高通量自动化类器官芯片研究进展

类器官是利用干细胞的自更新和自组织能力在体外构建的三维多细胞培养物,其复现了对应器官或组织的关键结构和功能特征,为发育生物学、再生医学、疾病建模和药物开发等领域提供了理想的体外模型和研究平台。然而,传统的类器官培养体系依赖于手动操作,培养流程较为繁琐,且培养物个体差异和批次差异较大,成为限制类器官转化和应用的重要原因之一。因此,工程化类器官培养体系通过引入微流控芯片技术来提升类器官培养体系的通量和自动化程度,对于实现类器官大规模、均质化、标准化培养具有重要意义。该文综述了高通量自动化类器官芯片的研究进展,并探讨了类器官培养通量和标准化的主要限制性因素和潜在挑战。     

类器官研究进展及应用

类器官是一种新型体外研究模型,由干细胞或肿瘤细胞在三维培养条件下自我组装而成。它能够高度模拟原位组织的生理结构和功能,经长期传代保持遗传信息的稳定,因此类器官在构建疾病模型、药物筛选及个体化医疗等方面具有广阔前景。目前,食道、胃、肠、肝、胰、前列腺和乳腺等结构的类器官和相应的肿瘤类器官均已面世,开拓了体外培养的新平台。本文将对类器官的类型及其在生物医学领域的应用做一综述。     

类脑器官与移植治疗

在体外给予人多能干细胞不同的培养基及培养条件,可朝向外胚层、中胚层、内胚层等不同方向分化,获得3D"人体类器官",如肺、胃肠道、肝脏和心脏等类器官,以及类脑器官(cerebral organoids)。目前,类脑器官主要用于研究脑发育进程、模拟脑发育疾病、开展药物测试等。例如,模拟寨卡病毒引起的头小畸形症;探究产前酒精暴露对脑神经发育的影响;利用类脑器官芯片模拟尼古丁暴露等。以脑卒中为代表的脑血管疾病,在中国和全球分别是第一和第二致死原因,以及主要致残原因,目前缺少有效的治疗手段。在全世界儿童和青年群体中,脑创伤是致死和致残的主要病因,但治疗手段有限。近年,我们课题组利用类脑器官首次开展了脑缺血模型构建及类脑移植治疗脑卒中、脑创伤的研究,希望推动新的治疗策略的研发。在脑缺血模型构建中,使用类脑制备人源化脑缺血模型,探讨了该模型类脑培育时间与体积挑选标准;阐释了类脑损伤程度和缺血时间的时效关系;证明了部分潜在脑缺血神经保护药和脑缺血相关通路化合物在该模型中的有效性和适用性,为脑卒中药效学研究提供了一种新的评价模型,有助于克服种属差异问题。在脑缺血移植治疗中,使用类脑开展移植治疗作用及机制研究。发现脑缺血后6或24 h,类脑移植均显著降低脑梗死体积,改善神经肌肉运动功能。阐析了作用机制,发现类脑移植:(1)具有多向分化潜能,通过原位分化和细胞替代支持脑运动皮层特异性重构、形成调节神经递质释放的神经元、实现与宿主脑之间的突触连接;(2)在宿主脑内迁移和整合;(3)增强神经再生、突触重构、血管新生,减少神经细胞凋亡,增加神经元存活。从而,证明了脑卒中类脑移植治疗的可行性和有效性,为类脑移植作为脑卒中潜在有效的治疗策略提供了第一手实验证据。在脑创伤运动障碍疾病模型中,开展类脑移植治疗及机制研究。通过比较55 d类脑和85 d类脑在移植前的细胞组成和细胞数量、移植后介导的神经再生作用与细胞存活数量,发现55 d类脑比85 d类脑更适合作为脑损伤移植供体。阐析了作用机制,发现类脑移植:(1)具有多向分化潜能,通过原位分化和细胞替代支持脑运动皮层特异性重构;(2)沿着胼胝体在宿主脑内广泛迁移;(3)上调患侧海马中神经连接相关蛋白(PSD-95,synaptophysin)和神经营养因子(BDNF,NGF,EGF)的蛋白表达水平。整体功能显示,类脑移植显著改善脑创伤后神经肌肉运动功能恢复,提示类脑移植用于脑创伤运动障碍疾病治疗的可行性。     

