联合应用PARP-1与Caspase-3抑制剂对脊髓损伤大鼠神经细胞凋亡的影响

目的:探讨联合应用多聚腺嘌呤二核苷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-aminobenzamide,3-AB)和Caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK对脊髓损伤大鼠神经细胞凋亡的影响。方法:120只成年健康SD大鼠随机分为假手术组(A组)、模型组(B组)、PARP-1抑制剂组(C组)和联合用药组(D组),每组30只。以Allen′s打击法制备大鼠脊髓损伤模型,每组分别于造模后1d、3d、7d取5只大鼠行BBB评分,处死后利用免疫组化方法检测损伤部位脊髓内PARP-1、凋亡诱导因子(AIF)、Caspase-3及Bcl-2的表达;各时间点各组剩余大鼠处死后利用Western blotting检测PARP-1、Caspase-3蛋白表达水平,实时荧光定量PCR检测PARP-1、AIF、Caspase-3及Bcl-2的m RNA水平,采用原位末端标记(TUNEL)法检测神经细胞凋亡情况。结果:造模后1d时B、C、D组大鼠BBB评分均为0分;3d时三组间的评分无统计学差异;7d时D组及C组明显高于B组,且D组最高(P0.05)。免疫组化及Western blotting结果显示,脊髓损伤后1~7d,B组脊髓组织中PARP-1、AIF及Caspase-3表达逐渐增强,Bcl-2表达逐渐减弱(P0.05);与B组比较,D组及C组的PARP-1、AIF、Caspase-3表达均显著降低,且D组最低(P0.05);而D组及C组的Bcl-2表达显著高于B组,且D组最高(P0.05)。实时荧光定量PCR检测各目的基因表达水平与其蛋白水平一致。TUNEL结果显示,B组脊髓损伤后3d凋亡细胞最多,7d时数量减少,但仍保持在较高水平(P0.05);D组及C组凋亡细胞指数均显著低于B组,且D组最低(P0.05)。结论:联合应用PARP-1抑制剂3-AB和Caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK可有效抑制大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡,其机制可能与PARP-1、AIF、Caspase-3的表达抑制及Bcl-2的表达上调有关。     

大鼠脊髓损伤后不同时期移植人脐带间充质干细胞的修复效果观察

目的:观察大鼠脊髓损伤后不同时期局部移植人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchy-mal stem cells,hUCMSCs)修复脊髓损伤的效果,探讨hUCMSCs局部移植治疗脊髓损伤(spianl cord injury,SCI)的最佳移植时机。方法:雌性Wistar大鼠80只,随机均分为A、B、C、D组,以Impactor Model-Ⅱ打击器制备脊髓胸10(T10)损伤模型。A组为单纯损伤组,B组损伤后3d移植hUCMSCs,C组损伤后1w移植hUCM-SCs,D组损伤后3w移植hUCMSCs,分别于造模后24h、移植前1d及移植后8w(A组与D组损伤后相应时间点相同)每周对各组大鼠后肢功能进行行为学评分(BBB评分);移植后8周免疫组化染色观察移植细胞的存活、分化和血管再生情况,10周时用生物素葡聚糖胺(biotin dextran amine,BDA)示踪皮质脊髓束(corticospinaltract,CST)观察轴突的再生情况。结果:SCI后24h各组大鼠BBB评分无显著性差异(P0.05),D组在移植前和移植后1周与A组相应时间点的BBB评分无显著性差异(P0.05),移植后2w起各时间点评分均明显高于A组相应时间点,差异有统计学意义(P0.05);A组在SCI后9w时到达平台期,与实验结束时相比差异无统计学意义(P0.05)。移植各组移植后BBB评分逐渐上升,后一个时间点与同组前一时间点比较差异有显著性意义(P0.05),移植后6w开始C组明显高于B、D组(P0.05)。免疫组化染色A组脊髓中未见Brdu阳性细胞,损伤区血管形态欠完整,未见新生血管;损伤周围星形胶质细胞大量增生,细胞肥大、突起增多、排列不规则,形成胶质瘢痕;未见BDA标记的皮质脊髓束通过损伤区。B、C、D组脊髓中均有Brdu阳性标记的细胞存活,C、D组中细胞数量明显多于B组,但三组中均未见到移植细胞向神经元或神经胶质样细胞分化;B、D组损伤周围的星形胶质细胞较A组减少,但排列仍欠规则;C组损伤周围星形胶质细胞形态趋于正常,排列规则,且有大量星形胶质细胞通过损伤区,血管再生数目及通过损伤区的皮质脊髓束神经纤维也明显多于B、D组。结论:大鼠SCI后局部移植的hUCMSCs能长期存活,抑制胶质瘢痕形成,改善后肢运动功能;SCI后1w移植的效果优于SCI后3d和3w时移植的效果。     

