膝骨关节炎滑膜间充质干细胞多向分化及免疫抑制能力

目的观察骨关节炎(OA)患者膝关节滑膜来源的间充质干细胞(SMSCs)多向分化能力以及免疫抑制能力。方法无菌环境下通过关节镜取出中山大学孙逸仙纪念医院10例OA患者膝关节滑膜组织,分离培养出SMSCs,采用CCK-8法检测细胞增殖能力,通过成骨、成软骨和成脂肪诱导分化培养基对SMSCs诱导分化,于诱导第21天分别行茜素红、甲苯胺蓝和油红O染色。将SMSCs和CD3、CD28抗体刺激后的人外周血单核细胞(PBMC)进行共培养,通过流式细胞术对PBMC的增殖率进行检测,组间比较通过方差分析总体差异后再通过Bonferroni法进行组间两两比较。结果OA患者SMSCs第3天开始进入对数增长期,第7天细胞增殖进入平台期。SMSCs经过成骨、成软骨和成脂肪诱导分化后,茜素红、甲苯胺蓝和油红O染色均为阳性。SMSCs和CD3、CD28抗体刺激后的PBMC进行共培养5 d后,阴性对照组PBMC增殖率为(3.8±0.4)%,几乎不增殖,阳性对照组PBMC增殖率为(80.9±8.1)%,实验组PBMC的增殖率为(52.3±5.1)%,实验组与阳性对照组的差异具有统计学意义(t=8.97,P0.01)。结论 OA患者SMSCs同样具有多向分化能力和免疫抑制能力,可作为组织工程理想的种子细胞来源。     

血红素氧合酶1对TNF-α诱导的人退变椎间盘髓核细胞凋亡的作用研究

目的探讨血红素氧合酶1(heme oxygenase 1,HO-1)对TNF-α诱导的人退变椎间盘髓核细胞凋亡的作用及其可能的分子机制。方法取腰椎间盘突出症患者自愿捐赠的椎间盘组织,体外培养人退变髓核细胞并传代,取第3代细胞进行实验。采用细胞计数试剂盒8测定不同浓度(10、20、50、100和200 ng/mL)TNF-α对髓核细胞活性的影响,筛选最佳刺激浓度进行下一步实验。将髓核细胞分成4组,分别采用单纯基础培养液(对照组)、TNF-α刺激(TNF-α组)、TNF-α和CoPP 10μmol/L刺激(CoPP组)、TNF-α和ZnPP 15μmol/L刺激(ZnPP组)培养,24 h后采用Hoechst染色以及流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot检测凋亡相关蛋白活化型Caspase-3(cleaved Caspase-3)、上皮膜蛋白1(epithelial membrane protein 1,EMP-1)以及HO-1、p-P65的表达。为进一步探讨HO-1对髓核细胞凋亡的潜在分子机制,取髓核细胞分别采用TNF-α刺激(TNF-α刺激组)以及TNF-α和吡咯烷二硫基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)5μmol/L刺激(TNF-α+PDTC刺激组)培养24 h,采用流式细胞仪检测髓核细胞凋亡率。结果经检测确定TNF-α最佳抑制浓度为100 ng/mL。Hoechst染色示,对照组和CoPP组凋亡细胞较少;TNF-α组和ZnPP组可见凋亡样改变细胞核,其中ZnPP组最显著。流式细胞仪检测示,与对照组相比,TNF-α组、CoPP组及ZnPP组细胞凋亡率均显著提高(P0.05);与TNF-α组相比,CoPP组细胞凋亡率显著降低(P0.05),而ZnPP组显著提高(P0.05)。Western blot检测示,与对照组相比,TNF-α组HO-1蛋白表达降低,cleaved Caspase-3、EMP-1及p-P65蛋白表达升高(P0.05)。与TNF-α组相比,CoPP组HO-1蛋白表达明显升高,cleaved Caspase-3、EMP-1、p-P65蛋白表达明显降低(P0.05);而ZnPP组HO-1蛋白表达明显降低(P0.05),cleaved Caspase-3、EMP-1蛋白表达增高(P0.05),p-P65蛋白表达无明显变化(P0.05)。与TNF-α刺激组相比,TNF-α+PDTC刺激组细胞凋亡率明显降低(t=3.076,P=0.031)。结论 HO-1能够抑制TNF-α诱导的人椎间盘髓核细胞凋亡,其机制可能是通过调控NF-кB通路得以实现。     

