宫颈癌细胞系SiHa中HPV16E6,E7蛋白的表达

我们应用免疫荧光染色结合激光扫描共聚焦显微镜(ｌａｓｅｒｓｃａｎｎｉｎｇｃｏｎｆｏｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ,ＬＳＣＭ),观察了宫颈癌细胞系ＳｉＨａ中ＨＰＶ１６型(ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｔｙｐｅ１６)Ｅ６,Ｅ７基因区产物Ｅ６,Ｅ７蛋白的表达。１材料与方法１．１材料含ＨＰＶ基因的宫颈癌细胞系ＳｉＨａ,由西安医科大学分子生物研究中心李旭教授提供。用含１００ｍＬ／Ｌ胎牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养基(Ｇｉｂｃｏ公司)常规培养后,滴于盖玻片培养,制成单层细胞爬片。１．２方法免疫荧光染色用正常羊血清封闭…     

宫颈癌细胞HPV16 E6,E7蛋白表达的初步研究

ＳｉＨａ细胞为含有ＨＰＶ16(ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｔｙｐｅ16)的人宫颈癌细胞株,是研究ＨＰＶ16对宫颈癌细胞诱导分化作用的理想模型。流式细胞术(ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｅｒ,ＦＣＭ)是近年发展起来的一种对单细胞进行快速定量分析的新技术,检测速度?..     

中国妇女宫颈癌中HPV16E6基因序列分析及分子克隆

人乳头瘤病毒16型（Humanpapillomavirustype16,HPV16）感染与宫颈癌的发生有密切关系。研究发现,HPVI6早期蛋白E6是肿瘤相关抗原,可在HI,V相关肿瘤中持续表达,为肿瘤治疗性疫苗的研制及免疫治疗提供了靶位。但也有文献报道,宫颈癌中HPVI6E6基因可有一定的变异性,...     

HPV16/18和HPV16E6/E7DNA在宫颈癌组织中的表达

目的检测HPV16/18和HPV16E6/E7 DNA在宫颈癌组织中的表达,探讨其在宫颈癌发病中的作用.方法应用PCR和琼脂糖凝胶电泳方法检测46例宫颈癌组织中HPV16/18和HPV16E6/E7DNA.结果 46例宫颈癌中56.5%(26/46)扩增HPV16/18 DNA,其中宫颈鳞癌25例,宫颈腺癌1例.正常对照组20例HPV16/18DNA均为阴性,与宫颈癌组相比差异有显著性(P<0.01).HPV16/18 DNA阳性拷贝对数值为4.32±2.45.HPV16E6,E7DNA分别有53.8%(14/26)、46.2%(12/26)扩增.结论 HPV16/18和HPV16E6/E7 DNA与宫颈癌的发生密切相关,是宫颈癌恶性转化的关键之一,预示着宫颈癌有较强的增殖能力和转移能力.     

HPV16 E7基因慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建HPV16 E7慢病毒表达载体。方法用RT-PCR方法从Caski细胞中扩增HPV16 E7基因的编码区序列,对扩增出目的片段酶切纯化后将目的片段交换连接入慢病毒表达质粒,酶切鉴定并测序正确后进行慢病毒包装和滴度测定。Western-blot验证3FLAG-E7融合蛋白在293 T细胞中的表达。结果成功获得HPV16 E7基因,成功将HPV16 E7克隆到慢病毒表达质粒中,且包装产生的慢病毒颗粒能成功表达3FLAG-E7融合蛋白。结论成功构建HVP16 E7和flag基因共表达的慢病毒表达载体,为进一步研究HPV16 E7基因的功能建立了高效稳定的转基因技术平台。     

花姜酮通过调节E6/E7蛋白表达和上皮间质转化抑制宫颈癌HeLa细胞

目的:宫颈癌是女性癌症死亡的第二大常见原因.研究表明花姜酮(ZER)对人类宫颈癌具有抑制作用.本文旨在研究ZER对宫颈癌抑制作用的机制.方法:Western blot检测E6/E7蛋白在宫颈癌细胞系HeLa、C4-1、SiHa和Caski以及正常细胞Ect1/E6E7中的表达;CCK-8检测ZER对HeLa细胞增殖的影...     

