基于下一代测序的污水中人星状病毒分子流行病学研究

目的 了解生活污水中人星状病毒（HAstV）的型别分布及遗传多样性。方法 2018年1月—2019年6月在山东省济宁市按季度采集6份生活污水样本，通过阴离子膜吸附洗脱法进行浓缩后，提取核酸，进行ORF2完整编码区的RT-PCR扩增及扩增产物下一代测序，对产生的干净数据使用CLC Genomics Workbench 12.0软件de novo组装后，进行基因定型、同源性比较和系统发生学分析。结果 检测地区生活污水中HAstV的检出率为100%，共获得HAstV序列43条，分属9种基因型，分别为HAstV-1、HAstV-2、HAstV-3、HAstV-4、HAstV-5等经典型和MLB1、VA1、VA2、VA3等新型HAstV，其中HAstV-5(47.53%)占比最高；基于ORF2完整编码区的系统发生学显示山东株与国内外其他参考株在一些分支上聚集在一起，表明不同型别在世界不同地区的传播。结论 本研究证实了基于NGS的环境监测有助于提高对HAstV遗传多样性的认识。     

哈尔滨市腹泻患者星状病毒感染的分子流行病学研究

目的 了解黑龙江省哈尔滨市腹泻患者人星状病毒(HAstV)感染情况,并分析其分子流行病学特征。方法 2017年1月-2018年12月共采集340份哨点医院腹泻病人的粪便标本,采用Real-time PCR进行HAstV检测,对HAstV阳性标本采用RT-PCR方法扩增ORF2区,对PCR产物测序并进行系统进化分析。结果 HAstV阳性检出率为6.18％(21/340),男性阳性检出率为8.52%(15/176),女性阳性检出率为3.66%(6/164),差异无统计学意义(χ2=3.466,P=0.063)。HAstV感染阳性的患者年龄主要集中在2岁以下年龄组及3~5岁年龄组,检出率分别为10.71%(18/168)、10.53%(2/19);季节高峰在2月,检出率为18.18％(2/11)。对阳性标本进行测序,获得16株序列,系统进化分析结果显示,11株HAstV-1,且均为1a型;4株HAstV-5型;1株HAstV-4c型。结论 HAstV是哈尔滨市病毒性腹泻的重要病原之一,且存在多种基因型,HAstV-1型是主要流行株。HAstV-1a型及HAstV-4c型是在黑龙江省哈尔滨市首次发现及报道的型别。     

杭州市首例新型冠状病毒肺炎病例病毒全基因组序列测定及分析

目的 分析杭州市首例感染新型冠状病毒(2019-nCoV)病例病毒全基因组序列特征。方法 采集杭州市首例新型冠状病毒肺炎病例咽拭子和深咳痰液呼吸道标本,对标本进行病毒核酸提取和实时逆转录PCR检测,对病毒进行高通量基因组测序;从美国国立生物技术信息中心GenBank数据库中获取29条(分别来自武汉、深圳、日本、美国、澳大利亚和芬兰)2019-nCoV基因组序列和其他物种来源的30条β冠状病毒基因组进行系统发育分析。对15株武汉地区毒株基因组以突变位点进行分组,鉴定其他地区相同和特异性突变位点。结果 获得29 833 bp长度的杭州首例感染2019-nCoV病例病毒的基因组序列,覆盖病毒编码区全长。系统发育分析表明,该病毒与云南蝙蝠中分离到的严重急性呼吸综合征样冠状病毒RaTG13株最为接近,相似性为96.11%;相较其他基因,E基因间相似性最高(99.56%),而编码病毒表面刺突蛋白的S基因间相似性最低(92.87%)。与来自武汉、深圳、日本、美国、澳大利亚和芬兰的29株2019-nCoV基因组序列进行比对,相似性均大于99.9%,但在一些毒株中也发现了一些单位点核苷酸多态性。结论 杭...     

