黄芩苷体外诱导人脐血间充质干细胞向神经元样细胞的分化

目的:体外诱导脐血间充质干细胞定向分化为神经元包括抗氧化剂法及细胞因子法,如何选择一种既能够如细胞因子般可广泛保护神经,又具有较强抗氧化作用的诱导剂?通过广泛筛选,观察中药单体黄芩苷对人脐血间充质干细胞体外纯化、扩增及向神经元样细胞诱导分化的作用.方法:实验于2005-02/06在南昌大学第一附属医院神经内科实验室完成.①对象及药物:无内外科并发症和传染性疾病、无血液系统疾病、乙肝表面抗原阴性、非高危妊娠、年龄23～35岁的健康孕妇足月顺产儿的脐带血10份,由南昌大学第一附属医院产科提供,孕妇及其家属对治疗及实验均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.黄芩苷,分子量446,纯度 > 95%,由中南大学湘雅医学院药剂科提供.抗氧化添加剂β-巯基乙醇为SABC公司产品.②实验方法:无菌条件下采集胎儿脐带血,肝素抗凝,用明胶沉降 密度梯度离心两步法分离出脐血单个核细胞,经冷冻保存和复苏后,调整细胞浓度为1×109 L-1,以含20%胎牛血清、谷氨酰胺、B27、粒巨噬细胞集落刺激因子300 μg/L、干细胞因子300 μg/L的DMEM液体培养基进行纯化和扩增.按照抗氧化添加剂的不同分为4组:黄芩苷组加入黄芩苷100 μmol/L;空白对照组不添加抗氧化剂;β-巯基乙醇组添加β-巯基乙醇2 mmol/L;共培养组添加黄芩苷100 μmol/L、β-巯基乙醇2 mmol/L.连续培养4周.③实验评估:观察细胞形态学变化;采用流式细胞仪检测间充质干细胞表面标志;制作细胞爬片,采用免疫细胞化学染色评价神经细胞特异性烯醇化酶、神经微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达率.结果:①细胞形态学观察:脐血单个核细胞培养第2～3天开始贴壁生长,2周左右达高峰,3周后细胞生长达80%～90%融合,此时脐血原始间充质干细胞呈较均一的长梭形.4周后,黄芩苷组原来呈梭形的胞体一部分发生收缩,细胞边缘出现细的突起;一部分胞体逐渐近似圆形、锥形、三角形,伪足有多个细长突起,且发出分支,形成圆锥状终末端.β-巯基乙醇组、共培养组细胞虽然也有上述类似形态学的改变,但少量细胞存在脱落、死亡现象,且随着培养时间延长呈逐渐增加的趋势.②细胞表型检测:扩增培养4周后,空白对照组以CD45阳性细胞为主;其余3组均以CD29和CD83阳性细胞为主,其中共培养组最多,黄芩苷组次之,β-巯基乙醇组最少,组间两两比较差异有显著性意义(P < 0.01);各组贴壁生长细胞中均未见CD34 阳性细胞.③细胞扩增培养过程中黄芩苷的预诱导效果:扩增培养4周后与黄芩苷组比较,空白对照组、β-巯基乙醇组神经细胞特异性烯醇化酶及神经微管相关蛋白2阳性细胞表达率均显著降低(P < 0.01),共培养组无明显差异 (P > 0.05).各组胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达率均低于1%.结论:100 μmol/L黄芩苷可促进脐血间充质干细胞体外扩增,且随抗氧化作用时间的延长效果显著增强,同时在一定程度上还能够诱导其向神经元样细胞方向分化.     