粒细胞集落刺激因子动员BMSCs归巢治疗大鼠脊髓损伤的疗效观察

目的观察粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor,G-CSF)动员BMSCs归巢对大鼠脊髓损伤的治疗效果,评估G-CSF动员BMSCs治疗脊髓损伤的可行性。方法将24只成年健康雌性SD大鼠术前12 h于鼠尾静脉注射绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标记的BMSCs(GFP-BMSCs),并随机分为假手术组(A组)、假手术+G-CSF组(B组)、脊髓损伤组(C组)、脊髓损伤+G-CSF组(D组),每组6只。C、D组采用T10水平脊髓半切法建立脊髓损伤模型,A、B组仅行椎板切除,不损伤脊髓;术后1 h B、D组分别注射G-CSF(10μg/kg·d),连续注射3 d;A、C组注射等量生理盐水。术后1、3、7、14、21、28 d采用BBB评分行大鼠双后肢神经功能评估,并采用ELISA法检测血清TNF-α和基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1,SDF-1)表达。术后28 d处死大鼠取脊髓样品行免疫组织化学染色观察细胞因子SDF-1、BDNF、VEGF和TNF-α表达,免疫荧光染色观察GFP-BMSCs阳性细胞及双染荧光黄色的GFP/神经元核抗原(neuronal nuclei,NeuN)阳性神经元细胞和GFP/胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)阳性神经胶质细胞数;并采用TUNEL法检测细胞凋亡。结果术后各时间点A、B组BBB评分较术前无明显变化;术后1 d,C、D组BBB评分降至最低,后逐渐上升。除术后1 d外,其余各时间点D组BBB评分均显著高于C组(P0.05)。术后3、7、14、21、28 d,C、D组TNF-α和SDF-1含量均明显高于A、B组(P0.05);但D组各时间点TNF-α含量显著低于C组,SDF-1含量显著高于C组(P0.05)。免疫组织化学染色示,术后各时间点C、D组SDF-1、BDNF、VEGF和TNF-α表达均显著高于A、B组(P0.05);D组SDF-1、BDNF、VEGF表达显著高于C组,TNF-α表达显著低于C组(P0.05)。免疫荧光染色示,C、D组GFP-BMSCs、GFP/NeuN、GFP/GFAP阳性细胞数均显著多于A、B组,D组显著多于C组,差异均有统计学意义(P0.05)。TUNEL法检测示,C、D组凋亡细胞数目显著低于A、B组,D组显著低于C组,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 G-CSF可以动员BMSCs归巢至大鼠脊髓损伤部位并参与修复,其作用可能与其下调TNF-α减少细胞凋亡,上调SDF-1、BDNF、VEGF促进BMSCs迁移有关。     

大鼠急性脊髓损伤后Caspase-3、Cathepsin B的表达

[目的]研究大鼠急性脊髓损伤后Caspase-3、Cathepsin B的表达,并初步探讨Caspase-3、Cathepsin B在脊髓损伤后表达的意义.[方法]将78只成年健康SD大鼠按Nystrom法建立大鼠脊髓(T8 、T9)急性压迫损伤模型, HE染色观察脊髓组织病理学变化,免疫组化测定各时间点Cathepsin B、Caspase-3 的表达变化,原位末端脱氧核糖核酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸(dUTP) 标记法(TUNEL 法) 检测神经细胞的凋亡水平.[结果]免疫组化结果显示正常及假手术组大鼠脊髓神经细胞中Caspase-3,Cathepsin B,TUNEL阳性细胞较少;在脊髓损伤后3 d Cathepsin B阳性细胞数明显增多,5 d达高峰,7 d未见明显衰减.Caspase-3阳性细胞数在脊髓损伤后8 h明显增多,3 d达高峰,7 d表达减弱.TUNEL阳性细胞数也在8 h明显增多,3 d达高峰,7 d表达减弱.Cathepsin B阳性细胞形态及表达的部位均与Caspase-3阳性细胞、TUNEL阳性细胞差别较大.[结论]Caspase-3参与了脊髓损伤细胞凋亡的调节,Cathepsin B则可能通过炎性细胞为媒介参与了脊髓继发性损伤.     

芒果苷对大鼠急性脊髓损伤的保护作用及相关机制研究

目的探讨芒果苷对大鼠急性脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的保护作用并分析其相关机制。方法成年雄性SD大鼠90只,体质量250~300 g,随机分为假手术组(A组)、SCI组(B组)、10 mg/kg芒果苷处理组(C组)、25 mg/kg芒果苷处理组(D组)、50 mg/kg芒果苷处理组(E组),每组18只。B、C、D、E组采用Allen法(60 g/cm)建立大鼠T9 SCI模型,A组仅切除T8~10椎板;C、D、E组术后每天按照10、25、50 mg/kg剂量腹腔注射芒果苷,共注射30 d;A、B组于对应时间点注射等量生理盐水。术后观察大鼠存活情况,于24、48、72 h采用BBB评分评价大鼠后肢运动功能;72 h时取损伤节段脊髓测量其水含量,ELISA检测氧化应激反应因子丙二醛(malondialdehyde,MDA)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、过氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH)以及炎性因子NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6活性;30 d时取损伤节段脊髓采用ELISA法检测Caspase-3、9活性,Western blot检测凋亡蛋白Bax、Bcl-2表达,组织学观察脊髓组织形态,免疫组织化学染色观察Caspase-3蛋白表达。结果术后各组大鼠均存活至实验结束。B、C、D、E组BBB评分均显著低于A组,B、C、D、E组评分呈逐渐增高趋势,组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。B、C、D、E组脊髓水含量均显著高于A组,B、C、D、E组水含量呈逐渐降低趋势,组间比较差异有统计学意义(P0.05)。ELISA检测示,B、C、D、E组MDA、NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6、Caspase-3、Caspase-9活性均显著高于A组,B、C、D、E组均呈逐渐降低趋势;而CAT、SOD、GSH活性均显著低于A组,B、C、D、E组均呈逐渐增加趋势;以上指标组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。Western blot示,B、C、D、E组Bax蛋白表达明显高于A组,B、C、D、E组表达呈逐渐降低趋势;Bcl-2蛋白表达明显低于A组,B、C、D、E组表达呈逐渐增高趋势;组间比较差异有统计学意义(P0.05)。组织学观察示B组脊髓组织符合SCI病理改变,C、D、E组神经坏死程度较B组好转,并且E组效果优于D组,D组优于C组。免疫组织化学染色观察,B、C、D、E组Caspase-3蛋白表达量显著高于A组,B、C、D、E组呈逐渐降低趋势(P0.05)。结论对于大鼠急性SCI,芒果苷可通过减轻脊髓组织水肿、抑制氧化应激反应及炎性反应,调节Bax、Bcl-2蛋白表达,从而发挥神经保护作用。     