2006 - 2015年江西省风疹病毒野毒株基因特性研究

目的 研究江西省近10年风疹病毒野毒株的基因特性,为江西省的风疹防控提供技术支撑。方法 采集江西省2006 - 2015年风疹疑似病例咽拭子标本,用Vero/SLAM细胞对标本进行病毒分离培养,再对细胞分离物进行核酸的提取,采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）对细胞分离物进行风疹病毒核酸鉴定,采用RT-PCR对风疹病毒核酸检测阳性标本扩增病毒糖蛋白E1基因,对其核苷酸序列进行测定,运用生物学软件对测定序列进行处理分析。结果 江西省2006 - 2015年风疹病毒野毒株分属于2个基因型:1E基因型（14株）和2B基因型（20株）,1E基因型为江西省2005 - 2013年风疹病毒流行唯一基因型,并在2015年被2B基因型替代。1E和2B基因型各毒株之间E1基因核苷酸同源性分别为97.6%～99.9%和99.2%～99.9%,与疫苗株BRDII株核苷酸同源性分别为89.4%～89.9%和92.6%-93.0%,氨基酸同源性为98.8%～99.6%;氨基酸序列相对保守,未发现重要抗原位点的改变。结论 1E基因型和2B基因型为江西省2006 - 2015年风疹病毒流行的基因型,2B基因型为2015年首次在江西省发现,并为当年的绝对优势基因型。     

狂犬病病毒浙江街毒株糖蛋白基因序列分析

目的 测定狂犬病病毒浙江株(鼬獾源和犬源)糖蛋白(GP)基因组全序列,从分子水平比较狂犬病病毒浙江株与其他地区代表性街毒株和疫苗株GP之间的差异.方法 乳鼠接种分离狂犬病病毒,RT-PCR反应测定狂犬病病毒浙江株GP基因核苷酸序列,并进行序列和编码蛋白的比较分析.结果测序获得浙江5株鼬獾源狂犬病病毒和9株犬源狂犬病病毒GP基因序列,全长1575个核苷酸,编码524个氨基酸.浙江病毒株与其他地区街毒株、疫苗株核苷酸和氨基酸序列相似性在82.3%～99.9%和85.1%～99.8%之间,种系分析显示浙汀株均为基因1型,GP编码蛋白无重组,主要抗原位点未出现较大的变异.结论 对GP基因一级结构综合分析表明,在某些区域存在优势抗原表位的可能性较大,可能出现潜在的蛋白质抗原决定簇,浙江株GP基因变异较小,与国内其他地区流行的代表性街毒株相似,但高于其他疫苗株,在基因结构及种系进化关系上存在一定的距离.     

柯萨奇病毒A16型YY157病毒株的遗传特征分析

目的了解柯萨奇病毒A16型YY157病毒株的基因特征和繁殖特性, 探讨其用于疫苗开发的可能性。方法利用RT-PCR方法扩增YY157病毒株全基因组, 对PCR产物进行序列测定并拼接为全长序列。利用Lasergene及MEGA软件对所获序列进行同源性比较和进化树分析。结果 YY157病毒株与国内其他流行株在核苷酸水平的同源性介于75.0%～98.8%, 氨基酸水平的同源性介于87.8%～99.2%。结论柯萨奇病毒A16型YY157病毒株与其他国内流行株高度同源, 主要抗原位点保持一致, 可用于疫苗开发研究。     

广西首次在门诊成人腹泻病例中发现星状病毒感染

目的 研究广两地区门诊成人腹泻病例中星状病毒的感染状况和型别分布.方法 2007年2月至2008年3月期间,收集广西南宁市某医院门诊成人腹泻患者粪便标本346份,应用RT一半巢式PCR检测星状病毒,对阳性标本进行测序验证和型别鉴定.结果 在检测的346份粪便标本中,RT-PCR检出6份阳性,经测序证实均为星状病毒,检出率为1.73%(6/346).病例全部集中在冬春季;发病年龄以17～29岁为主.6株毒株中有4株为HAstV-4型,占66.7%,另2株为HAstV-1型,占33.3%.结论 首次证实广西地区成人腹泻病例中存在星状病毒感染,流行型别主要是HAstV-4和HAstV-1型.     