人脐带间充质干细胞向胰岛样细胞的分化

目的:前期实验采用药物诱导的方法将人脐带间充质干细胞诱导分化为胰岛样细胞,将人脐带间充质干细胞与大鼠胰岛细胞共同培养及移植入糖尿病大鼠体内,观察其在胰岛细胞生长的微环境及在体环境中向胰岛样细胞分化的潜能.方法:实验于2006-10/2007-09在汕头大学医学院生殖遗传实验室完成,属于广东省科技厅重点实验室.[1]实验材料:SD大鼠由广州中医药大学实验动物中心提供.对动物处置符合动物伦理学标准.脐带取自汕大附二妇产科健康足月妊娠剖宫产的胎儿,产妇及家属对实验知情同意,并经医院伦理委员会批准.[2]实验方法:分离培养人脐带间充质干细胞,并采用酶消法分离大鼠胰岛细胞.将人脐带间充质干细胞与大鼠胰岛细胞以半透膜相隔共同培养,在共培养的第3,7,14天采用放射免疫法检测胰岛素水平,RT-PCR方法检测PDX-1基因的表达,以单独培养的脐带间充质干细胞为对照.经尾静脉将人脐带间充质干细胞移植入糖尿病模型大鼠体内,采用半定量RT-PCR方法检测人insulin基因表达.结果:[1]共培养条件下的人脐带间充质干细胞由长梭形逐渐变圆,并聚集成团.[2]放射免疫法结果表明,共培养组人脐带间充质干细胞随葡萄糖浓度的增高而分泌的胰岛素量也增加,与对照组相比差异显著(P<0.05).[3]未经共培养诱导的人脐带间充质干细胞不表达PDX-1,共培养3d的人脐带间充质干细胞表达PDX-1,共培养7d的人脐带间充质干细胞仍表达PDX-1,共培养14d的人脐带间充质干细胞未表达PDX-1.[4]未经移植人脐带间充质干细胞的大鼠胰腺不表达人insulin基因,而移植人脐带间充质干细胞的大鼠胰腺在第60天时能够检测出人insulin基因.结论:人脐带间充质干细胞具有在体内外的微环境中向胰岛样细胞分化的潜能.     

人脐带血间充质干细胞分离培养及向软骨细胞的分化

目的:关节软骨创伤难以自行修复,传统疗法因修复的组织以纤维软骨为主,缺少正常透明软骨的力学性能及耐用性.种子细胞是组织工程化软骨形成的首要条件,为此拟建立一套较为简便、有效和实用的脐血间充质干细胞体外分离培养体系,探讨其向软骨细胞分化的可行性.方法:实验于2005-07/2006-09在右江民族医学院组织学与胚胎学教研室完成.①细胞来源:无妊娠并发症足月分娩后的胎盘脐静脉血,均征得供者同意,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:穿刺抽取15 mL脐带血,密度梯度法分离吸取分层界面的白色环形絮状物,其中富含单个核细胞,离心后沉积细胞用含15%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM高糖培养基悬浮,调整细胞密度为1×109 L-1接种于25 T培养瓶内,放置在37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养,72 h后更换培养基,去除红细胞及其他未贴壁细胞,至70%～80%融合时传代.③实验评估:取传至第2代的脐带血间充质干细胞进行增殖能力检测;加入含终浓度为100 μg/L胰岛素样生长因子1,15%胎牛血清的DMEM软骨细胞诱导培养基,倒置显微镜下连续观察细胞生长情况,并行苏木精-伊红染色,应用扫描电子显微镜对诱导后细胞进行鉴定.结果:①细胞形态学观察:来源于脐血的单个核细胞接种24 h少量贴壁,近似圆形或短梭形;体外培养3 d后可见分散的间充质干细胞小集落,集落细胞为长梭形,呈放射状生长;2周后细胞集落彼此融合,呈旋涡状或菊花状生长.传代后3周细胞基本融合成层.②细胞增殖能力检测:脐带血间充质干细胞传代后8～12 h贴壁,7～13 d细胞处于对数生长期,16～19 d进入平台期,扩增速度快于原代培养,倍增时间为8.5 d.③脐带血间充质干细胞向软骨细胞诱导分化结果:胰岛素样生长因子1诱导12 d,脐带血间充质干细胞苏木精-伊红染色可见分泌少量细胞外基质.扫描电子显微镜下呈现软骨细胞特点,多边形,外围被分泌细胞外基质所围绕,呈蜘蛛网样.结论:从人脐带血中成功分离获取间充质干细胞,在体外经胰岛素样生长因子1条件培养液诱导短期内可获得软骨细胞.     