抑制TNFR/RIPK信号通路对大鼠急性脊髓损伤后神经功能的影响

目的 :探讨应用坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1(Nec-1)抑制TNFR/RIPK介导的坏死性凋亡信号通路对大鼠急性脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的作用。方法:72只雄性SPF级SD大鼠,体重0.25~0.30kg,随机分为4组:假手术组(Sham组,A组)、假手术+Necrostatin-1组(Sham+Nec-1组,B组)、SCI+二甲基亚砜(DMSO)(DMSO组,C组)、SCI+Nec-1组(Nec-1组,D组)。C、D组采用钳夹法制作大鼠急性SCI模型。所有大鼠硬膜下置管,A组不给药,B组和D组造模后30min经导管注射1μl Nec-1(25μg/μl),C组注射等量DMSO,1次/d,至取材时间点。各组分别于造模后12h、24h和3d三个时间点每组取6只大鼠,先行Basso/Beattie/Bresnahan(BBB)评分,再处死动物取脊髓组织。12h时间点动物处死前1h腹腔注射碘化丙啶(propidine iodide,PI)1mg/kg,取材检测脊髓组织PI红染细胞数;24h时取材采用苏木素-伊红(HE)染色观察脊髓损伤情况、尼氏(Nissl)染色观察神经元存活数目、Western Blot(WB)检测Bcl-2、坏死性凋亡蛋白RIPK1及RIPK3的表达水平;3d时取材行Tunel染色观察细胞凋亡情况。结果:造模后A组和B组各时间点的BBB评分均正常,C、D组各时间点均显著性低于A、B组,D组各时间点的BBB评分均显著高于同时间点C组(P0.05)。造模后12h,D组PI红染细胞较C组明显减少,神经元崩解减轻(P0.05)。造模后24h,A组和B组脊髓组织HE和Nissl染色正常,D组脊髓组织损伤程度和存活神经元数量均优于C组,差异有统计学意义(P0.05);A组和B组Bcl-2、RIPK1及RIPK3均低水平表达,C组RIPK1及RIPK3表达显著性升高,D组Bcl-2表达较C组上调,RIPK1及RIPK3表达显著性下降,C、D两组比较差异均有统计学意义(P0.05)。造模后3d,A组和B组可见少量凋亡小体,C组和D组明显增多,但D组凋亡小体数量较C组明显减少(P0.05)。结论:抑制TNFR/RIPK信号通路可以减轻大鼠急性SCI后的病理变化,改善行为学评分,促进脊髓神经功能恢复。     

重组人红细胞生成素治疗大鼠急性脊髓损伤的用药时间窗探讨

目的:探讨腹腔注射重组人红细胞生成素(rHuEPO)治疗大鼠急性脊髓损伤(ASCI)的用药时间窗.方法:采用显微血管夹夹伤雌性SD大鼠T10脊髓建立脊髓急性损伤模型,将造模成功后的40只大鼠随机分为A、B、C、D、E组,每组8只.A、B、C、D组分别于损伤后即刻、1h、3h和6h腹腔注射rHuEPO 50001U/kg,E组损伤后立即腹腔注射等量生理盐水,作为对照组.各组大鼠于术后1d、3d、5d、7d进行BBB运动学评分,并于术后3d、7d用TUNEL染色和caspase-3免疫组化染色法检测各组大鼠脊髓神经细胞凋亡情况.结果:术后1d、3d各组大鼠BBB评分无统计学差异(P>0.05);5d时A、B、C三组BBB评分均高于D、E两组(P<0.01),A、B、C 三组间与D、E组间无统计学差异(P>0.05);7d时D组BBB评分高于E组(P<0.01),但低于A、B、C三组(P<0.01),而A、B、C三组间无统计学差异(P>0.05).损伤后3d、7d,A～D组的TUNEL、caspase-3染色阳性细胞均高于E组,且损伤后7d时D组TUNEL染色阳性细胞数高于A、B、C三组(P<0.05),A、B、C三组间无统计学差异;损伤后3d.D组caspase-3染色细胞阳性率高于A、B、C三组(P<0.05),A、B、C三组间无统计学差异(P>0.05),损伤后7d,A～D组间无统计学差异(P>0.05).结论:大鼠ASCI后3h内给予rHuEPO可以显著改善运动功能恢复情况,并抑制伤后脊髓神经细胞凋亡现象的发生;伤后6h给药效果较差.     