不同来源产气荚膜梭菌β2毒素编码基因的PCR检测方法建立及遗传多态性分析

目的建立并优化产气荚膜梭菌β2毒素编码基因(cpb2)和非典型cpb2(aty-cpb2)的PCR检测方法, 分析2016-2021年中国9个地区cpb2流行特征和遗传多态性。方法使用PCR方法对188株产气荚膜梭菌菌株的cpb2进行检测, 通过全基因组测序获取cpb2序列以分析其遗传多态性, 使用Mega 11、Makeblastdb软件对110株产气荚膜梭菌所携带的cpb2构建系统发育树并建库, 通过Blastn算法比对后得出cpb2两种不同基因型, 即共有cpb2(con-cpb2)和aty-cpb2之间的序列相似性。结果针对产气荚膜梭菌cpb2和aty-cpb2建立及改进的PCR检测方法的特异性好。cpb2的PCR检测结果与全基因组测序结果高度一致(Kappa=0.946, P<0.001)。来自中国9个地区的菌株中共有107株菌携带cpb2, 94株A型菌株携带aty-cpb2, 6株A型菌株携带con-cpb2, 7株F型菌株携带aty-cpb2。两种不同基因型的cpb2核苷酸序列相似性为68.97%～70.97%, 相同基因型的cpb2核苷酸序列相似性为98.00%...     

肠道病毒71型宁波分离株全基因组特征研究

目的:研究2010年肠道病毒71型宁波分离株的全基因组序列特征。方法:收集宁波市手足口病患者的粪便标本进行特异性荧光定量RT-PCR鉴定,EV71阳性标本进行病毒分离和全基因组序列的测定。结果:2010NB65株全长7406 bp,与参考株EV71相比编码区没有核苷酸的缺失和插入。2010NB65株与2008年-2010年中国大陆EV71流行株的各区段核苷酸和氨基酸同源性均较高,分别为94.1%～98.8%和97.6%～100%;与A型和CoxA16核苷酸同源性较低,分别为75.0%～82.4%和63.0%～85.4%。VP1和全基因组亲缘进化分析表明,2010NB65株属于C4基因亚型的C4a进化分支,与浙江株、阜阳株、北京株亲缘关系近。2010NB65株P2、P3区与CoxA16的进化途径相近。结论:宁波市HFMD患者粪便中分离得到EV71属于C4基因亚型的C4a进化分支,与我国其他地区的EV71存在共同进化趋势,全基因组序列提供了完整的分子生物学背景,为EV71病毒性疾病的防控提供参考价值。     

江西省1株汉滩型汉坦病毒的分离与鉴定

目的 了解江西省啮齿动物携带的肾综合征出血热汉坦病毒的基因型别。方法 采用Vero-E6细胞对8份免疫荧光汉坦病毒抗原阳性鼠肺标本进行病毒分离,采用直接免疫荧光法和RT-PCR方法对培养物进行鉴定,对分离株部分M基因进行序列测定和分析。结果 1份标本培养后经直接免疫荧光试验检测到汉坦病毒特异性免疫荧光颗粒,培养物能在Vero-E6细胞中稳定传代,毒株命名为AYW89-15。毒株核酸经汉坦病毒M基因特异性分型引物进行RT-PCR检测,获得汉滩型汉坦病毒(Hantaan virus, HTNV)预期大小的目的片段;通过序列分析发现,分离株与HTNV参考株核苷酸同源性为83.1%～94.7%,氨基酸同源性为95.0%～99.0%,与汉城型等其他型别汉坦病毒核苷酸和氨基酸同源性均低于75%。进化树分析表明AYW89-15位于HTNV所在的枝系。 结论 新分离株AYW89-15为HTNV。     