人脐血间充质干细胞体外扩增和向神经元样细胞定向诱导分化的研究

目的　探讨人脐血间充质干细胞 (mesenchymalstemcells,MSC)的体外分离、纯化、扩增和向神经元样细胞的定向诱导分化条件。方法　无菌条件下采集正常人脐血 ,肝素抗凝 ,用相对密度为1.0 77的淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞 ,进而获得MSC。用MesencultTM 培养基进行纯化和扩增培养。用流式细胞仪检测MSC的表面标志。取扩增 2 ,5 ,8代的MSC分别向神经元样细胞诱导 ,免疫组化和组化法检测神经元样细胞特异性标志和结构。结果　脐血MSC每扩增一代 ,细胞数量增加约 2～ 3倍。 6 .6× 10 5个人脐血原代MSC在体外扩增 10代后获得 9.9× 10 8个细胞 ,扩增约 1.5× 10 3倍。流式细胞仪检测结果显示 ,脐血MSC不表达CD34 、CD1 1a和CD1 1b,强表达CD2 9,弱表达CD71 ,与骨髓MSC表面抗原特性一致。诱导后的细胞平均有 70 %左右呈现典型的神经元样表型 ,免疫组化法检测发现不同代数的MSC诱导后均表达神经丝蛋白 (neurofilament,NF)和神经元特异性烯醇化酶 (neuron specificenolase ,NSE) ;组织化学法检测可看到神经元特有结构尼氏体。结论　脐血MSC在体外有较强的扩增能力 ,能够向非间充质类细胞分化。     

诱导脐血间充质干细胞向神经元样细胞分化

背景:脐血来源的间充质干细胞具有与造血干细胞和骨髓间充质干细胞相似的多向分化潜能,并且可以诱导分化为神经元样细胞,但分离培养后的成功率比较低,需要寻求一种成功率较高的培养方法。目的:探讨脐血间充质干细胞的生物学特性及向神经元样细胞诱导分化的方法。方法:由作者检索CNKI数据库2002/2011收录的有关脐血间充质干细胞诱导分化为神经元样细胞的相关研究文献,中文检索词为"脐血间充质干细胞,神经细胞,诱导分化,细胞因子"。结果与结论:脐血间充质干细胞具有与造血干细胞和骨髓间充质干细胞相似的多向分化潜能,可以在体外诱导分化为神经样细胞,对CD34表达阴性,是区别于脐血造血干细胞的主要标志物。脐血间充质干细胞在体外诱导分化的方法主要有细胞生长因子法、化学诱导剂法、生长因子与诱导剂联合法,通过各种神经诱导剂的作用,使培养出的神经元样细胞数量有所增加,国内外基础研究结果显示移植脐血间充质干细胞诱导分化的神经元样细胞可以修复中枢神经系统损伤性疾病,脐血间充质干细胞是神经损伤修复的一种理想种子细胞。     