荧光微球体外标记大鼠BMSCs的初步研究

目的通过检测荧光微球655(quantum dot655,QD655)标记SD大鼠BMSCs的体外细胞毒性、细胞增殖、细胞贴附性以及标记率,探讨QD655标记BMSCs及其示踪的可行性。方法收集2周龄健康SD大鼠股骨和胫骨骨髓,贴壁培养BMSCs。取第3代BMSCs采用QD655标记作为实验组,以未标记BMSCs作为对照组,采用锥虫蓝拒染法检测细胞存活率,MTT法观察QD655对细胞增殖性的影响;取实验组BMSCs向成骨诱导分化培养2周,采用茜素红、ALP染色定性鉴定细胞成骨分化能力,实时荧光定量PCR鉴定标记对细胞成骨分化的影响;分别在标记后即刻、1、2、4、6周采用荧光显微镜动态检测实验组BMSCs阳性标记率;扫描电镜观察实验组细胞在胶原/生物活性玻璃复合材料上的贴附性。结果实验组与对照组细胞存活率均90%,比较差异无统计学意义(P0.05);培养1、3、5、7、9d,两组细胞增殖率比较差异均无统计学意义(P0.05)。实验组BMSCs经成骨诱导分化2周后,茜素红及ALP染色均呈阳性,实时荧光定量PCR检测实验组BMSCs的骨桥蛋白、骨钙素、Ⅰ型胶原、ALP、BMP-2 mRNA较对照组成倍数高表达。实验组BMSCs标记后即刻阳性标记率达96.50%±1.59%,随着标记时间延长标记率下降,标记后1、2、4、6周标记率分别为93.30%±1.51%、72.40%±2.90%、40.10%±3.60%、10.00%±1.70%,对照组各时间点阳性标记率均为0。扫描电镜观察示实验组标记后细胞和材料贴附良好。结论 QD655对大鼠BMSCs标记时间长,标记率及安全性高,是一种良好标记物。     

猪滑膜源性MSCs体外多向分化潜能的研究

目的 体外分离培养猪滑膜源性MSCs(synovium-derived MSCs,SMSCs),探讨其在体外多向分化潜能.方法 2月龄长枫杂交猪3头,雌雄不限,体重8～10kg.取猪膝关节滑膜组织分离SMSCs并行原代及传代培养,待第3代SMSCs长满培养皿后,吸去基础培养液,分别加入特定培养液进行成软骨、成骨、成脂诱导分化,作为实验组;以基础培养液培养作为对照组.成软骨诱导21 d后行甲苯胺蓝染色、免疫组织化学染色和实时荧光定量PCR检测;成骨诱导10 d后行ALP染色检测,21 d后行茜素红染色检测;成脂诱导21 d后行油红O染色检测.结果 SMSCs培养24 h后细胞形态细长或呈多角形;48 h后细胞数量增多;72 h后可见大量纺锤形细胞,其间散在分布少许小圆形细胞.实验组成软骨诱导21 d后甲苯胺蓝染色早阳性,细胞外有蛋白多糖(Aggrecan)形成;免疫组织化学染色示特异软骨基质ColⅡ表达;实时荧光定量PCR检测示Col Ⅱ A1、Aggrecan、SOX9 mRNA表达量与对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).成骨诱导10 d后ALP染色阳性,21d后茜素红染色阳性,有钙结节形成.成脂诱导21 d后油红O染色示细胞内有脂滴形成.对照组除ALP染色观察呈弱阳性外,余染色均呈阴性.结论 猪膝关节滑膜组织可分离获取SMSCs,其在体外具有向成软骨、成骨、成脂多向分化潜能,有望成为组织工程种子细胞来源.     

环状RNA 0001846对骨关节炎生物学功能的影响及其机制

目的探讨环状RNA 0001846(circ₀001846)调控滑膜巨噬细胞极化在骨关节炎中的生物学功能及其机制。方法收集常州市第二人民医院2021年12月至2022年9月行全膝关节置换术骨关节炎患者及遭受膝关节创伤且无骨关节炎患者的滑膜组织各10例, 将10例骨关节炎滑膜组织作为研究组, 10例非关节炎滑膜组织作为对照组。使用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)测定环状RNA(circRNA)及巨噬细胞标志物在滑膜组织的mRNA表达水平;使用THP-1细胞上清液孵育软骨细胞, 通过细胞计数试剂盒(CCK-8)与流式细胞术测定软骨细胞活力、软骨细胞凋亡率;蛋白质印迹法(Western blot)检测软骨细胞凋亡相关蛋白表达水平。组间比较采用t检验。结果实验组患者滑膜组织中M1巨噬细胞标志物表达高于对照组[诱导型一氧化氮合酶(iNOS):2.67±0.34比0.98±0.10, t=15.140, P<0.01;肿瘤坏死因子-α(TNF-α):2.51±0.31比1.02±0.22, t=12.422, P<0.01和白细胞介素(IL)-1β:4.27...     