HPV16L1-E7重组腺病毒在SCID-Hu IC小鼠和HPV16阳性肿瘤联合嵌合小鼠中防治作用的研究

目的　建立SCID HuIC小鼠动物模型和HPV16阳性肿瘤联合嵌合模型 ,研究HPV16L1 E7重组腺病毒在SCID HuIC小鼠和肿瘤联合嵌合模型中的防治作用。方法　①实验组SCID小鼠移植人胎儿多组织 ,对照组注射RPMI 16 4 0培养液 ,8周末检测人IgG抗体 ,人CD4 5、CD3、CD19;②T1和C1组先注射HPV16L1 E7重组腺病毒 ,2周末强化 ,4周末接种CaSki细胞 ;T2和C2组先接种CaSki细胞 ,4周末注射HPV16L1 E7重组腺病毒 ,6周末强化。 8周末检测病毒特异性IgG抗体、人IFN γ及T淋巴细胞增殖 ,测定肿瘤的物理指标以及免疫组化实验。结果　①实验组人IgG抗体阳性率 90 .0 % (18/ 2 0 ) ,CD4 5为 (49.79± 39.18) % ;CD3为 (42 .2 7± 36 .37) % ;CD19为 (9.2 8±7.4 6 ) % ,对照组人IgG抗体、人CD4 5、CD3及CD19均为阴性 ;②T1和T2组病毒特异性IgG抗体均为阳性、人IFN γ的含量和T淋巴细胞增殖实验 ,病毒特异性蛋白刺激组均高于非刺激组 (P <0 .0 5 ) ,C1和C2组病毒特异性IgG抗体为阴性、人IFN γ的含量及T淋巴细胞增殖均为阴性 ;肿瘤形成率 :T1和T2组分别为 0和 70 .0 % (7/ 10 ) ,而C1和C2组均为 10 0 % ;肿瘤大小 :T2组在 4周末时为 (4.35 5±0 .387)mm3 ,8周末为 (10 2 8± 90 .96 )mm3 ,C2组在 4周末时为 (32 .75± 6 .717)mm3     

膜联蛋白A7低表达对人宫颈癌HeLa细胞系增殖与凋亡的影响

目的 探讨膜联蛋白A7表达减少是否对人宫颈癌HeLa细胞系的增殖和凋亡产生影响. 方法 采用Western blotting鉴定siRNA可否有效抑制膜联蛋白A7表达,然后用脂质体转染法将siRNA转染入HeLa细胞,将细胞分为siRNA干扰组、阴性对照组和空白对照组,分别在转染后48h进行刃天青实验以观察细胞增殖状况的改变;流式细胞术检测3组细胞凋亡情况. 结果 在转染膜联蛋白A7的siRNA后48h的HeLa细胞, 刃天青实验可见siRNA干扰组细胞增殖较阴性对照组和空白对照组显著降低(P<0.05);流式细胞术实验可见siRNA干扰组细胞凋亡显著增多(P<0.05). 结论 膜联蛋白A7的低表达可能影响HeLa细胞的增殖和凋亡.     

宫颈鳞癌和癌前病变中eIF-4E表达及其与HPV16/18感染的关系

目的探讨真核翻译启始因子eIF-4E在宫颈鳞癌和癌前病变中的表达规律及其与人乳头瘤病毒（HPV）感染之间的关系。方法采用免疫组化ABC法和原位杂交技术检测eIF-4E蛋白和HPV16／18DNA在10例正常宫颈鳞状上皮,29例低级别上皮内瘤变（CIN1级）,31例高级别上皮内瘤变（CIN2、3级）和31例宫颈鳞癌中的表达。结果eIF4E在正常宫颈鳞状上皮中呈阴性表达,随着上皮病变级别升高,表达逐渐增强：低级别〈高级别上皮内瘤变〈宫颈鳞癌（P〈0．05）,且在宫颈鳞癌中表达更强;HPV16／18DNA在四组中的阳性表达率,除高级别上皮内瘤变和宫颈鳞癌两组之间没有差别（均为96．8％）以外,其余各组之间差异均有显著性（P〈0．01）;在低级别、高级别上皮内瘤变和宫颈鳞癌三组中eIF-4E蛋白表达和HPV感染均呈明显正相关（P〈0．01）。结论宫颈鳞癌的发生与eIF-4E蛋白表达及HPV16／18感染密切相关;二者在宫颈鳞癌的发病机制中可能起着协同作用。     

逆转录病毒载体介导HPV16 E6E7基因转化人胚食管纤维细胞的研究

目的 研究HPV16型病毒感染与食管癌发生的关系。方法 包装含有HPVl6E6E7基因重组逆转录病毒，以重组病毒感染人胚食管纤维细胞，在TPA协同下诱导SCID小鼠成瘤。结果 重组病毒感染人胚食管纤维细胞可以诱导SCID小鼠形成肉瘤，可以检测到E6E7基因的存在及表达，流式细胞仪检测从瘤组织培养出来的纤维细胞，确定为异倍体；但未能诱导人胚食管组织成瘤。结论 建立的重组逆转录病毒系统可以成功介导HPV16E6E7基因的转移，可以应用于HPV致瘤性研究。     