人脐血间质干细胞向神经元样细胞分化的诱导因素

背景:研究证明脐血间质干细胞可向神经元样细胞分化,要同时保证脐血间质干细胞的扩增能力与分化潜能.其培养和诱导分化条件的优化显得尤为重要.目的:分析筛选人脐血间质干细胞向神经元样细胞体外诱导分化过程的影响因素.设计、时间及地点:随机对照实验,于2006-08/2007-05在河南省红十字血液中心血液成分应用研究所完成.材料:脐血来自郑州市妇幼保健院正常足月分娩的胎儿,平均采血量95mL.重组人表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子购自Sigma公司:分离细胞所用的四联袋为山东威高集团公司产品.方法:取采集6h内的脐血,采用四联袋密度梯度离心法分离脐血单个核细胞,以5×109L-1接种于DMEM/F12培养基中.[1]细胞因子实验:单独细胞因子组加入20μg/L B27、10μg/L碱性成纤维细胞生长因子:细胞因子联合组在此基础上加入5μg/L重组人表皮生长因子.[2]红细胞混入量实验:裂解组加入红细胞裂解液1mL,裂解后红细胞混入量为(0.44 ±0.13)×108/份:少红细胞组红细胞混入量为(0.51±0.21)×108/份,多红细胞组红细胞混入量为(2.65±1.28)×108/份.[3]首次换液时间实验:分别于接种后48h、7d首次换液.[4]诱导分化:将碱性成纤维细胞生长因子、重组人表皮生长因子共诱导7d的细胞爬片进行巢蛋白免疫组织化学染色.主要观察指标:观察不同因素对脐血间质干细胞增殖分化的影响.检测诱导分化后神经干细胞巢蛋白的表达.结果:培养7d后,表皮生长因子与碱性成纤维细胞生长因子联合诱导促细胞增殖的效果优于单独应用碱性成纤维细胞生长因子(t=2.880,P<0.05);红细胞裂解液组、多红细胞组贴壁细胞数明显低于少红细胞组(t=7.332～7.550,P<0.05),即混入的红细胞总量不大于108/份对细胞增殖无影响:接种后7d首次换液所获贴壁细胞数明显多于接种后48h首次换液(P<0.05).两种细胞因子共诱导后,神经干细胞巢蛋白呈阳性表达.结论:在脐血间质干细胞向神经元样细胞诱导分化过程中,细胞因子、红细胞混入量及首次换液时间都是重要的影响因素.     

脐血间充质干细胞体外扩增和向神经元样细胞的定向诱导

背景:骨髓间充质干细胞存在取材困难、供体有限,可能病毒污染等缺陷,限制了其临床应用,而目前已证实间充质干细胞不仅存在于骨髓,还存在于外周血,尤其是脐血.目的:探讨人脐血间充质干细胞的体外分离、扩增纯化方法及其神经分化潜能.设计、时间及地点:应用研究,体外细胞学观察,于2005-10/2007-10在南方医科大学神经生物学教研室完成.材料:新鲜脐血来自南方医科大学南方医院足月剖宫产新生儿脐带,取脐血前征得新生儿监护人的知情同意.方法:无菌条件下收集脐血,去除红细胞,采用低糖DMEM/F12进行培养:取扩增第3或4代的人脐血间危质干细胞,培养基中添加碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和全反式维甲酸.主要观察指标:用流式细胞仪检测贴壁细胞的表面标志;用免疫组化法检测诱导后细胞神经元特异性烯醇化酶、巢蛋白、神经元特异性核内抗原和神经丝蛋白表达.结果:人脐血间充质干细胞强表达CD13、CD29、CD44和CD105,弱表达CD106,不表达CD34、CD11a、CD14、CD33和CD45.培养基添加神经营养因了诱导后的细胞呈现典型的神经元样表型,诱导后高表达巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、神经元特异性核内抗原和神经丝蛋白.结论:人脐血富含间充质干细胞,分离培养后于培养基添加神经营养因子能够分化为神经元样细胞.     

人骨髓间充质干细胞体外分化为神经元样细胞

骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells,MSCs)是一群存在于骨髓腔内的能向骨、软骨、脂肪、肌肉和基质细胞等分化的细胞。最近的骨髓移植动物模型研究显示 ,在体内骨髓细胞具有形成神经元的能力[1 ,2 ] 。与造血细胞相同 ,骨髓中的间充质干细胞也具有可移植性[3] 。因此 ,骨髓移植后形成神经元的细胞可能来源于间充质干细胞。为验证此推测 ,我们进行了如下实验。材料与方法肝素抗凝骨髓取材于异基因骨髓移植过程中正常献髓者。间充质干细胞分离、纯化和体外培养按我们以前报道的方法进行[4] 。形成致密贴壁层的间充质干细胞用 0 .0 5 %…     