心脏类器官的研究进展及在药物发现研究中的应用

心血管疾病是人类卫生健康的重要威胁,也是药物研发的重要研究领域。类器官是利用干细胞的自我更新和分化能力,通过体外培养构建的一类与真实器官结构和功能类似的微器官。由于心脏类器官具备人源性、更贴近体内的结构和功能、可实现自组装及遗传稳定性好的特点,其在心脏发生发育研究、心血管疾病模型构建药物研发领域中的应用受到广泛关注。因此,本文将对近年来心脏类器官的发展与构建策略、心脏类器官在药物研发领域中的应用及该技术的前景进行讨论。     

类器官在癌症基础研究和临床转化中的应用

类器官是成体干细胞或多能干细胞体外三维培养形成具有特定结构的组织类似物,与对应的器官具有高度相似的组织特性和生理功能。肿瘤类器官能够很好地保留癌症患者体内肿瘤的组织学和突变特征,在构建肿瘤类器官样本库、重建肿瘤微环境、研究肿瘤的发生发展机制以及制定个性化治疗方案和药物筛选等方面发挥了重要的作用,但目前仍存在着一些因素限制了肿瘤类器官的进一步发展。综述类器官技术在肿瘤基础研究和临床转化中的应用及面临的挑战,并对未来肿瘤类器官的发展方向予以展望。     

子宫内膜上皮细胞类器官在生殖领域的研究进展

近年来,子宫内膜上皮细胞类器官研究在生殖领域取得了显著进展。传统的二维细胞培养模型和动物实验难以准确还原子宫内膜的三维结构和生理功能,从而限制了对子宫内膜上皮细胞正常生理机制和相关疾病机制的深入研究。新兴的类器官技术为此提供了新途径,子宫内膜上皮细胞类器官通过干细胞或前体细胞在三维培养基中自行组织形成,成功地高度还原了在体子宫内膜腺体的特征。这种类器官模型不仅能够模拟子宫内膜上皮细胞在不同周期阶段的生理变化,还能够模拟囊胚与子宫内膜之间的复杂互动过程。此外,子宫内膜上皮细胞类器官系统为生殖领域的基础研究和临床研究提供了重要工具,包括生殖相关基础研究、疾病机制探索、药物筛选及靶向治疗研究等。这些研究可为深入了解子宫内膜的生物学特性、疾病机制以及相关疾病的治疗策略提供全新的思路和方法。     

类器官模型在前列腺癌研究与治疗中的应用

前列腺癌(prostate cancer,PCa)是男性常见恶性肿瘤之一,由于其高度异质性及耐药性,一般治疗无法使患者获得最大收益。啮齿类动物与人的前列腺发育有较大区别,现有2维模型无法重现PCa患者特性,而类器官体外模型的出现,为PCa研究提供新思路,架起2维培养与体内模型之间的桥梁。该文介绍现有的前列腺模型,包括2维细胞系模型,患者来源的异种移植模型(来源系患者、循环肿瘤细胞、诱导多能干细胞的类器官模型)以及患者来源的异种移植的类器官模型,概述其在应用中的优势以及不足之处。     

成体神经千细胞应用研究进展

成体脑内神经干细胞，成体周围组织干细胞诱导产生的神经干细胞都具有更新及分化的潜能。用于治疗神经系统疾病如缺血性卒中、神经退行性疾病及脊髓损伤等有其独特的优势和应用前景。     

一种结肠类器官的提取分离方法

类器官是一种来源于干细胞，在特定诱导条件下分化为与研究器官细胞组成类似的3D培养物。与传统细胞培养物相比，类器官更加接近研究器官的三维结构和特征，因此基于类器官进行研究更能体现所研究器官体内的真实反应。这一研究手段广泛应用于肿瘤药物筛选，具有广阔前景。文章目的是建立一种稳定的结肠类器官提取分离方法，使得到的类器官有良好的增殖活性；建立结肠类器官增殖活性评价方法，能够准确评价结肠类器官的增殖活性。采用方法为取大约5 cm C57BL/6小鼠的结肠，用胶原酶分离结肠隐窝，通过梯度离心纯化隐窝，最后将其用基质胶包埋接种在培养皿中，加入肠道类器官培养基培养6 d,最后使用光学显微镜拍照记录并量化类器官的出芽情况，通过qPCR检测干细胞标志物Lgr5的表达。结果显示提取得到的类器官较为纯净，通过光学显微镜可以记录类器官的出芽情况，计算平均每个类器官含有的隐窝数来量化类器官增殖活性，qPCR检测发现干细胞标志物Lgr5的表达与平均每个类器官含有的隐窝数变化一致，因此可以通过出芽情况和基因表达情况来表征类器官的增殖活性。文章建立的结肠类器官提取和分析方法可以用于研究在不同条件影响下结肠类器官的增殖变...     

