殖、对化疗药物敏感性的影响。方法设计合成特异性存活蛋白反义寡核苷酸（ASODN）。食管癌EC109细胞系分为6组：空白对照组、空脂质体转染对照组、正义链转染对照组、160、200、240nmol／L ASODN转染组。作用20h后收获各组细胞,Western blot法检测各组细胞生存素表达情况。TUNEL法检测各组细胞的凋亡情况。结果各ASODN转染组细胞存活蛋白表达有不同程度减弱,细胞变圆、折光增强、细胞碎片形成等,而各对照组细胞生长良好。各ASDON转染组细胞凋亡指数明显高于各对照组（P〈0．05）,以240nmol／L转染组最明显（P〈0．05）。结论封闭食管癌细胞存活蛋白基因,能下调存活蛋白的表达,从而诱导食管癌细胞凋亡,抑制食管癌的发展。     

Survivin基因沉默抑制胃癌MGC-803细胞增殖并增强其对塞来昔布的敏感性

目的研究Survivin基因沉默对人胃癌MGC-803细胞增殖和对化疗药物塞来昔布敏感性的影响。方法设计合成Survivin的siRNA序列,LipofectamineTM2000转染入MGC-803细胞。采用RT-PCR和Western blotting检测Survivin在干扰后mRNA和蛋白的表达情况,利用流式细胞仪检测细胞周期。通过MTT法和细胞克隆形成试验法察Survivin基因沉默后MGC-803细胞对塞来昔布的敏感性。结果 Survivin基因沉默48 h后,MGC-803细胞的Survivin基因和蛋白表达明显降低(P<0.05)。细胞周期被阻滞在G0/G1期,S期细胞数减少(P<0.05)。Survivin基因沉默组细胞对塞来昔布的敏感性显著性增强(P<0.05)。结论 Survivin特异性siRNA能显著沉默MGC-803细胞Survivin基因,抑制细胞增殖,并增强MGC-803细胞对塞来昔布的敏感性。