大鼠不同发育阶段β-防御素-2基因在肺组织的表达研究

目的：探讨大鼠β-防御素-2基因在肺组织表达的发育调控。方法：根据Genbank大鼠β-防御素-2的cDNA序列,设计一对特异引物。采用RT-PCR技术在大鼠不同发育阶段的肺组织总RNA中,扩增其特异cDNA片段,并进行DNA序列测定。借助Genbank中BLASI、程序,将从该cDNA序列推导的氨基酸序列与人的hBD-2和大鼠的rBD-1做相似性分析。     

大鼠β-防御素rBD-2的分子克隆及其在皮肤组织的诱导表达

本应用RT-PCR技术,根据Genbank公布的Noreway大鼠β-防御素-2cDNA序列设计引物,从Wistar大鼠皮肤组织总RNA中扩增出-cDNA片段,经核苷酸序列测定证实为全长β-防御素-2cDNA,,本实验还显示大鼠β-防御素rBD-2基因在大肠杆菌感染性损伤皮肤组织中的表达明显增强,与人hBD-2的表达相似。     

β-防御素-1基因在大鼠皮肤和肾脏固有表达

目的:检测大鼠β-防御素-1基因表达的组织分布。方法:从GenBank检索到的Norway大鼠β-防御素-1 cDNA序列,据此设计一对特异引物,采用RT-PCR技术在Wistar大鼠10种受检测组织的总RNA中,扩增其特异cDNA片段,然后进行克隆扩增、限制性内切酶谱分析和DNA序列测定。结果:在10种大鼠组织中,仅从皮肤和肾脏扩增出一条长度为272 bp的cDNA片段,在气管、子宫、骨髓、膀胱、小肠、脾脏、骨骼肌、腮腺等均未检测出其mRNA。其RT-PCR产物经测序分析证明系大鼠β-防御素-1 cDNA。结论:本研究显示大鼠β-防御素-1基因除在肾脏表达外,亦在皮肤组织固有表达,提示β-防御素-1亦可能在大鼠皮肤天然抵抗微生物感染机制中发挥作用。     

β-防御素-1基因在大鼠皮肤和肾脏固有表达

目的：检测大鼠β-防御素一1基因表达的组织分布。方法：从Genbank检索到的Norway大鼠β-防御素-1 cDNA序列,据此设计一对特异引物,采用RT-PCR技术在Wistar大鼠10种受检测组织的总RNA中,扩增其特异cDNA片段,然后进行克隆扩增、限制性内切酶谱分析和DNA序列测定。结果：在10种大鼠组织中,     

大肠杆菌感染对大鼠肺组织β-防御素-2基因表达的负相调节作用

目的:探讨细菌对大鼠β-防御素-2(rBD-2)基因的表达调控。方法:将大肠杆菌E.coliML-35p和绿脓杆菌ATCC27853大鼠气管内接种,于24h后提取肺组织RNA,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法和Northernblot检测大鼠β-防御素-2基因的表达变化。结果:气管内接种大肠杆菌24h后使大鼠肺组织β-防御素-2mRNA的表达受到显著抑制,绿脓杆菌对其基因的表达却没有抑制作用。结论:大肠杆菌感染可负相调节大鼠肺组织rBD-2mRNA的表达。     

大肠杆菌对大鼠肺组织β-防御素-2基因表达的抑制

目的：探讨细菌对大鼠β-防御素-2(rBD-2)基因的表达调控。方法：将大肠杆菌E．coliML-35和绿脓杆菌27853大鼠气管内接种,于24小时后提取肺组织RNA,用RT-PCR法检验大鼠β-防御素-2基因的表达情况。结果：气管内接种大肠杆菌使大鼠肺组织β-防御素-2mRNA的表达受抑制。结论：大肠杆菌及其产物直接或通过炎症细胞因子间接抑制rBD-2mRNA的表达。     

