动物源性骨软骨支架复合骨髓间充质干细胞/软骨细胞修复兔膝关节骨软骨复合缺损

摘要 背景：以往支架材料修复骨软骨的实验大都存在骨软骨耦合界面修复不良的情况。 目的：观察骨髓间充质干细胞/软骨细胞复合动物源性骨软骨支架修复兔膝关节骨软骨复合缺损的可行性。 方法：将新西兰大白兔随机抽签分为实验组、对照组、空白组,制作单侧膝关节骨软骨复合缺损后,实验组于骨缺损处植入自体骨髓间充质干细胞/诱导分化的软骨细胞与同种异体动物源性骨软骨复合支架,对照组于骨缺损处植入同种异体动物源性骨软骨支架、空白组未植入任何材料。术后4,8,12周行大体观察、苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色。 结果与结论：实验组大体观察见复合缺损区完全修复,局部无凹陷,新生组织和周围组织融合,苏木精-伊红染色和甲苯胺蓝染色见软骨缺损区由新生的透明软骨样组织修复,细胞柱状排列,极性好,软骨陷窝明显,骨缺损区由骨样组织修复,新生软骨和软骨下骨以及宿主骨界面耦合良好,甲苯胺蓝染色阳性率和组织学评分优于对照组、空白组(P < 0.05)。说明诱导分化的自体软骨细胞和骨髓间充质干细胞共培养复合动物源性骨软骨支架所构建的细胞-支架复合体能成功修复兔膝关节软骨和软骨下骨的复合缺损,是一种理想的骨软骨复合缺损修复方法。 关键词：动物源性;支架;骨髓间充质干细胞;软骨细胞;修复;缺损 中国组织工程研究与临床康复, 2011,15 (12): 2265-2269.     

藻酸钙凝胶复合骨髓间充质干细胞修复大鼠颅骨极量缺损****☆◆

背景：课题组前期已经发现藻酸盐凝胶/骨髓间充质干细胞复合物能在体内形成软骨，并能稳定分泌Ⅱ型胶原。 目的：在前期工作的基础上，观察藻酸钙凝胶/骨髓间充质干细胞复合物修复大鼠颅骨极量缺损的效果。 设计、时间及地点：配对对照观察实验，2004-01/2008-02在四川大学口腔疾病研究国家重点实验室完成。 材料：将1.2%藻酸钠与骨髓间充质干细胞混匀后滴入氯化钙溶液，制备藻酸钙凝胶/骨髓间充质干细胞复合体。 方法：SD大鼠24只，在其颅骨两侧各做一直径5 mm的极量全层骨缺损，随机植入藻酸钙凝胶/骨髓间充质干细胞复合体（实验侧）及无细胞的藻酸钙凝胶（对照侧）。在术后4周和8周分别处死12只动物，取缺损植入处进行检测。 主要观察指标：X射线检测成骨情况，苏木精-伊红染色及改良Masson三色染色观察组织学变化，透射电镜观察超微结构，同时进行Ⅰ型 和 Ⅲ型胶原免疫组织化学检测。 结果：24只SD大鼠均进入结果分析。X射线检测发现，与对照侧相比，实验侧缺损的边缘有明显钙化密度增高表现。组织学、免疫组织化学检测均显示藻酸钙凝胶/骨髓间充质干细胞复合物中形成的组织呈现出交织状骨组织学特征，新骨量多而且结构酷似成熟骨。 结论：藻酸钙凝胶/骨髓间充质干细胞复合物能用于修复颅骨极量骨缺损。     

藻酸钙/骨髓基质成骨细胞复合物修复兔颅骨缺损实验研究

目的：在兔颅骨缺损中区植入组织工程骨，观察其成骨和对骨缺损的修复作用。方法：取兔髂骨，获取骨髓基质干细胞，体外扩增培养，将获得的骨髓基质成骨细胞与藻酸盐复合，制备成盘状组织工程骨，植入兔颅骨缺损区，单纯藻酸盐植入作为对照组，8周后行X线和组织学检查，观察其成骨和对骨缺损的修复作用。结果：骨髓基质成骨细胞/藻酸钙复合物植入组，有明显的新骨形成，而对照组无骨形成。结论：藻酸钙/骨髓基质成骨细胞复合物可用于修复非受力区、范围较小的骨质缺损。     