LncRNA FGD5-AS1靶向miR-103a-3p对IL-1β诱导的关节软骨细胞凋亡的机制研究

目的探讨LncRNA FGD5-AS1靶向miR-103a-3p对IL-1β诱导的关节软骨细胞损伤及细胞凋亡的影响与分子机制。方法体外培养大鼠关节软骨细胞,分为NC组、IL-1β组(IL-1β浓度为10 ng/m L)。采用qRT-PCR检测细胞中FGD5-AS1、miR-103a-3p的表达水平。分别将pc DNA-FGD5-AS1、miR-103a-3p mimics转染至软骨细胞,随后使用IL-1β处理48 h。采用ELISA检测IL-6、TNF-α、IL-8水平;流式细胞术检测细胞凋亡率;双荧光素酶报告实验验证FGD5-AS1与miR-103a-3p的靶向关系; Western blot检测Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3、p-NF-κB p65、p-IκBα蛋白表达量。结果与NC组相比,IL-1β组软骨细胞中FGD5-AS1的表达水平显著降低(P0.05),miR-103a-3p、Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3的表达水平显著升高(P0.05),IL-6、TNF-α、IL-8水平显著升高(P0.05),细胞凋亡率显著升高(P0.05); FGD5-AS1过表达后可明显降低IL-6、TNF-α、IL-8、p-NF-κB p65、p-IκBα水平(P0.05),降低细胞凋亡率(P0.05),抑制Bax、Cyt C、Cleaved Caspase-3表达(P0.05);双荧光素酶报告实验证实FGD5-AS1靶向结合miR-103a-3p并可负向调控miR-103a-3p的表达(P0.05); miR-103a-3p过表达可明显逆转FGD5-AS1过表达对细胞凋亡及炎症反应的抑制作用(P0.05)。结论 LncRNA FGD5-AS1可通过靶向负调控miR-103a-3p的表达从而抑制IL-1β诱导的关节软骨细胞炎症反应及细胞凋亡,其作用机制可能通过抑制NF-κB信号通路激活有关。     

CD44分子岩藻糖基化修饰对兔BMSCs流体黏附力的影响

目的探讨CD44分子岩藻糖基化修饰对兔BMSCs流体黏附力的影响。方法采用密度梯度离心结合贴壁培养的方法体外分离纯化获得兔BMSCs,倒置显微镜观察细胞生长状况,流式细胞仪检测细胞表面MSCs相关抗原CD44、CD34、CD29、CD105的表达。使用α-1,3-岩藻糖转移酶Ⅵ(α-1,3-fucosyltransferaseⅥ,FTⅥ)对兔BMSCs进行体外岩藻糖基化处理作为实验组,以未经岩藻糖基化处理的BMSCs作为对照组,采用流式细胞仪检测唾液酸化Lewis X(sialyl-Lewis X,sLe~X)阳性率及E-选择素结合率。使用Hank平衡盐溶液重悬的岩藻糖基化BMSCs作为实验组(A组),未经岩藻糖基化修饰的BMSCs作为研究对照组(B组),添加EDTA冲洗的岩藻糖基化兔BMSCs作为阴性对照组(C组),利用平行板流室黏附试验检测兔BMSCs流体黏附力。结果兔BMSCs形态以长梭形为主,生长旺盛;第3代BMSCs CD44、CD29、CD105呈阳性表达,而CD34呈阴性表达。实验组sLe~X阳性率为32.52%±1.76%,显著高于对照组的1.48%±0.51%,差异有统计学意义(t=29.277,P=0.000);实验组E-选择素结合率为41.05%±1.84%,显著高于对照组的4.33%±0.92%,差异有统计学意义(t=35.674,P=0.000)。随着流体剪切力的增加,A组人脐静脉内皮细胞(human umbilical vascular endothelial cells,HUVEC)表面黏附的BMSCs数量先升高后降低,而B、C组HUVEC表面几乎无BMSCs黏附。各剪切力作用下,A组HUVEC表面黏附的BMSCs细胞数均显著多于B、C组,差异有统计学意义(P0.05),B、C组间差异无统计学意义(P0.05)。结论 CD44分子岩藻糖基化修饰能够增强兔BMSCs的流体黏附力。     