益气活血方体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化

背景:既往研究证明益气活血方补阳还五汤具有抑制脑缺血及再灌注模型细胞凋亡、抗自由基等作用,但关于本方剂对干细胞分化影响的报道较少.目的:观察益气活血方体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用.设计、时间及地点:以细胞为对象,对比观察实验,于2006-03/2008-02在河南省中医药研究院国家中医管理局三级实验室进行.材料:清洁级一二月龄SD大鼠20只,雌雄各半,体质量100～150g.益气活血方由本院制剂室生产,选用当归60g,桃仁30g,川芎30g加水720mL,提取挥发油,备用.药渣及提取液加入黄芪1 200g,赤芍60g,地龙30 g,红花30g,再加入920mL.水,煎煮1h,滤过,药渣再加入8 640mL.水,煎煮1h,滤过,合并2次煎液,浓缩至600 mL.,加入挥发油及吐温-80 3 mL,混匀,装瓶进行高压高温消毒.每毫升相当于生药2.4 g.方法:采用密度梯度离心法分离获取SD大鼠骨髓单个核细胞层,将细胞经过传代培养使骨髓间充质干细胞得到扩增和纯化.将第10代的细胞悬液接种于直径40 mm塑料培养皿中,细胞生长达80%～90%融合时,加入含体积分数为0.10的FBS、碱性成纤维细胞生长因子的DMEM培养基培养24 h,益气活血方组而后换为含诱导液二甲业砜、丁羟茼醚、β-巯基乙醇、益气活血方诱导5h,对照组换为含诱导液二甲亚砜、丁羟茴醚、β-巯基乙醇诱导5h.主要观察指标:采用流式细胞仪鉴定骨髓间充质干细胞;用免疫细胞化学方法检测诱导后细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋向的表达.结果:经流式细胞仪检测显示,细胞表面标志CD90、CD106阳性,CD45、CD34呈阴性.免疫细胞化学方法检测显示,益气活血方组在诱导1,3h分化巢蛋白细胞与诱导5h分化的神经元特异性烯醇化酶细胞和胶质纤维酸性蛋白细胞,与对照组相比,差异显著(P<0.01).结论:益气活血方具有体外定向诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用.     

人脐静脉间充质干细胞体外诱导分化为神经元的可行性

目的:探讨来源于人脐静脉内皮及内皮下层间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的可行性,分析体外分离纯化、原代及传代培养的最佳条件,为神经组织修复选择理想的种子细胞来源.方法:实验于2006-04/12在辽宁医学院解剖学实验室完成.①对象:取正常健康产妇顺产或剖宫产的新生儿脐带20条,由辽宁医学院附属第一医院提供,产妇及其家属均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:无菌条件下用1 g/LⅠ型胶原酶消化脐静脉内皮及内皮下层,收集的细胞按5×107 L-1,1×108 L-1,5×108 L-1,1×109 L-1,3×109 L-1密度接种进行原代培养,待细胞80%融合时胰酶消化传代.取第2代细胞,诱导组经含有3 μmo/Lβ-巯基乙醇、20%胎牛血清的DMEM预诱导液处理后,换成含10 g/L二甲基亚砜、100 mmol/L丁化羟基茴香醚的无血清DMEM诱导液进行诱导.未诱导组将诱导液更换为无血清DMEM.③实验评估:记录原代培养过程中不同接种密度细胞贴壁所需时间.免疫细胞化学检测诱导前细胞表面抗原血管性血友病因子、CD166的表达及诱导后细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白的表达,倒置相差显微镜下计数阳性细胞分化率.结果:①不同接种密度细胞贴壁所需的原代培养时间比较:5×107 L-1组仅有1孔细胞贴壁呈克隆样生长,但培养至28 d时仍不能传代,其余培养孔均无细胞贴壁生长.与1×108 L-1组比较,5×108 L-1,1×109 L-1,3×109 L-1组细胞贴壁生长的原代培养时间均明显缩短(P < 0.05),且后3组比较差异无显著性意义(P > 0.05).②贴壁细胞表面抗原检测:CD166呈阳性,血管性血友病因子呈阴性.③诱导分化:诱导组脐静脉间充质干细胞巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶呈阳性表达,不表达胶质纤维酸性蛋白.巢蛋白阳性细胞率为(9.5±1.2)%,神经元特异性烯醇化酶阳性细胞率为(15.6±2.6)%.未诱导组以上3种标志均不表达.结论:①在体外可以成功分离培养获得人脐静脉内皮及内皮下层的间充质干细胞,其原代培养细胞的种植密度以5×108 L-1～ 1×109 L-1为佳.②细胞传2代后性质相对均一,基本无造血细胞和内皮细胞污染,达到纯化目的,具有间充质干细胞特点.③在化学诱导剂β-巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基茴香醚联合作用下,其可以向神经元样细胞分化.     