人β防御素2在大鼠子宫内膜异位模型异位病灶组织中的转染表达

目的构建人β防御素2（hBD-2）的真核表达载体PLXSN的重组质粒pLXSN-hBD2,将其转染至大鼠子宫内膜异位症（EMS）模型的局部异位病灶组织,并检测hBD-2基因和蛋白表达。方法利用双酶切定位定向克隆技术,将hBD-2基因片段连接于pLXSN质粒的EcoRI和BamHI两个酶切位点之间,构建重组质粒pLXSN-hBD2。自体内膜移植法建立大鼠EMS模型,将pLXSN-hBD2局部多点注射至其局部异位病灶组织,Western印迹检测局部病灶组织中的hBD-2蛋白表达。结果经过重组质粒的鉴定电泳以及测序鉴定,设计合成的基因片段序列与GenBank中hBD-2cDNA序列完全相同,其中碱基54-248为目的基因hBD-2序列。Western印迹证实大鼠EMS模型异位病灶局部有hBD．2蛋白的表达。结论通过局部多点注射的方法,可将携带hBD-2基因的重组质粒pLXSN-hBD2成功转染至大鼠EMS异位病灶组织中,并获得hBD-2蛋白的表达。     

大肠杆菌感染对大鼠肺组织β—防御素—2基因表达的负相调节作用

目的：探讨细胞对大鼠β-防御素－2(rBD-2)基因的表达调控。方法：将大肠杆菌E.coli ML-35p和绿脓杆菌ATCC 27853大鼠气管内接种，于24h后提取肺组织RNA，用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）法和Northern blot检测大鼠β－防御素－2基因的表达变化。结果：气管内接种大肠杆菌24h后使大鼠肺组织β－防御素－2mRNA的表达受到显著抑制，绿脓脓杆菌对其基因的表达却没有抑制作用。结论：大肠杆菌感染可负相调节大鼠肺组织rBC-2 mRNA的表达。     

大鼠巨噬细胞环加氧酶-2剪接异构体mRNA片段的分离和鉴定

目的：分离和鉴定大鼠巨噬细胞环加氧酶-2剪接异构体mRNA片段，并分析其可能意义。 方法： 采用RT-PCR和测序分析从大鼠巨噬细胞扩增、分离环加氧酶-2剪接异构体cDNA片段，并推导环加氧酶-2剪接异构体氨基酸序列，利用生物信息软件对氨基酸序列进行分析。 结果： 大鼠肺和血管平滑肌组织及腹腔巨噬细胞均发现COX-2目的条带（253 bp），但腹腔巨噬细胞则出现了一条新的电泳带（422 bp），经克隆和测序证实，该条带除目的条带的COX-2 DNA的第7、8外显子序列外，还包含第7、8外显子间的内含子序列，即保留的内含子（169 bp）。根据阅读框推测，在保留的内含子第21-23碱基出现终止密码。 结论： 首次发现大鼠腹腔巨噬细胞中存在COX-2基因的选择性剪接异构体(Genbank accession number:BU500100)，其生物学意义有待进一步研究。     

大鼠小脑部分表达序列标签的鉴定

目的:为了获取大鼠小脑特异表达的cDNA序列,筛选新的EST基因片段,以便进一步获取有意义的cDNA全基因。方法:以大鼠大脑、脑干mRNA逆转录cDNA作为driver(驱动)cDNA,大鼠小脑mRNA逆转录cDNA作为tester(测试)cDNA,经消减杂交法,消除与大脑及脑干相同的cDNA,并富集低丰度基因,从而获得大鼠小脑特异表达基因片段,以及低表达基因片段,克隆制备成大鼠小脑特异表达cDNA文库。结果:共挑选出32个阳性克隆质粒,测序得到34个不同基因片段的序列。最后用反Northern杂交去除假阳性,筛选出8个有意义的差异表达cDNA基因片段。同时,将测序结果与Genbank进行同源性比较,发现13个新的EST序列,并申请获得基因序列号(AW288461-AW288474)。结论:抑制消减杂交法是一种筛选特异表达基因的有效方法。本结果可为研究脑功能的分子机制提供有益的资料。     