过表达TGF-β1可抑制人宫颈癌细胞系C-33A增殖和促进凋亡

目的研究TGF-β1基因转染对人宫颈癌细胞系(C-33A)增殖和凋亡的影响。方法取增殖状态良好的宫颈癌细胞C-33A,用基因转染的方法建立TGF-β1过表达质粒,用RT-PCR和Western blot法分别检测TGF-β1 mRNA和蛋白的表达及其Bcl-2和Bax的表达;用MTT实验、Transwell小室迁移实验和流式细胞术分别检测细胞的增殖率、迁移率及凋亡率。结果 TGF-β1 mRNA和蛋白在宫颈癌C-33A细胞中的表达低于其他细胞(P0. 05); TGF-β1抑制Bcl-2的表达(P0. 05)、促进Bax的表达(P0. 05);过表达TGF-β1细胞的增殖与迁移速度低于其他细胞(P0. 05),但凋亡速度高于其他细胞(P0. 05),且这种降低与升高均呈时间依赖性。结论过表达的TGF-β1可明显抑制宫颈癌细胞的增殖和促进凋亡。     

子宫颈癌、子宫颈上皮内病变组织中SIRT1、HPV 16/18E6的表达及其意义

目的检测子宫颈癌及癌前病变中SIRT1的表达情况,探讨其与临床病理特征的关系。同时检测早期癌蛋白中HPV16/18E6的表达,分析两者的相关性。方法应用免疫组化En Vision法检测30例子宫颈炎、100例子宫颈上皮内病变(高级别、低级别各50例)、30例子宫颈鳞状细胞癌组织中SIRT1和HPV 16/18E6的表达。结果子宫颈癌组织中SIRT1阳性率为93.33%(28/30),高于子宫颈炎组织(13.33%,4/30),差异有统计学意义(P0.05)。子宫颈高级别上皮内病变SIRT1阳性率(88%,44/50)高于低级别上皮内病变(14%,7/50),差异有统计学意义(P0.05)。但高级别上皮内病变与子宫颈癌SIRT1阳性率差异无统计学意义(P0.05);低级别上皮内病变与子宫颈炎中SIRT1阳性率差异无统计学意义(P0.05)。在子宫颈癌中,SIRT1的阳性率与临床分期和组织学分级有关,晚期、分化差的子宫颈癌阳性率高于早期、分化好的子宫颈癌,差异有统计学意义(P0.05)。在子宫颈癌中SIRT1的阳性率(93.33%,28/30)高于HPV 16/18E6(30%,9/30),在子宫颈高级别上皮内病变中SIRT1的阳性率(88%,44/50)高于HPV 16/18E6(28%,14/50),但在低级别上皮内病变中SIRT1的阳性率(14%,7/50)低于HPV 16/18E6(36%,18/50),两者差异有统计学意义(P0.05)。结论 SIRT1的阳性率随着病变程度增加而升高,提示SIRT1与细胞恶性转变有关,其过表达可能促进上皮向高级别内病变乃至子宫颈癌进展。     

修饰后中国山东地方株HPV16 E6E7基因的转化活性检测及免疫原性研究

目的 利用突变修饰后消除转化活性并保留抗原性的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型（HPV16）E6E7基因，研制HPV16 DNA疫苗。方法 定点突变E6的终止密码，并保证E7读码框架不定；定点突变E7蛋白的Rb结合区中对其转化活性维持起关键作用的第24位氨基酸。突变修饰后的基因命名为fmE6E7。PCR扩增fmE6E7，重组人pLNCX载体，脂质体法转染3T3细胞，免疫荧光组织化学及Western blot检测转染细胞蛋白的表达。经软琼脂集落培养法和BALB／c裸鼠皮下接种法检测fmE6E7的转化活性。然后PCR扩增fmE6E7，构建pVR1012-fmE6E7真核表达质粒，于C57BL／6小鼠肌肉内直接进行裸DNA免疫，^51Cr释放法体外分析免疫鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性，间接ELISA法检测免疫鼠血清中E7特异性抗体。结果 测序证实获得了预期的突变结果。pLNCX-fmE6E7转染细胞体外软琼脂培养3周未见集落形成；裸鼠皮下接种2月后未见移植瘤形成（0／3）。免疫鼠获得了较好的E7特异性的抗体E和抗原特异性的CTL。结论 修饰后E6E7基因可融合表达，转化活性消除的同时还可诱发特异的细胞免疫和体液免疫，表明中国山东地方株的E6E7基因可作为HPV16治疗性DNA疫苗的靶基因。     

宫颈癌组织中circDENND4C的表达对宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的 探讨环状RNADENN/MADD域内含蛋白4C(circDENND4C)在宫颈癌组织中的表达及其对宫颈癌HeLa细胞增殖、迁移、侵袭的影响和机制。方法 收集41例宫颈癌患者的癌组织及其癌旁组织,实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测组织中circDENND4C和miR-4465表达。体外培养HeLa细胞,双荧光素酶报告基因实验验证circDENND4C和miR-4465的调控关系。HeLa细胞分为正常对照（NC）组、小干扰RNA阴性对照（si-NC）组、circDENND4C小干扰RNA(si-circDENND4C)组、模拟对照（miR-NC）组、miR-4465组、si-circDENND4C+抑制剂阴性序列（anti-miR-NC）组和si-circDENND4C+miR-4465抑制剂（anti-miR-4465）组,通过四噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖,Transwell检测细胞迁移和侵袭,Westernblot检测细胞中Ki-67、基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白表达。结果 宫颈癌组织中circDENND4C的表达显著高于癌旁组织...     