藻酸钙凝珠复合自体软骨细胞修复成年兔关节软骨缺损*☆

摘要 背景：软骨缺损的修复一直是骨科界的难题之一，近几年发展起来的应用组织工程学技术修复软骨缺损的方法，逐渐被认为是一种有希望治疗关节软骨缺损的手段。 目的：应用藻酸钙凝珠-自体软骨细胞移植修复兔膝关节软骨缺损，观察损伤近期修复情况。 方法：成年新西兰大白兔30只，左膝取软骨细胞，右膝造模。采用体外培养后的第3代自体软骨细胞复合海藻酸钠凝胶，混入CaCl2溶液中制成串珠状凝珠，体外培养4周。实验组植入海藻酸钙凝珠-自体软骨细胞复合物，对照组植入不含细胞的海藻酸钙凝珠，空白组不做任何处理。 结果与结论：纳入新西兰大白兔30只，除其中1 只术后单侧膝关节僵硬强直外，其余均未见手术后关节活动障碍，所有动物术后无感染，无死亡。苏木精-伊红染色可见，实验组修复组织以透明软骨为主，对照组以纤维软骨修复为主，空白组修复不明显，以纤维软组织修复为主。免疫组织化学染色可见实验组修复组织以表达Ⅱ型胶原为主，对照组Ⅱ型胶原免疫组化着色较淡，Ⅱ型胶原表达量少。空白组修复组织不表达Ⅱ型胶原。结果提示藻酸钙凝珠-自体软骨细胞修复软骨缺损有较好效果，表明自体软骨细胞复合藻酸钙凝珠能为软骨组织工程提供一种很好的思路。 关键词：藻酸钙凝珠；软骨细胞；软骨组织工程；修复；生物材料 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.21.003     

纳米β-磷酸三钙/Ⅰ、Ⅱ型胶原层状支架复合骨髓间充质干细胞修复膝关节骨软骨缺损

摘要 背景：关节软骨损伤修复面临的难题主要表现在再生软骨的结构及生理功能距正常软骨相差较远，无法满足正常生理需要，目前修复方法很多，但效果均不理想。 目的：探讨纳米β-磷酸三钙/Ⅰ、Ⅱ型胶原层状支架-骨髓间充质干细胞复合物修复犬膝关节骨软骨缺损的可行性。 方法：12月龄杂种犬10只，随机分为实验组、缺损对照组，无菌条件下自髂后嵴处抽取骨髓分离培养骨髓间充质干细胞，传至第3代消化、收集，调整细胞浓度为2×109 L-1，与纳米β-磷酸三钙/Ⅰ、Ⅱ型胶原共培养24 h，即制成纳米β-磷酸三钙/Ⅰ、Ⅱ型胶原层状支架-骨髓间充质干细胞复合物。两组犬均制备右膝关节骨软骨缺损，实验组于缺损处植入支架-细胞复合物，缺损对照组不做任何处理。 结果与结论：第12周，实验组缺损内充填以白色半透明组织，表面光滑，触之较软，稍高出周围软骨面，软骨细胞分布较均一，排列无方向性；第24周，实验组缺损内充填白色半透明新生软骨组织，色泽与正常软骨相似，质韧，表面平整，与正常软骨界限消失，表面细胞平行于关节面，深层细胞排列紊乱，细胞呈团状，基质异染广泛，与周围正常软骨连接良好。缺损对照组缺损未修复，底部为白色纤维组织。提示骨髓间充质干细胞是修复关节软骨缺损较理想的种子细胞，在新生软骨形成的同时，纳米β-磷酸三钙/Ⅰ、Ⅱ型胶原层状支架逐渐降解吸收，是组织工程修复关节软骨缺损适宜的支架材料。 关键词：纳米；β-磷酸三钙；Ⅰ型胶原；Ⅱ型胶原；骨髓间充质干细胞；软骨细胞；组织工程 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.42.003     

独活寄生汤结合骨髓基质干细胞复合体修复兔膝关节软骨缺损☆

背景：实验表明,骨髓基质干细胞复合脱细胞真皮基质能修复家兔膝关节软骨缺损,中药独活寄生汤能促进软骨的修复,且提高修复质量。 目的：进一步验证独活寄生汤对骨髓基质干细胞复合体修复兔关节软骨缺损的影响,评价修复效果。 方法：取兔骨髓基质干细胞进行体外增殖后,复合于改建后的脱细胞真皮基质载体上,植入到兔膝关节软骨缺损,并以中药独活寄生汤灌胃为独活寄生汤+干细胞组,并设立独活寄生汤组、单纯复合体组、空白组为对照组。于4,8,12周后分别对修复组织进行形态学观察及组织学检查。 结果与结论：术后12周, 独活寄生汤+干细胞组的缺损由透明软骨样组织充填,软骨及软骨下骨组织基本修复,修复的软骨组织在组织形态学上优于其他各组。结果证实,骨髓基质干细胞复合体能修复家兔膝关节软骨缺损,中药独活寄生汤能促进软骨的修复,且提高修复质量。     

骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养种子细胞特征及体内成软骨活性

目的：组织工程技术为解决关节软骨缺损修复这一难题提供了新的思路，但至今尚无一种细胞能完全满足软骨组织工程对种子细胞的要求。探讨以自体骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养为种子细胞修复关节软骨缺损的可行性，并评价修复效果。 方法：实验于2005-03/2006-02在兰州大学骨科研究所组织工程实验室和连云港市东方医院骨科实验室完成。①取浓度为3×108 L-1的第2代骨髓间充质干细胞和软骨细胞，按2:1比例混匀共培养作为种子细胞，观察细胞的增殖和基质合成，绘制细胞生长曲线。②将细胞终浓度为3×108 L-1的共培养细胞加入含有同种异体脱钙骨基质的24孔培养板中进行接种培养2，4，6 d，计算共培养细胞与脱钙骨基质的黏附率。③取54只青紫兰兔制备全层关节软骨缺损模型，随机分为实验组、脱钙骨基质对照组、空白对照组，每组18只。实验组于软骨缺损处植入同种异体脱钙骨基质与共培养细胞；脱钙骨基质对照组植入脱钙骨基质；空白对照组不作任何植入。移植术后6，12周取出膝关节对修复组织进行大体、组织学评分和免疫组织化学观测。 结果：54只青紫兰兔均进入结果分析。①共培养的软骨细胞基质合成丰富，细胞增殖加快。脱钙骨基质与骨髓间充质干细胞和软骨细胞共培养第2，4，6天的黏附率分别为（46.50±1.40）%，（93.25±2.89）%和（88.34±0.76）%。②大体观察结果：实验组缺损修复组织呈软骨样，表面光滑平坦，与周围软骨整合的软骨细胞更为成熟，修复组织与软骨下骨结合牢固。脱钙骨基质对照组、空白对照组的修复组织呈纤维组织和无修复。③组织学评分：实验组优于脱钙骨基质对照组、空白对照组，差异具有显著性意义（P﹤0.01），脱钙骨基质对照组与空白对照组比较差异无显著性意义（P﹥0.05）。④免疫组织化学染色显示实验组修复组织的细胞为透明软骨样细胞，柱状排列，Ⅱ型胶原染色阳性，与周围软骨及软骨下骨整合良好。 结论：自体骨髓间充质干细胞与软骨细胞共培养作为种子细胞，骨髓间充质干细胞能增强软骨细胞的增殖，促进软骨细胞基质合成，缩短软骨细胞培养时间和减少传代次数，可节省大量的软骨细胞，与脱钙骨基质复合后能有效修复关节软骨缺损。     

40001/间充质干细胞修复兔关节软骨缺损的组织学研究

背景：大块软骨损伤目前临床上尚无方法治疗,干细胞技术出现后为解决这一难题提供了理论支持。采用新型的支架材料“壳聚糖-胶原蛋白”结合干细胞诱导分化移植给动物模型是一种较新的尝试。 目的：观察壳聚糖-胶原凝胶复合骨髓间充质干细胞修复兔关节软骨缺损的组织学变化。 方法：体外培养扩增兔骨髓间充质干细胞。采用软骨诱导分化培养基对P2代细胞进行成软骨诱导。同时制备“壳聚糖-胶原蛋白”支架和兔关节软骨缺损模型。缺损用含有骨髓间充质干细胞的壳聚糖-胶原凝胶填充,另一条关节用没有细胞的支架或不做处理。其中12个关节作为实验组(接受骨髓间充质干细胞+支架),8个关节作为空白对照组(不做处理),8个关节作为单纯支架组(未植入细胞)。造模后于2,4,8,16周进行组织学评分并处死动物行组织学染色。 结果与结论：造模后16周移植的细胞一致分化为软骨细胞,大部分软骨缺损区被新生软骨修复,组织学评分实验组关节修复良好。提示应用骨髓间充质干细胞结合“壳聚糖-胶原蛋白”复合物可以修复关节软骨缺损。 关键词：壳聚糖-胶原凝胶;兔;骨髓间充质干细胞;软骨缺损;组织学变化 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.25.006     