三七总皂苷对低氧大鼠肺动脉压和肺组织p38 MAPK表达的影响

目的:探讨三七总皂苷(PNS)对低氧大鼠p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)表达的影响,及预防低氧性肺动脉高压(HPH)的作用和机制。方法:将30只SD大鼠随机分为3组:正常对照组、低氧组和低氧+PNS组。观察各组大鼠平均肺动脉压(mPAP)、平均颈动脉压(mCAP)和右心室/(左心室+室间隔重量)比[RV/(LV+S)],免疫组化法和RT-PCR法分别检测肺小血管壁磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)蛋白和肺组织中mRNA的含量。结果:与对照组相比,低氧组大鼠mPAP、RV/(LV+S)明显升高,肺小动脉p-p38 MAPK及肺组织p38 MAPK mRNA含量显著升高(P0.05)。低氧+PNS组mPAP、RV/(LV+S)、肺小动脉p-p38 MAPK及肺组织p38 MAPK mRNA含量明显低于低氧组(P0.05)。结论:PNS具有显著预防HPH的作用,其机制可能与其降低p38 MAPK mRNA的表达有关。     

Integrin β1在出生前后大鼠中脑黑质的表达

为了检测integrinβ1在出生前后大鼠中脑黑质的表达,并探索其在大鼠黑质神经细胞发育过程中的可能作用,本实验采用RT-PCR、Western blot和免疫组织化学染色方法,来测定胚龄(embryonic day,E)E16d、E18d、E20d的健康SD胎鼠及出生后1d(postnatal day1,P1)、P3d、P7d、P14d、P21d的健康仔鼠中脑黑质组织中integrinβ1的表达情况。RT-PCR和Western blot结果显示,在检测的各时间点,大鼠中脑黑质integrinβ1都有明显表达,且其mRNA和蛋白质水平变化一致。在E16时,integrinβ1mRNA和蛋白质出现高表达,此高表达一直持续到P7时;而至P14时,integrinβ1mRNA和蛋白质表达水平明显降低,且此低水平表达随发育而持续;P21时与P14时相比无明显差异。而免疫组织化学染色结果显示,在各时间点,大鼠中脑黑质一直有大量integrinβ1阳性细胞存在。在E16~P14各时间点,integrinβ1阳性细胞胞体逐渐增大,P21时与P14时相比,阳性细胞胞体大小无明显变化。而单位面积内integrinβ1阳性细胞数,在E16~P7各时间点无明显差异,但至P14时,单位面积内integrinβ1阳性细胞数则明显降低,且此降低随发育而持续,P21时与P14时相比无明显变化。以上结果表明,在大鼠中脑黑质发育过程中,integrinβ1在E16~P7期间持续高表达,而至P14~P21期间,其表达量明显降低。这种表达变化与大鼠发育期间黑质多巴胺(DA)能神经元的自然凋亡时程相一致,提示integrinβ1的表达与此期间黑质DA能神经元的凋亡有关。     

一氧化碳对低氧性肺动脉高压的效应

目的:探讨外源性低浓度一氧化碳(CO)在低氧性肺动脉高压中的作用。方法:60只Wistar大鼠随机分为常氧组、低氧组、血晶素组、锡原卟啉组和低浓度CO组,每组12只。处理完毕后,右心导管法测定肺动脉平均收缩压和右心室压。杀鼠取肺组织,应用分光光度法测定肺组织HO-1活性,并进行常规免疫组织化学染色,应用逆转录多聚酶链式反应测定测定肺组织的HOmRNA水平。结果:①低浓度CO组肺动脉压为(18.52±3.24)mmHg,明显低于低氧组但仍高于常氧组(均为P＜0.01);②低浓度CO组HO-1活性为(1052.48±308.49)nmol·g^-1(protein),显著高于正常组(P＜0.01);③低浓度CO组HO-1蛋白表达水平均高于常氧组和低氧组(P＜0.01);④低浓度CO组HO-1mRNA水平的光密度值为2.63±0.18,显著高于正常组(P＜0.01)。结论:CO-HO系统参与了低氧性肺动脉高压的发病机制;低浓度CO可以有效促进HO-1mRNA表达,使HO-1活性和蛋白表达水平升高,进而部分降低肺动脉压力。     