表达VEGF的重组腺相关病毒对大鼠创伤性脊髓损伤的保护作用及其机制研究

目的探讨表达VEGF的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)对大鼠创伤性脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的保护作用及其机制。方法取144只成年雄性SD大鼠(体重200～250 g)随机分为4组,每组36只。假手术组(A组)仅手术暴露脊髓。模型对照组(B组)、rAAV-绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein,GFP)组(C组)、rAAV-hVEGF165-GFP组(D组)制备创伤性SCI大鼠模型,术后即刻分别予以20μL生理盐水、rAAV-GFP病毒、rAAV-hVEGF165-GFP病毒脊髓注射治疗。术后3、7 d采用BBB评分观察大鼠后肢运动功能变化;术后7 d通过脊髓组织尼氏小体染色观察脊髓组织病理学变化,脊髓组织神经元透射电镜检测及TUNEL凋亡细胞染色观察脊髓神经元凋亡,Western blot检测水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP-4)表达;术后1、3、5、7 d ELISA法检测VEGF165蛋白表达。结果 BBB评分显示术后3、7 d D组神经功能较B、C组显著改善(P<0.05)。尼氏小体染色显示术后7 d D组脊髓组织结构破坏明显轻于B、C组(P<0.05)。ELISA检测显示D组VEGF165蛋白表达呈低剂量缓释表达,术后3、5、7 d,D组VEGF165蛋白表达均高于其他3组(P<0.05)。透射电镜检测及TUNEL凋亡细胞染色结果显示术后7 d D组脊髓神经元凋亡较B、C组显著减少,凋亡率显著低于B、C组(P<0.05)。Western blot结果显示术后7 d D组脊髓组织AQP-4蛋白表达明显较B、C组减少(P<0.05)。结论表达VEGF的rAAV通过抗神经元凋亡及减轻脊髓水肿对大鼠创伤性SCI起保护作用。     

神经干细胞单细胞与神经球治疗大鼠脊髓损伤的对比研究

目的比较神经干细胞(neural stem cells,NSCs)单细胞与神经球移植治疗大鼠脊髓损伤(spinal cordinjury,SCI)的效果,研究两种NSCs移植方法治疗SCI的有效性。方法取成年SD大鼠2只,体外分离脊髓组织并行NSCs培养,取第3代细胞行Hoechst33342、巢蛋白染色及贴壁分化鉴定。另取成年SD大鼠(体重230～250 g)60只,随机分为3组,每组20只,采用改良Allen法制备大鼠脊髓T10损伤模型。各组分别于SCI处缓慢注射5μL生理盐水(A组)、第3代NSCs单细胞(B组)、第3代NSCs神经球(C组)。分别于术前及术后3、7、14、21、28 d采用BBB行为功能评定量表评定各组大鼠后肢功能;术后各时间点取材行HE染色和微管相关蛋白2(microtubule-associated protein 2,MAP-2)免疫组织荧光染色观察。结果经形态学观察及鉴定,所培养的细胞为NSCs。术后3 d各组BBB评分较术前显著下降,术后3、7 d各组间BBB评分比较差异均无统计学意义(P>0.05);随时间延长BBB评分不同程度增加,术后14、21、28 d,B、C组BBB评分优于A组,C组优于B组,比较差异均有统计学意义(P<0.05)。HE染色示C组较A、B组脊髓结构清晰,瘢痕形成少。MAP-2免疫组织荧光染色示,术后3、7 d各组间阳性细胞数比较差异均无统计学意义(P>0.05);术后14、21、28 d,B、C组阳性细胞数显著多于A组,C组多于B组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论采用NSCs神经球移植较单细胞移植更明显促进NSCs向神经元分化,更有利于SCI后下肢功能恢复。     

胶原支架结合脑源性神经营养因子移植促进全横断脊髓损伤大鼠轴突再生及运动功能恢复的研究

目的评价胶原支架结合脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)移植修复大鼠全横断脊髓损伤的效果。方法将32只成年雌性SD大鼠随机分成4组(n=8):A组为假手术组,只暴露T_9、T_(10)段脊髓;B、C、D组切除长4 mm的T_9、T_(10)段脊髓后,C、D组分别于损伤处植入相应长度的线性有序胶原支架(linear ordered collagen scaffolds,LOCS)和结合了胶原结合结构域(collagen binding domain,CBD)-BDNF的LOCS。术前及术后3个月内每周对大鼠进行BBB运动功能评分。术后3个月,实施神经电生理检测各组大鼠运动诱发电位(motor evoked potential,MEP);然后于L_2段脊髓组织注射荧光金(fluorogold,FG)实施逆行示踪,1周后取大鼠大脑及胸、腰段脊髓组织,脱水后观察脊髓组织形态;取包含损伤区的胸、腰段脊髓组织作切片。其中,脊髓冠状切片于激光共聚焦显微镜下进行观察,计算FG阳性细胞积分吸光度(IA)值;胸段脊髓组织水平切片采用免疫荧光染色,观察全横断脊髓损伤造模情况、脊髓损伤区轴突再生情况、D组再生轴突的突触形成情况。结果术后各时间点B、C、D组BBB评分均显著低于A组(P0.05);术后2～12周D组BBB评分均明显高于B、C组(P0.05)。电生理检测示,B组未观测到MEP;C、D组MEP潜伏期显著长于A组,C组显著长于D组,差异均有统计学意义(P0.05)。脊髓组织形态观察示,B组脊髓损伤区域向两端延伸,损伤部位组织破坏严重;C、D组脊髓形态恢复较好,D组更接近正常组织形态。逆行示踪结果显示,各组大鼠损伤区以下的腰段脊髓灰质中均充满了FG阳性细胞;在损伤区以上的胸段脊髓中,A组FG阳性区域IA值显著大于B、C、D组(P0.05),C、D组大于B组(P0.05),C、D组间差异无统计学意义(P0.05)。免疫荧光染色示,自同一脊髓背侧至腹侧选出的组织切片显示了明显异于正常组织的全横断脊髓损伤区域。A组NF阳性轴突数明显多于B、C、D组,C、D组多于B组,D组多于C组,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 LOCS结合CBD-BDNF移植可以促进大鼠全横断脊髓损伤后轴突再生以及后肢运动功能恢复。     