共培养诱导人脐血间充质干细胞向软骨细胞分化

背景：研究发现共培养可诱导人源干细胞向特定细胞分化,但如何控制两种细胞间比例以最大效率获得目的细胞是研究中的难题。目的：观察人脐血问充质干细胞与兔软骨细胞按不同比例共培养后向软骨细胞分化的情况。方法：复苏人脐血间充质干细胞并进行传代,将经流式细胞仪鉴定的人脐血间充质干细胞与体外分离的兔软骨细胞按照2：1或3：1的比例共培养,并用100pg／L的胰岛素样生长因子1进行诱导。在共培养14d,提取细胞RNA和蛋白质,实时定量PCR检测聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA的表达,Westernblot检测聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白的表达。结果与结论：人脐血间充质干细胞与兔软骨细胞共培养14d,共培养的细胞聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA及蛋白的表达高于单纯胰岛素样生长因子1诱导的细胞。在人脐血间充质干细胞与软骨细胞比例相同时,加入胰岛素样生长因子1可提高细胞聚集蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA及蛋白的表达。同时人脐血间充质干细胞与兔软骨细胞按3：1共培养更能促进细胞Ⅱ型胶原mRNA和蛋白及聚集蛋白多糖蛋白的表达;而按2：1共培养时,细胞聚集蛋白多糖mRNA表达更多。可见人脐血问充质干细胞与兔软骨细胞共培养后可诱导人脐血间充质干细胞向软骨细胞分化,且按3：1的比例共培养可获得更多的软骨细胞。     

人脐血间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的体外诱导

背景:细胞替代治疗帕金森病成为目前研究的一个热点,如何进行体外诱导获得足量的有效多巴胺能神经元是治疗该疾病的一种策略。目的:探讨人脐血间充质干细胞体外诱导分化为多巴胺能神经元的可行性。方法:将传至第5代人脐血间充质干细胞以5×106L-1接种,先用20μg/L表皮生长因子+20μg/L碱性成纤维细胞生长因子预诱导24h后,分为4组:对照组加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液,不加任何诱导液;其余3组分别加入100μmol/L抗坏血酸,1μmol/L全反式维甲酸,50μg/L胶质细胞源性神经营养因子单独或联合进行诱导。结果与结论:各诱导组均表达酪氨酸羟化酶、多巴胺转运体、多巴胺受体D2 mRNA。诱导分化后的细胞能表达神经元、星形胶质细胞特异性抗原。与对照组相比,各诱导组巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白、酪氨酸羟化酶、多巴胺转运体、多巴胺受体D2阳性细胞率均明显升高(P<0.05);且全反式维甲酸+胶质细胞源性神经营养因子组和3种物质联合诱导组升高幅度高于抗坏血酸组(P<0.05),3种物质联合诱导组升高幅度高于全反式维甲酸+胶质细胞源性神经营养因子组(P<0.05)。结果提示抗坏血酸,全反式维甲酸,胶质细胞源性神经营养因子单独或联合均能促进人脐血间充质干细胞向多巴胺能神经元分化,3种物质联合应用效果最高。     