Bcl-2过表达对TNF-α诱导大鼠成骨细胞凋亡的影响

目的 探讨凋亡相关基因Bcl-2过表达对TNF-α诱导大鼠成骨细胞凋亡的影响及相关机制。方法将含有Bcl-2cDNA的逆转录病毒表达载体pDOR-SB质粒转染原代培养的大鼠成骨细胞并且进行阳性克隆筛选。用30 ng/ml TNF-α刺激转染组和对照组细胞24 h,流式细胞术、透射电镜检测细胞凋亡,应用免疫组化结合计算机图像分析技术检测转染组和对照组细胞Bcl-2蛋白及TNF-α刺激前后Caspase-3蛋白表达。结果 Bcl-2蛋白表达在转染加压筛选组显著高于对照组(P<0.05)。TNF-α刺激后转染组细胞亚二倍体凋亡峰比例为6.6％,对照组为16.1％。TNF-α刺激后转染组细胞.超微结构大多正常,对照组细胞出现明显凋亡征象。TNF-α刺激后两组细胞 Ciaspase-3蛋白表达均升高;TNF-α刺激前Caspase-3蛋白表达转染组与对照组比较差异无显著性(P>0.05),TNF-α刺激后Cas-pase-3表达对照组较转染组显著高(P<0.05)。结论 Bcl-2过表达对TNF-α诱导的成骨细胞凋亡有抵抗作用,Bcl-2过表达的抗凋亡作用可能部分通过抑制TNF-α刺激引起的Caspase-3蛋白表达升高实现,有望作为抑制成骨细胞凋亡的侯选基因。     

姜黄素对人脊索瘤细胞系CM-319凋亡和放射敏感性影响的实验研究

目的探讨姜黄素对人脊索瘤细胞系CM-319凋亡和放射敏感性的影响及作用机制。方法体外培养CM-319细胞,分为姜黄素0μmol/L组、姜黄素5μmol/L组、姜黄素10μmol/L组、姜黄素20μmol/L组、si-NC组、si-UHRF1组、姜黄素+pcDNA组、姜黄素+pcDNA-UHRF1组,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western Blot检测细胞中Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3和UHRF1蛋白表达,qRT-PCR检测UHRF1 mRNA表达,克隆形成实验检测CM-319细胞对放射线敏感性。结果姜黄素0μmol/L组CM-319细胞凋亡率7.24%±0.73%,姜黄素5、10、20μmol/L组CM-319细胞凋亡率分别为12.61%±1.57%、18.42%±1.54%、29.37%±2.65%,差异有统计学意义(t=9.305;t=19.680;t=24.153,均P<0.05);Bcl-2蛋白相对表达量为0.76±0.07,余3组分别为0.62±0.06、0.51±0.05、0.33±0.03(t=4.556;t=8.719;t=16.939,均P<0.05);Bax相对表达量为0.26±0.03、0.41±0.04、0.55±0.05、0.69±0.06(t=9.000;t=14.920;t=19.230,均P<0.05);Cleaved Caspase-3相对表达量为0.24±0.03、0.37±0.04、0.49±0.05、0.62±0.06(t=7.800;t=12.862;t=16.994,均P<0.05),UHRF1mRNA相对表达量为1.01±0.09、0.82±0.08、0.67±0.07、0.42±0.04(t=4.734;t=8.946;t=17.972,均P<0.05),UHRF1蛋白相对表达量为0.83±0.08、0.61±0.06、0.48±0.05、0.31±0.0(t=6.600;t=11.130;t=18.258,均P<0.05),且呈剂量依赖性,增敏比分别为1.433、1.708和2.183。Si-NC组CM-319细胞中UHRF1蛋白相对表达量为0.79±0.08,si-UHRF1组表达降低为0.35±0.04(t=14.758,P<0.05);CM-319细胞凋亡率分别为8.24%±0.83%和21.49%±2.11%(t=17.531,P<0.05);Bcl-2蛋白表达水平分别为0.71±0.07、0.34±0.03(t=14.575,P<0.05);Bax相对表达量为0.25±0.03、0.62±0.06(t=16.547,P<0.05);Cleaved Caspase-3相对表达量为0.23±0.03、0.58±0.05(t=18.007,P<0.05),增敏比为1.727。姜黄素+pcDNA组CM-319细胞凋亡率为28.31%±3.01%,姜黄素+pcDNA-UHRF1组为13.59%±1.25%(t=13.549,P<0.05);Bcl-2相对表达量分别为0.31±0.03、0.63±0.06(t=14.311,P<0.05);Bax相对表达量分别为0.71±0.07、0.42±0.04(t=10.791,P<0.05);Cleaved Caspase-3相对表达量分别为0.65±0.05、0.38±0.04(t=12.650,P<0.05),增敏比为0.539。结论姜黄素可诱导CM-319细胞凋亡并增强CM-319细胞的放射敏感性,其机制与下调UHRF1表达有关。     