江苏省发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒的核酸检测及全基因组序列分析

目的 对江苏省2010年发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)进行核酸检测并分析其全基因组序列.方法 用荧光定量PCR的方法对江苏省2010年SFTSV感染病例进行核酸检测,将所有阳性标本进行病毒分离,取8株代表性毒株测定其全基因组序列,序列结果用DNA Star和MEGA4软件进行分析.结果 33例发热伴血小板减少综合征疑似病例中,20例SFTSV核酸检测阳性.1例狗标本SFTSV检测也为阳性.8株SFTSV毒株全基因组序列与国内其他地区流行株的序列高度同源,其中M片段核苷酸序列同源性介于95.8％～98.7％之间,氨基酸序列同源性介于98.7％～99.7％之间;而与汉坦病毒属和白蛉热病毒属的相关序列相比差异较大,M段核苷酸序列同源性最高仅为27.1％,氨基酸序列同源性最高仅为7.3％.与一代病例密切接触后发病的二代病例序列与一代病例序列完全一致;狗携带的SFTSV序列与病人序列高度同源.结论 SFTSV江苏株与国内参考株序列无明显差异,与布尼亚病毒科的其他属序列差异巨大;SFTSV存在人传人的可能性;狗可能是SFTSV的传播宿主之一.     

2013年海盐县诺如病毒流行株的监测和基因型分析

目的了解2013年海盐县诺如病毒流行株基因型谱分布。方法 2013年收集170例腹泻患者粪便标本,利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测诺如病毒核酸,挑选部分毒株进行核苷酸序列测定并构建系统进化树。结果检测170例腹泻患者粪便标本,诺如病毒阳性24份,检出率为14.12%;其中诺如病毒GⅠ基因组1份,占4.17%,序列测定为GⅠ.2基因型;GⅡ基因组23份,占95.83%,选4株进行序列测定,比对结果 1株属于GⅡ.4基因型2006b变异株,3株属于GⅡ.4基因型Sydney变异株。结论 2013年海盐县诺如病毒流行株基因型呈现多样性,以GⅡ.4 Sydney变异株为优势流行株,首次检出GⅠ基因组。     

云南省中缅边境2015年一起登革热暴发的分子特征分析

目的 对2015年云南省中缅边境一起登革热暴发查明病因,对流行的登革病毒(DENV)进行分子特征分析,为疾病防控提供病原学证据。方法 采用半巢式RT-PCR方法检测2015年7月云南省耿马县孟定镇DENV NS1抗原阳性血清中的DENV特异核酸(CprM基因),对阳性标本用DENV E基因特异引物进行扩增,并将PCR产物送测序,经拼接剪切后的序列在NCBI网站进行BLAST比对,在Megalign中计算核苷酸相似性;在GenBank中选出不同国家和地区不同年度的DENV E基因序列作为参考序列,在Mega 5.05 软件中采用邻接(NJ)法构建系统进化树。结果 对25份中国云南省耿马县孟定镇本地病例和14份缅甸输入病例DENV NS1抗原阳性的血清标本进行DENV特异核酸检测,共有21份本地和10份缅甸输入病例标本为DENV-1阳性,其余8份为DENV阴性。测序得到13株(8株来源于本地病例,5株来源于输入病例)1 485 bp的E基因序列,核苷酸相似性为100%,12株(9株来源于本地病例和3株来源于输入病例)406 bp的CprM基因序列,核苷酸相似性为100%。系统进化分析显示,13株E基因序列均属于DENV-1的基因Ⅰ型,位于独立的进化分支。结论 本次登革热暴发由DENV-1的基因Ⅰ型引起,该病毒与相邻缅甸区域流行的DENV进化关系最近,当地需加强对登革热防控的综合措施,以防止登革热疫情的进一步扩散。     