子宫内膜类器官研究进展

子宫内膜周期性改变过程中的失调均可导致子宫内膜相关疾病的发生、发展，从而影响妇女健康。目前，由于缺乏表征子宫内膜发生、发展特性的研究模型，子宫内膜疾病发病机制研究和治疗药物开发受到一定限制。类器官是一种干细胞来源或原始组织来源的三维培养细胞群，由于其遗传特征、组织学特征、生物学特征与原始组织、器官的一致性，可代表来源器官或组织的功能。可传代扩增的子宫内膜类器官研究模型能保持基因组稳定性，弥补了传统细胞与动物模型的不足。该文综述了子宫内膜类器官模型的优势及其组织学特征、遗传学特征、生物学特征及其相关应用。     

气道类器官显微注射及极性反转模型的构建

目的 探索通过显微注射及极性反转的方式建立高效模拟呼吸道病毒感染的新方法。方法 获取8周龄雄性C57BL/6小鼠肺组织,提取呼吸道上皮细胞,建立类器官transwell培养模型。通过改进传统显微注射平台,将绿色荧光蛋白(GFP)标记的流感病毒PR8(GFP-PR8)定量注射入类器官内,观察类器官形态变化及紧密连接蛋白、微管蛋白的免疫荧光染色特点。通过悬浮培养的方法诱导极性内向反转为极性外向(AO),通过HE染色鉴定极性反转的形态学特点。对普通类器官及反转后类器官进行PR8攻毒,观察感染效率及不同浓度的病毒感染下主要通路基因的表达差异。结果 普通类器官经显微注射后体积会明显增大。注射PR8后,类器官顶端区域被感染的效率明显增高且会出现明显的损伤,表现为紧密连接蛋白及微管蛋白的蛋白表达显著下调。将类器官悬浮培养后,纤毛细胞极性随时间逐渐反转向外,于第6天起反转比例趋于稳定。反转后的类器官被病毒感染的效率显著提高,细胞损伤显著。0.01感染复数(MOI)的PR8攻毒后,AO类器官出现明显的炎症通路及分化相关基因的改变;在更高浓度PR8感染后则出现与之前相反的变化趋势。结论 极性反转和显微注射...     

类脑救治脑创伤的研究

目的比较和研究不同培养天数类脑移植治疗脑创伤的效果。方法 (1)比较85 d类脑和55 d类脑的细胞数目和数量。(2)使用活检穿孔器在大鼠右侧感觉运动皮质造成机械性损伤,使其出现运动功能障碍。随即在大鼠皮质损伤区域移植55 d类脑和85 d类脑,分为55 d类脑移植组、85 d类脑移植组、创伤组和假手术组。(3)分别在大鼠术后的第7,14,28和56天通过免疫荧光、免疫组化等染色比较各组间神经再生、炎症反应等情况。(4)在手术后的第2,5,7,11,14,21,28,35和42天分别对55 d类脑移植组、创伤组和假手术组大鼠进行m NSS(modified neurological severity scores)评分和平衡木实验,计算各组大鼠的得分情况,评估大鼠术后神经功能恢复情况。结果 (1) 55 d类脑包含更多的神经干细胞,85 d类脑包含更多的成熟神经元,同时具有更多的细胞量。(2)类脑移植可以促进脑创伤大鼠神经再生且不加重炎症反应,55 d类脑移植效果更佳。(3)类脑可以在宿主脑内进一步生长分化,同时上调神经连接蛋白和神经营养因子的表达。(4)类脑移植可以促进脑创伤大鼠运动功能恢复。结论类脑移植可以促进脑创伤大鼠神经再生,上调脑创伤大鼠脑内神经连接蛋白和神经营养因子的表达,改善脑创伤大鼠神经功能,其中55 d类脑移植有更高的细胞存活率和更好的神经保护作用。移植的类脑可以在大鼠脑内存活分化成多种运动皮质区的神经细胞,同时还能进行细胞迁移和与大脑皮质形成血管连接。     