大鼠骨髓来源与前交叉韧带来源MSCs体外生物学特性比较研究

目的比较大鼠骨髓来源与前交叉韧带(anterior cruciate ligament,ACL)来源的MSCs体外增殖及成骨、成软骨、成脂分化潜能的差异。方法取SPF级6周龄雄性BN大鼠10只,体质量200~220 g,无菌条件下分别取大鼠骨髓及ACL,贴壁法培养获取BMSCs与ACL来源MSCs并进行传代,倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。取生长良好的第3代细胞,流式细胞仪检测细胞免疫表型CD34、CD45、CD90和CD29表达;细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)法检测细胞体外增殖能力,克隆形成实验检测细胞体外克隆形成能力;行成骨、成软骨及成脂体外诱导多向分化能力检测;实时荧光定量PCR检测成骨[ALP、骨钙蛋白、RUNX2、BMP-2、分泌性磷蛋白1(secreted phosphoprotein 1,Spp1)]、成软骨[Ⅱ型胶原α1(collagen typeⅡα1,Col2α1)、软骨聚糖蛋白(Aggrecan,Acan)、Sox9]及成脂[过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(peroxisome proliferator activated receptorγ2,PPARγ2)、CCAAT/增强子结合蛋白α]相关基因mRNA相对表达量。结果第3代ACL来源MSCs与BMSCs形态相似,均表现为贴壁生长的长梭形细胞。流式细胞仪检测示,两种细胞均表达CD29、CD90,基本不表达CD45及CD34。CCK-8法检测示,ACL来源MSCs的吸光度(A)值(1.11±0.08)显著高于BMSCs(0.78±0.05),差异有统计学意义(t=3.599,P=0.023);ACL来源MSCs的细胞集落数[(53.00±5.51)个/孔]亦明显多于BMSCs[(30.67±4.84)个/孔](t=3.045,P=0.038)。经成骨、成软骨、成脂体外诱导培养21d后,BMSCs及ACL来源MSCs均表现为茜素红、甲苯胺蓝及油红O染色阳性。实时荧光定量PCR检测示,ACL来源MSCs的BMP-2、Spp1、Col2α1、Acan、Sox9及PPARγ2 mRNA相对表达量显著高于BMSCs,差异均有统计学意义(P0.01)。结论 ACL来源MSCs比BMSCs具有更强的体外增殖能力,在相同体外条件下更易向软骨分化,是一种有潜力的促进腱骨愈合的种子细胞。     

深低温冷冻对大鼠髌腱组织内肌腱干细胞生物学特性影响的研究

目的探讨深低温冷冻处理对大鼠髌腱组织中肌腱干细胞(tendon-derived stem cells,TDSCs)的成活、细胞活力、早期凋亡、迁移能力及肌腱相关基因表达的影响。方法取12只4月龄雄性SD大鼠双侧髌腱组织,其中6只大鼠12条髌腱组织(实验组)进行深低温冷冻处理;剩余髌腱组织(对照组)不作处理,作为正常对照。取两组髌腱组织用0.3%Ⅰ型胶原酶消化获得有核细胞,分别用锥虫蓝染色检测有核细胞成活率、结晶紫染色检测有核细胞克隆形成能力;取两组髌腱组织分离培养TDSCs,并传至第3代,采用Alamar Blue法检测细胞体外增殖能力;Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞早期凋亡率;Transwell法检测细胞迁移能力;实时荧光定量PCR检测细胞肌腱相关基因Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ,Col1α1)、scleraxis(Scx)和tenomodulin(Tnmd)m RNA表达。结果与对照组(91.00%±3.63%)比较,实验组原代有核细胞成活率为61.65%±4.76%,差异有统计学意义(t=12.010,P=0.000)。两组有核细胞接种后,均呈克隆样生长;培养12 d,实验组每1 000个有核细胞克隆集落形成数为(8.41±0.33)个,较对照组(15.19±0.47)个显著减少(t=28.910,P=0.000)。实验组TDSCs占活性有核细胞比例为1.37%±0.09%,较对照组1.67%±0.10%显著减少(t=5.508,P=0.003)。第3代TDSCs培养14 d内两组细胞生长趋势一致;两组各时间点吸光度(A)值比较,差异均无统计学意义(P0.05)。实验组及对照组TDSCs早期凋亡率分别为1.67%±0.06%、1.63%±0.06%,比较差异无统计学意义(t=0.707,P=0.519)。镜下见,两组均有TDSCs黏附于Transwell小室下室,实验组细胞数为(445.00±9.70)个,对照组为(451.50±12.66)个,比较差异无统计学意义(t=0.998,P=0.342)。实验组Col1α1、Scx、Tnmd的m RNA相对表达量分别为3.498±0.065、0.062±0.002、(4.211±0.211)×10–5,对照组分别为3.499±0.113、0.062±0.001、(4.341±0.274)×10–5,比较差异均无统计学意义(t=0.013,P=0.991;t=0.042,P=0.969;t=0.653,P=0.549)。结论大鼠肌腱组织经深低温冷冻后其有核细胞成活率降低,但肌腱组织仍保留大量有活性TDSCs,且细胞增殖能力、早期凋亡率、体外迁移能力及成肌腱分化能力未见明显异常。     