浙江省野生动物鼬獾狂犬病毒全基因组序列测定分析

目的 测定浙江省分离的2株野生动物鼬獾狂犬病毒株全基因组序列,从分子水平进行遗传变异特征分析,了解狂犬病毒在浙江省的流行和变异情况.方法 RT-PCR测定鼬獾狂犬病毒株全基因组核苷酸序列,并进行基因序列和编码蛋白相似性比较及种系发生分析.结果 测序获得2株鼬獾狂犬病毒全基因组核苷酸序列信息:基因组全长11 923 nts,leader长58 nts,由5个编码区组成:NP(1353 nts)、PP(894 nts)、MP(609 nts)、GP(1575 nts)、LP(6386 nts),N-P-M-G间隔序列长2、5、5 nts;G-L基因间伪基因ψ长423 nts;trailer长70 nts.核酸BLAST及多序列比对显示,浙江省鼬獾狂犬病毒株全基因组序列的组成和结构符合弹状病毒科狂犬病毒属特征;鼬獾病毒株负链RNA基因组5个基因编码氨基酸的长度没有变异,编码区基因没有发生重组,编码蛋白仅表现较少的序列变化,多数只发生碱基的替代;中国病毒株之间特别是同种动物狂犬病毒之间各个基因区域核苷酸与氨基酸序列相似性最高,鼬獾狂犬病毒基因组序列相似性在氨基酸水平明显高于核苷酸水平,蛋白质编码基因的核苷酸变异大多属于同义突变.结论 鼬獾狂犬病毒与研究中选择的代表性疫苗株或者街毒株的变异位点和变异类型相似,多序列相似性比较和N基因种系发生分析显示,鼬獾狂犬病毒均属于基因1型,具有中国地域性特点,2株野生动物鼬獾狂犬病毒极有可能是存在于自然界中固有的街毒株.     

柯萨奇病毒A24型变异株VP1基因变异分析

目的:从分子水平探讨2002年-2008年柯萨奇病毒A24型变异株(Coxsackie virus type A24 vari-ant,CoxA 24v)VP1基因变异情况。方法:在GenBank基因库上下载26株2002年-2008年引起AHC的CoxA 24v病毒株VP1基因核苷酸和氨基酸全序列,分析各株之间核苷酸和氨基酸序列差异;并与CoxA24原型株Joseph株核苷酸和氨基酸序列进行比较。结果:各株之间VP1基因核苷酸全序列的同源性为94.3%～100%,氨基酸全序列的同源性为97.7%～100%;与Joseph株比较,核苷酸全序列的同源性为76.4%～77.9%,氨基酸全序列的同源性为90.5%～91.8%。结论:2002年-2008年CoxA 24v病毒株VP1基因在核苷酸水平上存在着一定的变异,在氨基酸层面上也存在变异,但变异幅度相对较小。     

2009-2012年安徽省人肠道病毒71型的分子流行病学特征

目的 探讨安徽省手足口病患儿中肠道病毒71型(human enterovirus 71,HEV71)的分子流行病学特征.方法 对2009-2012年HEV71所致手足口病患儿的19份咽拭子标本进行HEV71病毒VP1区全基因核苷酸序列测定,其中1份标本来自河南信阳患儿,其余均来自安徽省辖区患儿.所得序列与国内外HEV71毒株的核苷酸序列做比对分析,构建进化树.结果 19株病毒核酸VP1区全基因均为891个核苷酸,编码297个氨基酸.所得序列与A、B、C基因型的核苷酸同源性分别为82.6％～83.6％、83.3％～85.5％、86.7％ ～ 98.9％;氨基酸同源性分别为96.0％ ～97.0％、96.0％ ～97.7％、97.0％ ～ 100.0％.结论 六安市2009-2012年HEV71流行株在种系进化上与我国大陆近几年分离的毒株具有较高的同源性(94.6％～98.9％),同属于C4a基因亚型,与中国大陆前几年分离株C4b基因亚型较近.     