单唾液酸四己糖神经节苷脂乳酸/羟基乙酸共聚物微球对大鼠脊髓损伤后神经功能的影响

目的：探讨经蛛网膜下腔注入单唾液酸四己糖神经节苷脂（monosialotetrahexosylgangliosides,GM-1）乳酸/羟基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid,PLGA）微球对大鼠脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）后神经功能的影响。方法：94只成年SD大鼠随机分为4组：微球治疗组（A组）、普通GM-1制剂治疗组（B组）和损伤对照组（C组）各30只,正常对照组（D组）4只。A、B、C组大鼠采用Nystrom法制备T10脊髓压迫损伤模型,伤后即刻开始给药,A组大鼠经蛛网膜下腔一次性注入20μlGM-1PLGA微球悬液（含GM-150μg）,B组大鼠伤后至处死前每24h一次经尾静脉注入GM-1普通制剂30mg/kg,C组大鼠经蛛网膜下腔一次性注入20μl生理盐水,D组大鼠不手术、不给药。A、B、C组大鼠于术后1、3、7、14d进行脊髓运动功能（BBB）评分,术后1、7、14d检测运动诱发电位,术后8h、1d、3d、7d、14d检测大鼠脑脊液中GM-1含量;术后8h、1d、3d、7d、14d处死动物（n=6）,取T10节段脊髓并切片,用HE染色观察脊髓组织学变化,用免疫组化染色方法检测SCI后14d时损伤脊髓组织中NF200表达情况。D组上述各指标的检测不分时间点,只进行1次。结果：各时间点A、B、C组大鼠BBB评分均显著低于D组（P〈0.01）,术后3d、7d、14d时A、B组显著高于C组（P〈0.01）,各时间点A组与B组无显著性差异（P〉0.05）。各时间点A、B、C组大鼠运动诱发电位N1波潜伏期较D组明显延长、波幅明显降低（均P〈0.01）,但术后1d和7d时A、B组N1波潜伏期明显较C组短（P〈0.01）,术后7d和14d时A、B组N1波波幅明显较C组高（P〈0.01）,各时间点A组与B组比较无显著性差异（P〉0.05）。各时间点A、B组大鼠脑脊液内GM-1含量均显著高于C组和D组（均P〈0.01）,术后8h、1d、3d时A组明显高于B组（P〈0.01或0.05）,术后7、14d时A组与B组比较无显著性差异,C组和D组比较无显著性差异（P〉0.05）。HE染色,D组正常,术后各时间点A、B组大鼠脊髓损伤区组织形态优于C组,而A组与B组大鼠脊髓损伤区组织形态基本相似。A组、B组和C组大鼠SCI后14d损伤脊髓组织中NF200阳性细胞平均光密度（AOD）值均显著低于D组（P〈0.01）,但A、B组均显著高于C组（P〈0.01）,A组和B组间无显著性差异。结论：经蛛网膜下腔注入GM-1PLGA微球对大鼠脊髓损伤后神经功能具有良好的保护作用,与外周应用普通GM-1制剂比较,能减少药物用量,快速提高局部药物浓度,并较长时间维持稳定,提高生物利用率,且疗效相当。     

全反式维甲酸干预鼠胚神经干细胞联合胶质细胞源性神经营养因子及硫酸软骨素酶ABC移植修复大鼠脊髓损伤的研究

目的探讨全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)干预培养的鼠胚神经干细胞(neural stem cells,NSCs)联合胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line derived neur otrophic factor,GDNF)、硫酸软骨素酶ABC(chondroitinase ABC,Ch ABC)移植治疗大鼠脊髓损伤的效果。方法取健康成年雌性SD大鼠60只,体重200~250 g,随机分为5组(n=12),分别为假手术组(A组)、损伤对照组(B组)、NSCs+GDNF移植组(C组)、NSCs+Ch ABC移植组(D组)、NSCs+GDNF+Ch ABC移植组(E组)。B~E组于T10平面横断脊髓建立脊髓全横断损伤模型,A组仅显露硬脊膜但不损伤脊髓。于术后第8天将Brd U标记的ATRA干预培养的鼠胚NSCs移植至C、D、E组大鼠,第8~14天C~E组每天对应给予10μL GDNF、10μL Ch A BC,A、B组给予等量生理盐水。术后观察大鼠一般情况;于术前1 d、术后7 d及移植后1、2、5、8周采用BBB评分评估大鼠双后肢运动功能,采用体感诱发电位(somatosensory evoked potentials,SEP)评估神经传导功能。移植8周处死各组大鼠,取移植节段脊髓行HE染色和免疫荧光染色观察。结果造模术后共5只大鼠死亡,均补充。造模术后各时间点,B~E组大鼠BBB评分均较A组降低,SEP潜伏期均较A组延长,差异有统计学意义(P0.05);造模术后7 d、移植后1周时,B~E组组间BBB评分、SEP潜伏期比较,差异无统计学意义(P0.05);移植2、5、8周,C~E组大鼠双后肢功能逐步恢复,各时间点BBB评分均高于B组,SEP潜伏期均短于B组,差异有统计学意义(P0.05);移植5、8周,E组BBB评分高于C、D组,SEP潜伏期短于C、D组,差异有统计学意义(P0.05)。HE染色示,A组灰、白质分界清楚,细胞排列规则;B组损伤区血管形态欠完整,细胞排列紊乱,可见囊腔及胶质瘢痕形成;C~E组细胞增生明显,坏死囊腔较B组小。免疫组织荧光染色示,A、B组未见明显Brd U标记阳性细胞;C、D、E组Brd U阳性细胞胞体呈橘红色,E组阳性细胞多于C、D组(P0.05)。C~E组神经胶质纤维酸性蛋白阳性细胞少于A、B组,E组少于C、D组,差异均有统计学意义(P0.05)。C~E组抗微管相关蛋白2阳性细胞多于A、B组,E组多于C、D组,差异均有统计学意义(P0.05)。结论经ATRA干预培养的NSCs联合GDNF及Ch ABC移植对大鼠脊髓损伤再修复的促进作用优于NSCs分別联合GDNF、Ch ABC,提示GDNF、Ch ABC在治疗脊髓损伤修复过程中具有协同作用。     