无血清条件对诱导转染pEGFP-C1/Akt的骨髓间充质干细胞凋亡的影响

目的探讨无血清条件对诱导pEGFP-C1/Akt转染的骨髓间充质干细胞（MSCs）凋亡的影响。方法实验分实验组（pEGFP-C1/Akt转染MSCs）、抑制组（pEGFP-C1/Akt转染MSCs＋PI3K/Akt特异性抑制剂）和对照组（MSCs）。在无血清培养基条件下,分别在4、12、24和36h共4个时间点利用RT-PCR检测Akt及Caspase-3mRNA表达,Western blot检测Akt蛋白表达,免疫组化检测Caspase-3蛋白表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果在无血清培养4、12、24和36h后,实验组的Akt mRNA和蛋白的表达均高于抑制组及对照组（P〈0.01）,Caspase-3mRNA及蛋白的表达水平和细胞凋亡率则均低于抑制组及对照组（P〈0.01）;抑制组及对照组间Akt和Caspase-3mRNA及蛋白的表达和凋亡率的差异无统计学意义（P〉0.05）。结论Akt可能通过PI3K/Akt途径抑制其下游底物Caspase-3的表达,从而抑制无血清诱导的MSCs凋亡。     

微小RNA-564基因下调对滑膜间充质干细胞成软骨分化的影响

目的探究下调微小RNA-564(miR-564)基因对滑膜间充质干细胞成软骨分化的作用。 方法取第3代的人滑膜间充质干细胞(SMSCs)作为实验细胞,实验设计为3组：SMSCs空白对照组(空白组);miRNA抑制剂转染SMSCs对照组(对照组);miR-564抑制剂转染SMSCs实验组(实验组)。将3组SMSCs同时成软骨诱导培养,观察诱导后软骨细胞的组织形态,并检测诱导前7 d内的3组细胞增殖曲线,和软骨分化特异性基因和蛋白[Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、性别决定区Y框蛋白9(Sox9)、母亲DPP同源物4(Smad4)];本次实验所有数据均采用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验。 结果甲苯胺蓝染色观察细胞形态与特点基本符合软骨细胞,实验组细胞数量更多,蓝染更明显;细胞增殖曲线表明实验组细胞增殖速度明显快于对照组(F＝0.842, P <0.01);RT-PCR检测与Western Blotting检测表明实验组软骨细胞分化特异基因和蛋白表达较对照组明显升高(F＝2274.75, F＝447.31, F＝30476.22; P <0.01),并且实验组TGF-BMP关键基因及蛋白Smad 4有所升高(F＝457.02, P <0.01)。 结论下调miR-564基因的表达可促进滑膜间充质干细胞向软骨细胞增殖与分化,并且有可能是通过作用于TGF-BMP通路实现。     

海藻糖对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

目的探讨海藻糖是否对肝脏缺血再灌注损伤具有保护作用及其相关机制。方法C57BL/6J小鼠数字随机分为无缺血组、缺血再灌注组、海藻糖处理组和生理盐水对照组,缺血90 min后于再灌注的0h和6h,收集血液和肝组织,通过分离血清测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)肝功能指标及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-2(IL-2)炎症因子水平和肝组织病理改变研究海藻糖在肝脏缺血再灌注损伤中的作用;AML12小鼠肝细胞系构建缺糖缺氧-复糖复氧细胞模型,分为实验组和对照组,实验组根据给予的海藻糖浓度不同分为低剂量组和高剂量组,对照组无海藻糖,收集细胞,流式细胞仪检测凋亡水平以研究海藻糖对肝脏缺血再灌注损伤诱导的细胞凋亡的影响,蛋白印迹法检测Caspase-3、Cleaved Caspase-3和Bcl-2蛋白水平以研究海藻糖在肝脏缺血再灌注损伤诱导的细胞凋亡中的分子机制。结果体内动物实验显示肝脏缺血再灌注后,缺血再灌注组ALT、AST及TNF-α、IL-1β和IL-2等肝功能指标及炎症因子水平升高(P<0.05),且肝组织发生坏死;而在给予海藻糖处理后,ALT、AST、TNF-α、IL-1β和IL-2等水平较生理盐水对照组降低且肝组织坏死面积也减少(P<0.05)。体外细胞实验显示与对照组相比,实验组肝细胞凋亡水平下降;且实验组活化的促凋亡蛋白Cleaved Caspase-3水平下降、抗凋亡蛋白Bcl-2水平升高。结论在体内和体外条件下海藻糖对肝脏缺血再灌注损伤有保护作用,其机制可能是通过抑制肝脏缺血再灌注损伤诱导的炎症发生和抑制Caspase-3的活化并促进Bcl-2的表达,减轻细胞凋亡,从而保护肝脏缺血再灌注损伤。     