烟雾对组蛋白去乙酰化酶2在COPD大鼠肺组织中表达的影响

 摘要 目的 比较接触烟雾不同时间后慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)大鼠肺组织之间及与正常大鼠肺组织中组蛋白去乙酰化酶2（histone deacetylase 2,HDAC2）表达的差异,探讨烟雾对组蛋白去乙酰化酶2在COPD大鼠肺组织中表达的影响。 方法 在自制密闭有机玻璃箱内让大鼠吸入香烟烟雾,实验组根据烟熏和COPD形成时间不同分为4组,每组10只大鼠;对照组为正常大鼠10只。免疫组织化学法和原位杂交法分别测定HDAC2的蛋白和mRNA在肺组织中的表达。 结果 实验各组HDAC2蛋白质和mRNA的A值均低于对照组（p<0.05）,实验组各组间比较p值也均小于0.05,差异有统计学意义。结论 HDAC2在实验组COPD大鼠肺组织中的表达低于正常对照组,而且随着接触烟雾时间延长呈下降趋势。     

mtLSU-巢式PCR检测实验大鼠卡氏肺孢子虫的实验研究

目的对mtLSU-巢式PCR方法检测大鼠卡氏肺孢子虫的应用价值以及基因序列进行评价。方法采用地塞米松免疫抑制法诱导大鼠感染肺孢子虫;实验组10只,对照组1只;诱导至第7周时收集实验组及对照组大鼠肺组织和支气管肺泡灌洗液（BALF）标本,采用mtLSU-巢式PCR方法对人源与鼠源肺孢子虫共有的基因进行扩增和序列测定,同时采用镜检法对实验组大鼠肺组织和肺泡灌洗液标本进行检测,评估两种方法的敏感性。结果采用mtLSU-巢式PCR方法对实验感染大鼠肺组织和BAL进行检测,卡氏肺孢子虫DNA阳性率分别为100%（10/10）、90%（9/10）。而GMS染色镜检法检测的阳性率分别为80%（8/10）、60%（6/10）。所测Wistar大鼠卡氏肺孢子虫mtLSU基因序列长度为155bp,与GenBank的大鼠源肺孢子虫（U20170）及人源肺孢子虫（DQ473446）同源性均为100%（154/154、155/155）。结论 mtLSU-巢式PCR方法应用于大鼠卡氏肺孢子虫检测敏感性高,特异性强;获得与人源耶氏肺孢子虫相同的Wistar大鼠卡氏肺孢子虫mtLSU的基因序列。     

左向右分流先天性心脏病儿童AT2受体的表达

目的：探讨未发生梗阻性肺动脉高压的左向右分流先天性心脏病儿童骨骼肌血管是否有AT2受体表达，及肺循环AngⅡ受体的表达。 方法： 20例左向右分流先心病患儿术中取肺、骨骼肌活检。用RT-PCR和免疫组化的方法检测这些骨骼肌中的AT2受体；并对肺组织中AT1和AT2受体的mRNA作半定量分析。 结果： RT-PCR在这些骨骼肌中均检出AT2受体的mRNA；这些骨骼肌血管的AT2受体免疫组化染色均为阳性。这些患儿肺组织中AT2受体的mRNA水平比AT1受体高（P＜0.05）。 结论： 左向右分流先心病儿童骨骼肌血管有AT2受体表达；肺循环AT2受体表达水平比AT1受体高。     

Expression of the human β-defensin-1 induced by dehydroandrographolide in human pulmonary gland epithelial cells

In this study we observed the enhanced mRNA and protein expression of human β-defensin-1 (hBD-1) induced by dehydroandrographolide (DA) in human gland epithelial cells and explored the mechanism of DA on infection treatment. Human pulmonary gland epithelial cells were incubated with DA, then were harvested for hBD-1 expression detection. The mRNA expression of hBD-1 was detected by RT-PCR while the protein expression was detected by Western blot. It was found that DA can up-regulate mRNA and protein expression of hBD-1, the optimal concentration was 80 µM, the maximal expression of hBD-1 mRNA and protein occurred after 8 h. The DA can up-regulate mRNA and protein expression of hBD-1 in human gland epithelial cells. It suggests that β-defensin-1 may play an important role in the treatment of infective diseases with DA.