3D类器官心脏肥大模型的建立及在心血管病治疗中药作用机制解析中的应用

与传统二维(2D)单层培养模式相比,三维(3D)类器官培养能更好地模拟器官组织的生理及病理状态。本研究利用1～3天新生大鼠心脏成纤维细胞(CFs)、心肌细胞(CMs)和内皮细胞(ECs)构建了3D心脏类器官体。动物实验方案经天津中医药大学实验动物福利与伦理委员会审查,符合相关规范。通过观察类心脏直径和搏动情况确定了最佳接种细胞数和培养时间。通过荧光染色对其层次结构和类心脏功能进行评价,发现细胞数为1×104构建的类心脏微球不仅培养34天后仍可自发性搏动且保持特征细胞层次结构。基于此类心脏微球用苯肾上腺素(PE)为诱导剂构建了心脏肥大模型,并通过线粒体质量、细胞内Ca2+浓度、线粒体膜电位等指标进行评价。为进一步验证所建立模型可用于防治心肌肥大药物的筛选,本研究选用冠心宁注射液(GXNI)进行评价。结果表明GXNI显著逆转了PE导致的心脏微球面积和直径变大,以及线粒体质量、细胞内Ca2+浓度的增加和线粒体膜电位的降低,并减弱心钠肽(ANP)、脑钠肽(BNP)和β心肌肌球蛋白重链(β-MHC)的表达上调。本研究成功建立了诱导心脏肥大导致心脏重塑的3D类心脏体外模型,在此体系中,心脏球状体具...     

依托泊苷诱导的人小肠类器官衰老模型的构建及鉴定

目的 用依托泊苷(etoposide)诱导类器官发生DNA损伤构建人小肠类器官衰老模型。方法 临床活检小肠组织，体外无菌分离获得小肠隐窝，在培养基中培养成为类器官。类器官用依托泊苷10μmol·L^-1处理7 d，倒置相差显微镜观察类器官表面形态变化，Western印迹法检测DNA损伤标志物磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)水平；衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性染色检测类器官SA-β-gal阳性细胞面积百分率，Western印迹法检测衰老标志物p16^INK4A蛋白表达水平。结果 人小肠隐窝体外成功培养成球。依托泊苷诱导的人小肠类器官衰老模型表面皱缩，类器官部分死亡，整体表面积变小；类器官中γH2AX蛋白表达显著上调(P<0.01);SA-β-gal阳性细胞面积百分率显著增加(P<0.01)，约90%细胞呈SA-β-gal阳性；p16^INK4A蛋白表达显著增加(P<0.01)。结论 依托泊苷处理可诱导人小肠类器官发生DNA损伤，从而诱导人小肠类器官衰老。     

神经生长因子和脑源性神经营养因子对神经干细胞迁移的影响

目的:探讨神经生长因子(nervegrowth factor,NGF)与脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)体外实验对神经干细胞迁移的影响.方法:体外应用半固体培养法连续14d观察不同浓度的NGF、BDNF及NGF +BDNF组合诱导神经干细胞迁移的情况.结果:体外条件下不同浓度的神经营养因子的组间和组内比较显示,100μg/L BDNF诱导神经干细胞迁移作用最明显.BDNF+NGF联合组在诱导神经干细胞迁移方面未见协同效应.结论:NGF、BDNF二者皆有诱导神经干细胞迁移的作用,100μ g/L BDNF组诱导迁移作用最明显.     

类器官在儿童遗传性疾病中的应用研究进展

类器官是高度保留其来源组织器官特性的体外3D组织培养物,在生物医学领域得到了广泛的应用。类器官可以作为研究疾病的体外模型,有助于进一步了解疾病的病理生理和分子机制,为遗传性疾病的个性化治疗提供了技术支撑。该文将围绕类器官技术在儿童遗传性疾病中的应用,着重介绍其在模拟疾病模型、矫正遗传缺陷、个性化治疗方面的优势及潜在的发展前景,以期为后续研究提供参考。     

