HBV rtA181T突变对Huh7细胞自噬的影响

目的探讨HBV逆转录酶区A181T(rtA181T)位点突变对Huh7细胞自噬的影响。方法 Huh7细胞分别转染1.3mer HBV野生型质粒(WT组)、1.3mer HBV rtA181T突变型质粒(181T组)及1∶1共转WT和rtA181T突变型质粒(WT+181T组)。Western Blot、免疫荧光检测细胞内HBV表面蛋白(HBs)表达水平,ELISA检测细胞外HBs Ag表达水平;Western Blot分析内源性自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)及P62表达水平,Real-time PCR检测自噬相关基因Atg5 mRNA、Beclin1 mRNA的转录水平;同时转染绿色荧光蛋白LC3后,免疫荧光检测自噬颗粒。计量资料多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。结果免疫荧光观察181T组、WT组及WT+181T组细胞内均有HBs表达,Western Blot结果显示181T组细胞内的HBs表达高于WT组和WT+181T组。ELISA检测3组细胞培养上清的HBs Ag水平差异有统计学意义(F=66.739,P0.001),其中181T组细胞外的HBs Ag水平(0.111±0.056)远远低于WT组(3.157±0.490)和WT+181T组(2.240±0.797)(P值均0.001);WT组、181T组和WT+181T组均可见LC3-Ⅱ自噬颗粒聚集,181T组LC3-Ⅱ表达水平高于WT组和WT+181T组,而P62水平低于WT组和WT+181T组,差异均有统计学意义(P值均0.05);181T组自噬相关基因Atg5 mRNA、Beclin1 mRNA转录水平均明显高于WT组和WT+181T组(P值均0.05)。结论 HBV rtA181T突变可导致HBs Ag分泌障碍,并增加Huh7细胞的自噬水平。     

抑制素对HCV复制的影响

目的研究抑制素(PHB)对HCV复制的影响。方法全长基因组HCV RNA体外转染人肝癌细胞系Huh7.5,构建HCV全基因组细胞模型,分别收集24、48、72、96 h培养上清液检测HCV拷贝数;间接免疫荧光实验检测HCV核心蛋白的表达;透射电镜观察HCV感染细胞Huh 7.5-HCV的超微结构改变,鉴定HCV全基因组细胞模型。采用实时定量PCR、Western Blotting方法研究PHB在Huh 7.5-HCV细胞中的表达情况。应用RNA干扰技术检测PHB对HCV RNA的复制情况。两组间比较采用t检验。结果鉴定结果显示,成功构建HCV全基因组细胞模型。HCV RNA转染Huh7.5细胞24和48 h后,PHB mRNA表达水平分别是13.41±1.35和16.45±1.76,与对照组(1.01±0.57和1.01±0.87)相比差异均有统计学意义(t值分别为29.540、31.361,P值均0.01);PHB蛋白表达水平亦显著高于对照组(P值均0.01)。PHB的RNA干扰质粒(shRNA-PHB)转染Huh7.5-HCV细胞24和48h后,HCV RNA的水平分别为64.32±5.49和84.45±7.06,显著高于对照组(shRNA-control组,10.52±1.57和16.34±2.97,t值分别为29.538、25.908,P值均0.01)。结论 Huh7.5-HCV细胞中PHB表达的升高可能与HCV RNA的感染有关,PHB蛋白对HCV RNA复制有一定的抑制作用。     

紫草素通过上调C-X-C基序趋化因子受体4促进细胞自噬加快糖尿病创面愈合的机制研究

目的探讨紫草素是否通过上调C-X-C基序趋化因子受体4(CXCR4)的表达调控细胞自噬促进糖尿病大鼠创面愈合。方法将24只Sprague-Dawley(SD)大鼠按照随机数字表法分成4组:对照组、糖尿病组、糖尿病+紫草素组和糖尿病+紫草素+干扰CXCR4的短发卡RNA(sh-CXCR4)组, 每组6只。通过腹腔注射链脲佐菌素构建糖尿病大鼠模型, 利用直径为1 cm的皮肤打孔器在大鼠背部建立溃疡模型。分别于创伤后第0、7、14和21天计算创面愈合率。于创伤后第21天, 采集皮肤组织, 进行HE染色和Masson染色分析创面病理变化, 采用CD31免疫组织化学法分析创面微血管密度以及Western blotting法检测创面组织CXCR4和细胞自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1和可溶性p62蛋白的相对表达量, 透射电镜观察自噬小体。组间比较采用单因素方差分析。结果与对照组相比, 糖尿病组大鼠创面愈合率(第21天分别为72.44%±6.21%和93.71%±6.76%)、创面组织新生血管和胶原沉积、微血管密度以及创面组织中CXCR4和细胞自噬相关蛋白LC3...     