腰退行性病变与TRALL基因之间关系的研究

[目的]探讨腰椎间盘退行性病变与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)基因之间的相关性及临床意义。[方法]取60例腰椎间盘突出症患者(退变组)和同期60例因创伤手术患者(未退变组)髓核组织。行组织化学染色。体外实验方面,分离细胞培养后,分为4组,分别为空白对照、TRAIL siRNA转染、TNF-α处理和TNF-α处理+TRAIL-siRNA转染组。采用MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot法检测髓核细胞Caspase-3的活性和表达。[结果]Tunel染色显示凋亡阳性细胞率退变组为48.92%,未退变组为5.23%;TRAIL蛋白表达阳性率退变组为49.11%,未退变组为12.25%,两组间的差异均有统计学意义(P0.05)。体外试验方面,相较于空白对照细胞,TNF-α处理细胞的增殖显著下降(P0.05),而凋亡率显著升高(P0.05),Caspase-3的表达显著升高(P0.05)。TRAIL siRNA转染对细胞增殖、凋亡、Caspase-3的表达无明显影响(P0.05),TNF-α处理后再用TRAIL-siRNA转染可显著逆转TNF-α对细胞增殖、凋亡和Caspase-3表现的影响(P0.05)。[结论]髓核TRAIL阳性表达细胞率与凋亡细胞率呈正相关,TRAIL沉默能显著逆转TNF-α诱导的髓核细胞增殖抑制、细胞凋亡及Caspase-3的表达。     

siRNA转染对大鼠髓核细胞TRAIL表达和细胞行为的影响

[目的]探讨siRNA转染对大鼠髓核细胞TRAIL表达和细胞行为的影响。[方法]采用弯曲鼠尾法建立椎间盘退变模型。处死动物。取退变椎间盘组织分离培养髓核细胞。P1髓核细胞分为4组,分别为空白对照组、TRAIL-siRNA转染组(siTRAIL组)、TNF-α处理组(TNF-α组)和TNF-α处理+TRAIL-siRNA转染组(TNF-α+siTRAIL组)。采用MTT法检测P1髓核细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot法检测髓核细胞Caspase-3的活性和表达。[结果]相较于空白对照细胞,TRAIL siRNA转染对细胞增殖、凋亡、Caspase-3的表达无明显影响(P0.05);TNF-α处理引发髓核细胞增殖显著下降(P0.05),而凋亡率显著升高(P0.05),Caspase-3的表达显著升高(P0.05)。TNF-α处理后再用TRAIL-siRNA转染可显著逆转TNF-α对细胞增殖、凋亡和Caspase-3表达的影响(P0.05)。[结论] TRAIL siRNA转染可沉默TRAIL表达,从而逆转TNF-α诱导大鼠髓核细胞增殖抑制、细胞凋亡和Caspase-3表达。     

BMSCs旁分泌对软骨细胞IL-1β损伤后的保护作用

目的研究BMSCs对于软骨细胞IL-1β损伤后的保护作用,以及BMSCs存在情况下软骨细胞对于IL-1β抵抗能力的变化。方法取SD大鼠6只随机分为实验组(制备膝关节软骨缺损)和对照组,6 h后取软骨组织行实时定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)和ELISA检测IL-1β基因表达和相对含量。BMSCs修复功能实验:取培养的18孔SD大鼠软骨细胞随机分为3组(n=6),空白组不作处理,损伤组和共同培养组细胞采用IL-1β干预后,共同培养组使用Transwell小室建立SD大鼠BMSCs与软骨细胞共同培养体系,采用q RT-PCR法测定软骨细胞含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)和含凝血酶敏感素基序的去整合素金属蛋白4(a disintegrin and metalloprotease with Thrombospondin motifs 4,ADAMTS-4)、ADAMTS-5 m RNA相对表达量,ELISA法检测各组Caspase-3含量,以及流式细胞术检测各组细胞凋亡率。BMSCs保护功能实验:将12孔软骨细胞分为2组(n=6),共同培养组置入含BMSCs的Transwell小室后,两组均采用IL-1β干预,检测指标同修复功能实验。结果动物体内损伤现象研究结果示,实验组IL-1βm RNA相对表达量和IL-1β相对含量均高于对照组(P0.05)。BMSCs修复功能实验结果示,损伤组和共同培养组Caspase-3、ADAMTS-4、ADAMTS-5 m RNA相对表达量及Caspase-3含量、细胞凋亡率均显著高于空白组,损伤组显著高于共同培养组,差异均有统计学意义(P0.05)。BMSCs保护功能实验结果示,共同培养组Caspase-3、ADAMTS-4、ADAMTS-5 m RNA相对表达量及Caspase-3含量、细胞凋亡率均显著低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论作为组织工程种子细胞的BMSCs同时具有抗炎、抗凋亡的应用潜质。     