3D血脑屏障类器官氧糖剥夺模型的构建及冠心宁注射液的保护作用探究

血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)在维持中枢神经系统稳态方面发挥着重要作用。在许多神经系统疾病如缺血性脑卒中、阿尔茨海默症等疾病中都会出现BBB损伤。中医药对于防治缺血性脑卒中潜力巨大,但临床相关模型的缺乏已成为其应用开发的瓶颈。本研究采用了由人脑微血管内皮细胞(HBMEC)、人脑星形胶质细胞(HA)和人脑血管周细胞(HBVP)组成的BBB类器官模型,并建立了细胞活力、屏障通透性及BBB标志物表达的氧糖剥夺/复氧(OGD/R)条件。然后在该类器官模型中研究了中药冠心宁注射液(GXNI)对OGD/R诱导的BBB功能障碍的保护作用。结果表明, OGD/R降低BBB类器官细胞活力,增加屏障通透性(渗漏),降低紧密连接蛋白闭塞带-1 (ZO-1)、claudin-5、闭塞素和P-糖蛋白(P-gp)的水平。GXNI可显著阻止OGD/R诱导的BBB破坏,如细胞活力降低和通透性增加。本研究为中枢神经系统靶向药物的研发提供了一种新的人类细胞源性3D缺血性脑病模型,并证明了中药GXNI在体外可有效保护BBB功能障碍。     

NO介导的代谢紊乱影响小鼠气道祖细胞增殖的机制研究

目的 研究一氧化氮(NO)对小鼠气道club祖细胞增殖功能的调控及可能代谢机制。方法 使用流式分选技术分选小鼠气道原代club祖细胞，经25μmol/L的NO供体二乙胺壬酸酯(DEA NONOate)处理后进行转录组测序；分选小鼠气道原代club祖细胞，使用肺脏类器官技术体外培养原代club祖细胞，分别加入正常培养基，40 nmol/L辛伐他汀(Hmgcr抑制剂)，0.2μmol/L 6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸(DON,Gmps抑制剂)，1 mmol/L氨基羟乙酸酯(AOA,Gpt2抑制剂)培养基，在培养第8天时使用倒置显微镜拍照，观察原代club祖细胞衍生类器官生长情况，并统计类器官直径和形成效率。结果 DEA NONOate处理原代club祖细胞转录组表达显著变化(上调倍数超过1.2倍的基因2 894个，下调16.7%以上的基因3 270个)，其中代谢相关基因Hmgcr、Gmps和Gpt2的表达量显著下降(P<0.01)。与对照组相比，辛伐他汀组原代club祖细胞形成的类器官直径减小(P<0.01)，类器官形成效率没有变化；DON组类器官直径减小(P<0.0...     

新生小鼠小脑提取液对成年小鼠神经干细胞分裂与增殖的影响

目的:探讨新生小鼠小脑提取液(ECNM)对成年小鼠脑内神经干细胞分裂与增殖的影响.方法:采用脑立体定位给药技术,将ECNM注入前脑和海马,应用Nestin单抗做免疫组化染色,显示神经干细胞.结果:给予ECNM后7d和14d,在前脑和海马均可见密集的神经干细胞,对照组未见阳性染色.结论:ECNM可诱导成年小鼠神经干细胞分裂与增殖.     

胰岛素抵抗小鼠小肠类器官模型构建及黄诺玛苷对此模型肠黏膜屏障的保护作用

目的 构建胰岛素抵抗(IR)小鼠小肠类器官模型,研究两色金鸡菊黄酮类成分黄诺玛苷对肠黏膜屏障的保护作用。方法 (1)构建C57BL/6J和db/db小鼠小肠类器官模型,3D免疫荧光染色观察小肠类器官细胞核核抗原(Ki-67)、上皮细胞E钙黏蛋白(E-cad)、溶菌酶(Lyz)和黏蛋白2(MUC-2)表达,实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测纤连蛋白(Fn)、胰高血糖素样肽1(GLP-1)和肽YY(PYY)m RNA表达;Western印迹法检测Fn,GLP-1和PYY蛋白表达;ELISA检测Lyz分泌水平。(2)将构建的小鼠小肠类器官分为5组：以C57BL/6J小鼠小肠类器官为正常对照组,db/db小鼠小肠类器官为IR模型组,db/db小鼠小肠类器官用黄诺玛苷25,50和100μmol·L^-1处理48 h为IR模型+黄诺玛苷组,RT-q PCR检测各组类器官Lyz m RNA表达,Western印迹法检测Lyz蛋白表达。结果 (1) C57BL/6J和db/db小鼠小肠类器官培养第6天形成管腔结构清晰的环状结构,IR小鼠小肠类器官模型建立成功。3D免疫荧光检...