人脐血间充质干细胞向成心肌细胞诱导扩增后的生物安全性评价

背景:人脐血间充质干细胞在体外分离培养并向心肌细胞诱导分化的条件下,能否仍然维持原有的正常生理性状态,即是否达到种子细胞的生物安全性标准,目前尚少见研究.目的:分析人脐血间充质干细胞在体外分离培养及向心肌细胞诱导分化的条件下,其染色体核型及端粒酶活性是否发生异常的改变及细胞是否产生致肿瘤性.方法:采用染色体G显带处理方法体外分离、培养的第3代以后的人脐血间充质干细胞和向心肌细胞诱导培养至第7代后的样本进行核型分析,分析细胞的端粒酶活性,细胞周期相关基因cyclinA、cdk2、C-fos、h-TERT、C-myc和p53的表达,并通过裸鼠皮下致肿瘤试验对细胞的致肿瘤性进行分析.结果与结论:人脐血间充质干细胞和向心肌细胞诱导体外培养至第7代,未发现染色体核型异常改变,相应的端粒酶活性也未出现异常增高.c-myc、p53、h-TERT、C-fos无表达.致肿瘤试验,实验裸鼠在观察期内均未见结节形成或可疑病灶产生,符合国家医疗产品生物学评价标准的要求.     

甲状腺素诱导人脐血间充质干细胞向软骨细胞分化中的作用

背景：研究发现共培养可诱导人源干细胞向特定细胞分化,但如何获得更多的组织工程所需的种子细胞是研究中的难题。目的：探讨不同浓度甲状腺素在人脐血间充质干细胞向兔软骨细胞分化中的作用。方法：将人脐血间充质干细胞与兔软骨细胞按照2∶1比例共培养,并用含有不同浓度甲状腺素(0,0.01,0.1,1,10μmol/L)的培养基分组刺激,共培养14 d后分别观察各组细胞形态,并提取细胞RNA和蛋白质,Real-time PCR检测聚集蛋白多糖mRNA及Ⅱ型胶原mRNA表达量,Western blotting技术检测Ⅱ型胶原及聚集蛋白多糖蛋白表达水平。结果与结论：加入0.01,0.1,1,10μmol/L的甲状腺素干预后,聚集蛋白多糖、Ⅱ型胶原mRNA和蛋白的表达水平均随甲状腺素浓度增加而增强,与单纯共培养组比较差异有显著性意义(P <0.05)。实验证明高浓度甲状腺素可增强人脐血间充质干细胞与兔软骨细胞共培养后向软骨细胞分化的能力。     

冻存人脐血间充质干细胞向类肝细胞的诱导分化

目的分离培养人脐血间充质干细胞,观察其冻存复苏后向肝细胞定向分化的能力.方法实验于2004-01/2006-01在四川大学华西医院感染性疾病中心生物治疗国家重点实验室进行.采用密度梯度离心与直接贴壁相结合的方法,1×107 L-1和1×108 L-1两种接种密度进行人脐带血间充质干细胞的分离,观察细胞生长及检测其表面抗原.将第6代的人脐带血间充质干细胞采用梯度冷冻技术冻存6个月,复苏后培养至第8代时,加入肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子-4联合诱导28 d.将第8代人脐带血间充质干细胞爬片与诱导28 d后的类肝细胞爬片共培养,第8代人脐带血间充质干细胞爬片与未诱导培养28 d的人脐带血间充质干细胞爬片共培养作为阴性对照.检测加入肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子4后不同时间点及共培养28 d后的人脐带血间充质干细胞中CK8&18、白蛋白和糖原的表达.结果①密度梯度离心收获的单个核细胞培养传代后,能获得均-贴壁的间充质干细胞,第5代细胞中,CD44阳性的细胞达97.9%.②人脐血间充质干细胞冻存复苏后,活细胞约为70%,复苏后接种密度为1×107 L-1的生长状态优于1×108 L-1.③添加肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子4后,可以在细胞内检测到CK8&18、白蛋白及糖原的表达.④与类肝细胞共培养28 d后,人脐血间充质干细胞中小部分细胞中同时表达CK8&18和白蛋白,并有糖原的表达.结论人脐血间充质干细胞可采用密度梯度离心法结合直接贴壁法分离获得,并可冷冻保存;复苏后在肝细胞生长因和成纤维细胞生长因子4的联合诱导下,能定向分化为表达CK8&18,并合成白蛋白和糖原的类肝细胞,类肝细胞可能具有诱导人脐血间充质干细胞向肝系细胞定向分化的作用.