猪链球菌2型浙江嘉兴株毒力基因序列分析

目的 猪链球菌2型(SS2)浙江嘉兴ZHX2008分离株毒力基因序列测定与分析.方法 提取菌株DNA,应用聚合酶链反应(PCR)扩增菌株Cps2J和EF基因全片段,克隆人质粒载体,纯化后测定序列,并与国内外其他分离株基因进行比较.结果 Cps2J、EF基因完整开放阅读框(ORF)分别为999,2 532 bp,各自编码333,843个氨基酸,ZJJX2008分离株Cps2J、EF基因与国内外SS2菌株核苷酸同源性分别为99.1%～100%和99.8% ～99.9%,氨基酸同源性分别为99.2%～99.7%和99.3%～99.5%;ZJJX2008分离株Cps2J基因与猪链球菌1型荷兰分离株6555核苷酸和氨基酸同源性只有66.7%和51.8%.结论 ZJJX2008分离株为猪链球菌2型菌株,Cps2J、EF基因与国内外其他SS2分离株比较序列非常保守,变异不大.     

2021年银川市4株人呼吸道合胞病毒全基因组基因特征

 目的 分析2021年银川市人呼吸道合胞病毒(HRSV)全基因组的基因特征。 方法 收集2021年银川市2所流感监测哨点医院的流感样标本共1 100份,选择发热并伴有严重呼吸道感染症状的标本共669份,通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法筛选出HRSV阳性标本,对其中符合测序要求的HRSV阳性标本进行全基因组测序。在GenBank数据库下载HRSV全球各基因型别代表株,使用MEGA7软件进行序列比对、亲缘关系进化树构建和遗传距离的计算分析,使用DNAStar软件中MegAlign分析HRSV测序株序列核苷酸(氨基酸)的同源性和氨基酸变异。 结果 669份全年龄段的鼻咽拭子标本,HRSV阳性标本60份,阳性率为8.97％。其中有4份HRSV阳性标本全基因组测序成功,亲缘关系进化树显示,2株HRSVA为ON1型,2株HRSVB为BA9型。2条HRSVA全长序列均与MN306029.1/USA/2019/ON1全长序列的核苷酸(氨基酸)同源性最高,2条HRSVB G蛋白基因序列均与MW160815.1/Australia/2017/BA9的G蛋白基因序列核苷酸(氨基酸)同源性最高。氨基酸变异分析结果表明,2条HRSVA在第113、131、178、257、258、266位均发生了突变,分别为T113I、V131D、N178G、E257K、H258Q、H266L,YinChuanRSVA-01在第134位发生K突变为R(K134R),2条HRSVB在第159位和第160位均出现氨基酸缺失,在G蛋白第二高变区的第254、270、276、290位均发生T突变为I(T254I、T270I、T276I、T290I)。 结论 2021年银川市HRSV出现了RSVA基因型和RSVB基因型的共同流行,以及多个氨基酸位点的变异。     

长春市双阳地区鼠类携带的汉坦病毒基因序列分析

目的研究长春市双阳区鼠类中汉坦病毒感染情况及其基因分型。方法收集2011年双阳地区捕获鼠类,取鼠肺组织,用间接免疫荧光检测,阳性标本进行汉坦病毒M片段扩增并测序,与其他毒株进行相似性比对及系统树分析。结果收集100份鼠肺,经IFA检测到1份阳性,阳性率为1%,对其进行逆转录巢式PCR扩增,结果为汉城（SEO）型HV,与代表株进行相似性比较发现,SY-4部分M基因片段序列与其他SEOV核苷酸相似性为95.4%～99.7%,氨基酸序列相似性为99%～100%。系统树显示,该序列属S3亚型。结论本次获得HV是SEO型,亚型为S3亚型。