罗西格列酮对脊髓损伤大鼠神经功能恢复的作用及机制

目的:观察罗西格列酮对脊髓损伤(SCI)大鼠后肢运动功能恢复的作用,探讨其作用机制。方法:75只成年SD大鼠,应用Allen改良法制作大鼠T10SCI模型,随机分为A、B、C三组,每组25只,B、C组于损伤后5min、6h、24h腹腔注射罗西格列酮,C组在腹腔注射罗西格列酮前1h给予G3335,A组于相应时间点腹腔注射等体积生理盐水作为对照组。每组取6只大鼠于伤后1d、7d、2w、4w、6w时对后肢运动功能进行BBB评分;伤后3d每组取4只动物脊髓组织行免疫组织化学染色法检测核转录因子κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-κB)的表达;伤后1、3、5、7d和2w每组取3只应用Westernblot法检测脊髓组织中凋亡相关蛋白caspase-3和Bcl-2的表达。结果:伤后1d、7d时3组大鼠BBB评分均为0分,伤后2w开始B组BBB评分高于A组和C组,4w和6w时与A、C组比较有显著性差异(P0.05);伤后3d时三组NF-κB表达均为阳性,但B组平均光密度值明显低于A、C组(P0.05),B组与C组比较无显著性差异(P0.05);伤后各时间点B组caspase-3表达量均低于A组和C组(P0.05),而Bcl-2表达均高于A组和C组(P0.05),其差异均在伤后5d达到高峰,A组与C组同时间点比较无显著性差异(P0.05)。结论:罗西格列酮可促进SCI大鼠神经功能恢复,其机制可能与抑制炎症反应及细胞凋亡有关。     

银杏叶提取物对大鼠急性脊髓损伤后神经功能恢复的作用及其机制

目的:观察银杏叶提取物(EGb)对大鼠实验性脊髓损伤后组织结构及运动功能恢复的作用,探讨其对急性脊髓损伤的作用机制。方法:120只SD雄性大鼠,随机分为假手术组(A组)、损伤对照组(B组)、甲基强的松龙(MP)治疗组(C组)和EGb治疗组(D组),每组30只。B、C、D组用Allen′s法以50g·cm致伤大鼠T9脊髓制作损伤模型,B组为单纯脊髓损伤,不给药;C组为脊髓损伤后30min内,由腹腔注入MP30mg/kg;D组为术后至处死前每天腹腔给予EGb17.5mg/kg;A组只打开T9椎板,不打击脊髓,不给药。术后24h、3d、5d、7d、14d对大鼠进行脊髓运动功能(BBB)评分。于术后24h、3d、5d、7d、14d处死动物(n=6),取T9节段脊髓,切片苏木素-伊红(HE)染色观察脊髓大体组织结构变化,用免疫组织化学方法检测B细胞淋巴瘤/白血病基因-2(Bcl-2)和B细胞淋巴瘤/白血病基因伴随蛋白x(Bax)在脊髓前角运动神经元中的表达变化情况。结果:各时间点B、C、D组大鼠脊髓运动功能(BBB)评分均显著低于A组(P<0.01),伤后7d、14d时C、D组评分显著高于B组(P<0.05),各时间点C组与D组评分比较无统计学意义(P>0.05)。HE染色C组和D组大鼠脊髓损伤区较B组坏死程度轻、形成囊腔少,A组正常;1周后D组较C组片状出血灶少,神经细胞肿胀不明显。各时间点B、C、D组大鼠损伤脊髓前角运动神经元中Bcl-2阳性细胞数均显著高于A组(P<0.01),C、D组显著高于B组(P<0.01),7d、14d时D组显著高于C组(P<0.05);各时间点B、C、D组大鼠损伤脊髓前角运动神经元中Bax阳性细胞数均显著高于A组(P<0.01),C、D组显著低于B组(P<0.01),7d、14d时D组显著低于C组(P<0.01)。结论:EGb可能通过抑制Bax表达、提高Bcl-2表达,抑制脊髓损伤后神经元凋亡,在运动功能恢复、损伤脊髓组织保护上发挥其有益作用,1周后EGb仍能抑制脊髓损害后的继发性损伤。     

低氧诱导因子1α在继发性脊髓损伤中的时序性表达及意义

目的通过观察大鼠继发性脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)中低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor lα,HIF-lα)的表达规律,探讨其在继发性SCI发生、发展过程中的作用。方法 SD大鼠66只,雌雄不限,体重(250±20)g,随机分为正常对照组(A组,6只)、假损伤组(B组,6只)和SCI组(C组,54只)。A组不作任何处理;B组大鼠仅行椎板切除术;C组大鼠在椎板切除术后采用脊髓静压法建立T10静压SCI模型。A、B组于术后1h,C组于术后1、3、6、12h及1、2、3、7、14d各处死6只大鼠,取损伤区脊髓组织行HE染色,采用SABC法行免疫组织化学染色观察各组HIF-1α阳性表达情况并计数。结果各组动物均存活至实验完成。HE染色示,A、B组脊髓组织结构致密,细胞核圆而大、染色浅、核仁清晰。C组术后1～12h,损伤局部神经元核固缩,胞体缩小,胞质深伊红染色;1～3d,轴突肿胀,出现空泡,白质内神经髓鞘散乱、崩解破裂;7、14d,胶质细胞增生明显,损伤段脊髓变细,部分灰质崩解坏死,可见囊腔形成。免疫组织化学染色示,A组HIF-1α阳性细胞少,B组稍增多。C组术后1、3h,HIF-1α阳性产物开始增多,主要在脊髓前角神经元和少量胶质细胞中表达;术后1d达峰值,1～3d维持较高水平,此后逐渐减少;14d时仅可见少量白质中的胶质细胞。A、B组间HIF-1α阳性细胞数比较差异无统计学意义(t=1.325,P=0.137)。C组各时间点HIF-1α阳性细胞数均高于A、B组(P<0.05),C组各时间点间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 SCI后HIF-1α表达开始升高,与继发性SCI缺血缺氧密切相关,其表达规律与损伤时间具有相关性。     