P16和FHIT基因联合高危HPV检测在宫颈癌诊断中的研究

目的探讨P16、脆性组氨酸三联体（FHIT）基因启动子异常甲基化及高危HPVDNA与宫颈病变恶性程度的相关性及三者联合检测的的临床意义。方法采用巢式甲基化特异性PCR方法检测26例宫颈癌及35例宫颈上皮内瘤变患者（CIN）P16、FHIT的甲基化状态，同时测定其高危HPVDNA并与43例无上皮内瘤变患者作对照，分析三者联合检测的临床诊断价值。结果宫颈癌患者P16、FHIT基因启动子异常甲基化及高危HPV阳性率分别为23．7％、65．4％、88．4％。CIN患者P16、FHIT基因启动子异常甲基化及高危HPV阳性率分别为5．7％、11．4％、42．8％。健康对照者标本中P16、FHIT基因无异常甲基化。高危HPV阳性率为13．9％。结论P16、FHIT基因启动子异常甲基化及高危HPV与宫颈病变恶性程度相关，联合检测P16、FHIT启动子异常甲基化及高危HPV可提高宫颈癌诊断的敏感性和特异性，对于宫颈癌的早期诊断具有重要意义。     

宫颈癌组织中survivin和CD44v6的表达及其与HPV16/18感染的相关性

目的研究survivin、CD44v6在宫颈癌组织中的表达及其与HPV16/18感染的相关性,以探讨宫颈癌的发生机制。方法用免疫组化方法进行survivin和CD44v6的检测,用PCR检测HPV16/18感染情况。结果survivin和CD44v6的阳性率在宫颈癌组织中远高于CIN和正常宫颈组织,差异显著(均P<0.01),其表达率与淋巴结转移有关(均P<0.05)。CD44v6随着临床分期、病例分级的升高阳性率升高(P<0.05),survivin的阳性率则随着病例分级的升高而增加(P<0.05)。HPV16/18在正常宫颈组织、CIN和宫颈癌中的阳性率逐渐升高(P<0.01),但与临床分期、病理分级、淋巴转移无关。survivin与HPV16/18感染有相关性(P<0.05)。结论宫颈癌组织中survivin的异常表达与HPV16/18感染有关。survivin和CD44v6与宫颈癌的恶变程度有关,可作为宫颈癌筛查预后判断的有利指标。     

CK7和CA125在人卵巢癌的表达及意义

目的研究细胞角蛋白7(CK7)和CA125联合在卵巢恶性肿瘤中的诊断意义及价值。方法采用免疫组化方法,分别检测100例卵巢肿瘤中CK7和CA125的表达,统计学方法比较两种指标在良性、恶性及转移性肿瘤中的阳性表达率。结果 CK7和CA125在卵巢恶性肿瘤中的表达水平均高于转移源性的卵巢癌和卵巢良性瘤,差异均有统计学意义(0.05)。且在晚期癌中的表达高于早期,差异均有意义(0.05)。结论CK7和CA125过表达提示二者可能参与卵巢癌的发病机制。     

子宫颈癌中c-myc和hMLH1表达与HPV16感染的关系

目的探讨子宫颈病变中c-myc与hMLH1和HPV16表达的关系。方法应用免疫组化SP法检测c-myc与hM-LH1在慢性子宫颈炎、子宫颈上皮内瘤变(cervical intraepi-thelial neoplasia,CIN)和子宫颈癌患者中的表达水平;PCR技术检测相应标本中HPV16感染的情况。结果 c-myc在慢性子宫颈炎、CIN、子宫颈癌中的阳性率分别为26.7%(8/30))、50%(30/60)、69.2%(36/52),差异有统计学意义(P<0.05),hMLH1阳性率依次为66.7%(20/30)、56.7%(34/60)、30.7%(16/52),差异有统计学意义(P<0.05)。在子宫颈癌组织中,c-myc蛋白与肿瘤分化程度、临床分期以及有无淋巴结转移相关;hMLH1蛋白表达下调与子宫颈癌分化程度及是否有淋巴结转移密切相关,表达差异均有统计学意义(P<0.05);HPV16与c-myc蛋白表达呈正相关;与hM-LH1蛋白表达呈负相关。结论 HPV16可能是通过影响c-myc与hMLH1蛋白表达而在子宫颈癌的发生、发展中发挥作用。