胰岛素样生长因子1基因转染骨髓基质干细胞治疗裸鼠骨缺损☆

背景：众多的研究已证实胰岛素样生长因子1在成骨细胞的增殖、分化、基质合成中发挥重要的调控作用，并参与调节骨改建及修复的一系列过程。 目的：观察人胰岛素样生长因子1基因修饰的骨髓基质干细胞对骨损伤修复的促进作用及能否构建出具有良好生物学活性的组织工程人工骨，提高骨缺损修复质量。 设计、时间及地点：对比观察，实验于2004-03/2005-05在苏州大学实验动物中心完成。 材料：体外将胰岛素样生长因子1基因通过反转录病毒转入骨组织工程种子细胞骨髓基质干细胞，并与具有良好生物学活性的脱钙骨基质材料复合。 方法：BalB/C裸鼠15只制备颅骨8 mm缺损模型，随机数字表法分为3组，每组5只。胰岛素样生长因子1转染细胞组和空载体细胞组将两种不同植入物脱钙骨基质/胰岛素样生长因子1转染细胞和脱钙骨基质/空载体细胞分别植入颅骨缺损部位，空白对照组仅造模，不进行任何干预。造模后4周处死动物，取出颅骨进行组织学观察。 主要观察指标：①反转录-聚合酶链反应检测转染细胞胰岛素样生长因子1 mRNA的表达。同时收集转染后细胞上清，用蛋白免疫印迹检测重组胰岛素样生长因子1的表达。②扫描电镜观察细胞/基质材料复合物共培养3，6 d后的生长情况。③颅骨缺损模型大体观察。④苏木精-伊红染色观察造模后4周各组颅骨缺损的修复情况。 结果：①经反转录-聚合酶链反应及蛋白免疫印迹检测，胰岛素样生长因子1 基因修饰的骨髓基质干细胞中有胰岛素样生长因子1 mRNA及蛋白的表达。②扫描电镜观察转染细胞与脱钙骨基质共培养3 d时胰岛素样生长因子1转染细胞组脱钙骨基质材料表面已有大量细胞黏附并向深部空隙长入；6 d时脱钙骨基质表面黏附的细胞处已分泌出大量胶原纤维；而空载体细胞组各时间点黏附细胞数和胶原纤维产生量则均较少。③造模后4周各组植入物周围均无明显炎症反应，胰岛素样生长因子1转染细胞组植入物与颅骨缺损结合紧密；而空载体细胞组植入物可推动；空白对照组骨缺损处无新骨形成。④苏木精-伊红染色可见胰岛素样生长因子1转染细胞组植入物与颅骨缺损结合紧密，骨折缺损区有新骨及血管形成；空载体细胞组骨缺损区新骨形成较少；空白对照组缺损未见修复。 结论：胰岛素样生长因子1转染的骨髓基质干细胞/脱钙骨基质复合物具有较好的骨缺损修复功能。     

复合成骨细胞藻酸盐凝胶的体内成骨效应**☆

目的：为使骨缺损的治疗简便可行，又要保证可靠的骨修复效果，实验将成骨细胞复合于藻酸钙水凝胶中，直接经皮注射动物体内了解其成骨情况。 方法：实验于2006-01/2007-07在十堰市太和医院生命科学研究所实验室完成。将培养的兔骨髓基质成骨细胞复合于1.5%藻酸钠溶液，再加入葡萄糖酸钙，制备成骨细胞密度为1×1010 L-1、钙离子浓度为50 mmol/L的藻酸钙水凝胶。将20只健康成年新西兰大白兔左侧背部经皮注射成骨细胞-藻酸钙水凝胶复合物(实验侧)，右侧注射单纯藻酸钙水凝胶(对照侧)。于术后4，8，12周分别行X射线检查及组织学观察成骨情况。 结果：20只健康成年新西兰大白兔均进入结果分析。X射线和组织学观察表明，实验侧成骨活跃，骨再生迅速，12周内，新生骨组织明显增多，且新生骨组织趋向成熟，X线片显示高密度影;而对照侧未见骨组织出现。 结论：复合成骨细胞的藻酸钙凝胶经皮注射植入在动物体内异位成骨可靠、确切。