BMSCs移植联合督脉电针对大鼠脊髓损伤后神经功能恢复的影响

目的 探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植联合督脉电针对大鼠脊髓损伤(SCI)后神经功能恢复的影响. 方法 从2011年3月至7月,采用全骨髓差速贴壁培养法进行SD大鼠BMSCs的体外分离与培养;利用多中心急性脊髓损伤打击器(MASCIS Impactor)建立大鼠T11脊髓损伤模型,建模成功后将大鼠随机分为4组:对照组(A组)、电针组(B组)、BMSCs移植组(C组)、联合组(D组).SCI后1周,C组与D组大鼠自尾静脉注射移植BMSCs悬液0.1 ml,A组与B组自大鼠尾静脉注射无血清的DMEM/F12培养液0.1 ml,B组与D组接受督脉电针治疗,1次/天.于SCI后1、2、4、8周采用BBB评分法进行后肢运动功能评分;于SCI后8周采用SEP检测脊髓传导功能,采用HE染色观察脊髓空洞大小,采用免疫组化染色检测神经丝蛋白(NF200)的表达.实验中获得的数据采用单因素方差分析. 结果 SCI后2、4、8周,与A组比较,B、C、D组BBB评分均显著升高,差异有统计学意义(P＜0.05);与B、C组比较,D组BBB评分升高更明显,差异有统计学意义(P＜0.05).SCI后8周,与A组比较,B、C、D组SEP潜伏期缩短、波幅增高,差异有统计学意义(p＜0.05);与R、C组比较,D组SEP潜伏期更短,波幅更高,差异有统计学意义(P＜0.05).SCI后8周,4组大鼠脊髓组织损伤区均可见组织结构紊乱,细胞肿胀,空泡变性,且损伤区均可见瘢痕组织及空洞形成,其中A组脊髓空洞最大,B组和C组次之,D组最小.SCI后8周,4组大鼠脊髓组织均有NF200阳性表达,与A组比较,B、C、D组NF200阳性表达增强,差异有统计学意义(P＜0.05);与B、C组比较,D组NF200阳性表达更强,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 BMSCs移植联合督脉电针对脊髓损伤大鼠神经功能恢复的促进作用更为显著,优于单纯BMSCs移植和督脉电针治疗.     

脊髓减压联合电针对急性上颈段重度脊髓压迫损伤影响的实验研究

目的:探究脊髓减压联合电针对急性上颈段重度脊髓压迫损伤大鼠的治疗效果和可能的作用机制。方法:SPF级Wistar大鼠30只随机分为5组(对照组A、B,实验组C、D、E),每组6只,采用经寰枕间隙置入球囊导管加压造成脊髓压迫损伤的方法构建脊髓损伤模型。A组无任何干预,空白对照,B组置入球囊导管后不加压,做假手术对照,C、D、E组加压48 h后松球囊脊髓减压,C组取百会、大椎穴进行电针干预,连续波,频率2 Hz,治疗时间15 min,持续治疗14 d,D组于大鼠尾静脉注射甲强龙进行甲强龙冲击治疗,E组不再行任何治疗干预。14 d后5组大鼠全部行腹主动脉取血和脊髓损伤组织取材,采用BBB评分法对5组大鼠的运动功能进行评价,ELISA法检测损伤组织及血清中血小板活化因子(platele-activating factor,PAF)的含量,Western blot法检测损伤组织中Caspase-9的表达。结果:BBB评分:对照组A、B在实验组压迫后1、48 h,实验组治疗后24 h,3、7、14 d等6个时间点上均为(21.000±0.000)分,实验组评分始终低于对照组,C、D组评分显著高于E组(P0.05),C、D组评分相近(P0.05)。ELISA法测PAF结果显示:A、B、D、E组血清中PAF浓度相近(P0.05),C组血清中PAF浓度较其余4组低(P0.05),A、B组组织中PAF浓度结果相近(P0.05),C组组织中PAF浓度较A、B组高(P0.05),D组组织中PAF浓度较A、B、C组高(P0.05),E组组织中PAF浓度较其余4组高(P0.05);Western blot法检测结果显示:A、B组Caspase-9的表达量相近(P0.05),C组表达较A、B组高(P0.05),D组表达量较A、B、C组高(P0.05),E组表达较A、B、C、D组高(P0.05)。结论:脊髓减压联合电针治疗急性上颈段重度脊髓压迫损伤较脊髓减压联合甲强龙和单纯脊髓减压效果更佳,其作用机制可能与降低脊髓损伤组织中PAF的含量与下调其Caspase-9蛋白的表达有关。     