TNF-α重组慢病毒对胃癌细胞自分泌杀伤作用的实验研究

目的探讨TNF-α重组慢病毒对胃癌细胞自分泌杀伤作用。方法 TNF-α重组慢病毒感染SGC-7901胃癌细胞为实验组,并设立阴性对照组以及空白对照组,采用RT-PCR检测3组细胞中TNF-αmR NA的表达情况,ELISA检测3组细胞上清液中TNF-α蛋白含量,流式细胞术检测3组细胞凋亡情况。结果 PCR实验观察到TNF-αmR NA荧光条带24h后稳定表达。测得三组培养液中TNF-α含量,实验组[(2.6926±0.7563)ng/ml]明显高于阴性对照组[(0.9326±0.3091)ng/ml]和空白对照组[(0.8552±0.2768)ng/ml],且差异均有统计学意义(P均0.01),而阴性对照组和空白对照组之间差别无统计学意义(P0.05)。在流式细胞实验中,实验组细胞凋亡率明显高于其他组,差异有统计学意义(P0.05),而阴性对照组和空白对照组差别无统计学意义(P0.05)。结论TNF-α重组慢病毒可以感染SGC-7901胃癌细胞,并在胃癌细胞中稳定表达并自分泌TNF-α,诱导杀伤胃癌细胞。     

精索静脉曲张大鼠睾丸低氧与生精细胞凋亡的研究

目的 观察实验精静索静咏曲张(varicocele,VC)大鼠睾丸低氧诱导因子1α(HIF-1α)的表达与睾丸生精细胞凋亡的关系,探讨VC导致不育的病理生理机制.方法 40只大鼠,随机分为3组.建立模型49d后,取其左侧睾丸组织,检测睾丸组织的HIF-1α的表达和生精细胞的凋亡率.结果 westernblot和免疫组化检测的实验组睾丸HIF-1α的表达(2.529±1847,78.57%)显著高于对照组(0.308±0.165,14.29%)和假手术组(0.309±0.164,0.00%)(P<0.05),差异均具统计学意义;实验组睾丸细胞凋亡指数(20.79±5.70)显著低于对照组(0.6±1.4)和假手术组(0.36±0.71)(P<0.001),差异均具统计学意义;实验组睾丸HIF-1α的表达与其细胞凋亡指数呈正相关(r=0.844,P=0.017).结论 VC可引起睾丸低氧,而低氧可以通过诱导生精细胞凋亡来引起睾丸功能的改变.同时,HIF-1α是一种预测生精细胞凋亡程度的有用指标.     

FTY720-P对MC3T3-E1细胞分化成熟的作用研究北大核心CSCD

目的探讨FTY720-P对MC3T3-E1细胞分化成熟的作用。方法取MC3T3-E1细胞,分为实验组和对照组。实验组以400 ng/mL FTY720-P(以氯仿为溶剂)作用于细胞,建立体外诱导成骨分化模型;对照组培养基中仅加入氯仿。培养48 h后,倒置相差显微镜观察两组细胞形态;免疫荧光染色检测两组成骨细胞相关蛋白Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达;ALP染色及茜素红染色观察两组成骨细胞形成情况及矿化结节形成情况;TUNEL荧光法检测两组细胞凋亡情况。结果培养48 h后,可见两组细胞均已长满瓶底,呈梭形,细胞形态无明显差异。免疫荧光染色显示,实验组Ⅰ型胶原蛋白表达呈阳性,对照组呈弱阳性;实验组的Ⅰ型胶原蛋白积分吸光度(IA)值为187 600±7 944,显著高于对照组的14 230±1 070,差异有统计学意义(t=43.680,P=0.001)。实验组和对照组Ⅲ型胶原蛋白表达均呈弱阳性,两组Ⅲ型胶原蛋白IA值比较差异无统计学意义(t=1.976,P=0.119)。实验组细胞ALP染色和茜素红染色均呈阳性,而对照组均呈阴性。实验组TUNEL染色呈阳性,对照组呈阴性;实验组TUNEL染色细胞阳性率为35.82%±2.99%,显著高于对照组的2.28%±0.51%(t=23.420,P=0.002)。结论 FTY720-P可以促进MC3T3-E1细胞成骨分化,加快细胞外基质成熟和矿化,且能影响细胞凋亡。