鞘内注射米诺环素对神经病理性疼痛大鼠脊髓背角表达CD55的影响

目的观察鞘内注射米诺环素对神经病理性疼痛(neuropathic pain,NPP)大鼠脊髓背角表达CD55的影响,探讨在NPP发病机制中的作用。方法健康雄性SD大鼠,体重200～250g,选取鞘内置管成功的大鼠48只,采用随机数字表法,将大鼠随机均分为四组:假手术组(A组)、慢性坐骨神经损伤组(B组)、溶媒对照组(C组)和米诺环素组(D组)。A组大鼠分离坐骨神经干后逐层缝合,B组、C组和D组采用慢性坐骨神经损伤法制作NPP模型。D组于术前1d开始鞘内注射米诺环素50μg,每天1次,连续7d,C组在相同时点鞘内注射等容量生理盐水。于术前(T0)、术后1d(T1)、3d(T2)、7d(T3)测定大鼠热缩足潜伏期(TWL)和机械缩足阈值(MWT)。术后7d处死大鼠,取L4～L6段脊髓背角,用Western blot和免疫组化测定CD55蛋白细胞阳性数和光密度值。结果与T0时比较,T1～T3时四组大鼠TWL明显缩短、MWT明显降低(P0.05)。与A组比较,T2、T3时B组、C组和D组大鼠TWL明显缩短、T1～T3时MWT明显降低(P0.05),大鼠脊髓背角CD55阳性细胞数和光密度值明显减少(P0.05)。与D组比较,T2、T3时B组、C组大鼠TWL明显缩短、T1～T3时MWT明显降低(P0.05),大鼠脊髓背角CD55阳性细胞数和光密度值明显减少(P0.05)。结论鞘内注射米诺环素可增加大鼠脊髓背角中CD55蛋白的表达,大鼠脊髓中CD55蛋白的表达是NPP形成的重要因素。     

人尿液干细胞联合硫酸软骨素酶ABC对脊髓损伤后神经生长因子和脑源性神经营养因子表达的影响

目的探讨大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后,行人尿液干细胞(human urine-derived stem cells,h USCs)移植以及联合硫酸软骨素酶ABC(chondroitinase ABC,ch ABC)鞘内注射,对脊髓组织神经生长因子(nerve growth factor,NGF)及脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)的影响,以及其相关分子机制。方法取人尿液分离培养h USCs并鉴定。利用Allen法建立大鼠SCI模型;将60只大鼠随机分为5组(n=12),分别为假手术组(A组)、SCI组(B组)、SCI+h USCs组(C组)、SCI+ch ABC组(D组)、SCI+h USCs+ch ABC组(E组)。模型制备后10、20、30 d,利用BBB评分法评价大鼠下肢运动功能;30 d时取脊髓组织,采用实时荧光定量PCR检测及免疫组织化学染色观察NGF、BDNF表达情况,Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达。结果经鉴定,培养的细胞具有多向分化特性,为h USCs。SCI模型制备后10、20、30 d,B组下肢运动功能BBB评分均显著低于A、C、D、E组,C、D、E组显著低于A组,C、D组低于E组,比较差异均有统计学意义(P0.05)。实时荧光定量PCR及免疫组织化学染色检测示,模型制备后30 d,B组NGF、BDNF表达显著低于A、C、D、E组,C、D、E组显著低于A组,C、D组低于E组,比较差异均有统计学意义(P0.05);C、D组间比较差异无统计学意义(P0.05)。Western blot检测显示,B组Bax蛋白相对表达量明显高于A、C、D、E组,C、D、E组显著高于A组,C、D组高于E组,比较差异均有统计学意义(P0.05);B组Bcl-2蛋白相对表达量显著低于A、C、D、E组,C、D、E组显著低于A组,C、D组低于E组,比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论 h USCs对大鼠SCI具有修复作用,通过联合ch ABC可促进SCI修复,其机制可能是通过促进NGF和BDNF表达,抑制神经细胞凋亡,发挥保护作用。     

神经营养素-3对大鼠急性脊髓损伤后Bcl-2和Bax表达的影响

目的:观察神经营养素-3(NT-3)对大鼠急性脊髓损伤后B细胞淋巴瘤/白血病基因-2(Bcl-2)和B细胞淋巴瘤/白血病基因伴随蛋白x(Bax)表达的影响,探讨NT-3对脊髓损伤的作用及其可能的分子机制。方法:105只SD大鼠随机分为假手术组(A组)、损伤对照组(B组)和NT-3治疗组(C组),每组35只。B、C组用改良Allen′s法以30g·cm致伤大鼠T8脊髓制作损伤模型,C组经蛛网膜下腔导管于术后即刻、4h、8h、12h、24h、3d、7d注入NT-320μl(含NT-3200ng),B组在相同时间点给予等量生理盐水;A组打开椎板后蛛网膜下腔置管,不损伤脊髓,不给药。术后24h、3d、7d、14d对大鼠进行脊髓运动功能(BBB)评分。于术后4h、8h、12h、24h、3d、7d、14d处死动物(n=5),取T8节段脊髓,甲苯胺蓝(Nissl)染色观察脊髓前角运动神经元变化情况,用免疫组织化学方法检测Bcl-2和Bax在脊髓前角运动神经元中的表达变化情况。结果:各时间点C组和B组大鼠BBB评分均显著低于A组(P<0.01),但C组显著高于B组(P<0.05或0.01)。Nissl染色C组大鼠脊髓损伤区较B组出血少、残存神经元多,A组正常。各时间点C组和B组大鼠损伤脊髓前角运动神经元中Bax阳性细胞平均光密度(AOD)值均显著高于A组(P<0.01),但C组显著低于B组(P<0.05或0.01);各时间点C组和B组大鼠损伤脊髓前角运动神经元中Bcl-2阳性细胞AOD值均显著低于A组(P<0.01),但C组显著高于B组(P<0.05或0.01)。结论:NT-3可能通过抑制Bax表达,提高Bcl-2表达,抑制脊髓损伤后神经元凋亡,从而保护损伤的脊髓组织,这可能是NT-3对脊髓损伤具有保护作用的机制之一。