丙型肝炎病毒核心蛋白活化内源性大麻素系统诱导不完全线粒体自噬

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白活化内源性大麻素系统诱导不完全线粒体自噬的机制。方法HepG2细胞或表达HCV核心蛋白的HepG2细胞与肝星状细胞(LX-2细胞)共培养。共培养后高效液相色谱-质谱联用技术检测2-AG水平,分光光度法测定检测线粒体呼吸链酶复合体活性,流式细胞仪检测细胞活性氧(ROS)水平,激光共聚焦显微镜检测Ca~(2+)浓度和线粒体膜电位,试剂盒检测线粒体丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量,蛋白质免疫检测大麻素受体1(CB1R)、蛋白激酶B(Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)和p62蛋白表达。计量资料采用t检验。结果与LX-2细胞和HepG2细胞共培养组相比,LX-2细胞和表达HCV核心蛋白HepG2细胞共培养组,2-AG水平增加,线粒体呼吸链酶复合体活性下降,ROS水平和Ca~(2+)浓度升高,线粒体膜电位下降,MDA升高而SOD下降,CB1R水平升高,p-Akt和p-mTOR表达下降,LC3-Ⅱ表达增加,而p62蛋白表达无明显差异。结论 HCV核心蛋白增加2-AG水平,上调CB1R表达;增加线粒体ROS水平和Ca~(2+)浓度,降低线粒体膜电位;下调Akt和mTOR活性引起不完全线粒体自噬。     

La、hVAP-33、eIF2B γ和HCV IRES特异性小干扰RNA抑制HCV的复制和表达

目的 证实La自身抗原、33kD人类囊相关膜蛋白(hVAP-33)和真核细胞翻译起始因子第3亚单位(eIF2B γ)是HCV在细胞内的协同感染因子,通过抑制Huh7细胞内这些因子的表达可抑制HCV复制和表达. 方法 分别设计合成3条HCV内部核糖体进入位点(IRES)的小干扰RNA(siRNAs),转染Huh7-HCV细胞后筛选出其中沉默效率最高的1条.以HCV假病毒感染Huh7细胞后48 h,分别以上述HCV IRES siRNA和之前试验中已经筛选出的La、hVAP-33和eIF2B γ特异性siRNAs单独或者不同组合转染Huh7-HCV细胞,利用荧光定量PCR方法检测HCV核心基因并计算△△CT值(相对定量法),比较不同siRNAs及组合对目的基因沉默的效率;同时以Western blot观察HCV核心蛋白表达量的差异.结果 La自身抗原与IRES特异性siRNA共转染对HCV表达的抑制效率最高,使HCV核心蛋白基因相对表达量下降了约41％;4种基因特异性siRNAs 对HCV在Huh7细胞中的复制和表达均有不同程度的抑制作用,La、hVAP-33和eIF2Bγ特异性siRNAs分别与IRES siRNA联合均较其单独转染对目的基因的抑制效率高.结论 可以认为La自身抗原、hVAP-33和eIF2Bγ是HCV在宿主细胞内的协同感染因子,通过对Huh7细胞内协同感染因子及HCV IRES基因沉默后可以显著减少HCV的表达.     

川楝素诱导K562细胞自噬性死亡的实验研究

目的研究川楝素诱导人慢性髓系白血病K562细胞自噬性死亡的作用及其机制。方法不同浓度川楝素处理K562细胞后,采用MTT法检测K562细胞的增殖情况,瑞氏染色观察细胞形态学,透射电镜观察K562细胞超微结构,免疫细胞化学法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅱ、Beclin1的表达。结果川楝素对K562细胞有明显增殖抑制作用,呈时间和浓度依赖性,P均<0.01。光镜下可见K562细胞数量减少,胞质出现大量空泡。30、50 nmol/L川楝素处理K562细胞后,透射电镜下可见典型的自噬体。免疫细胞化学法结果显示,K562细胞Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白表达较阴性对照组增强,P均<0.01。结论川楝素对K562细胞有显著的增殖抑制作用,川楝素可以诱导K562细胞发生自噬性细胞死亡,其作用机制可能与上调Beclin1、LC3-Ⅱ蛋白有关。     

内质网应激-自噬肝癌SMMC-7721细胞模型的复制及金刚藤的干预

背景内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)-自噬是肝癌细胞一种自我保护性机制.内质网(endoplasmic reticulum, ER)应激诱导剂二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)能诱导肝癌细胞ERS-自噬.课题组前期研究证实金刚藤具有抑制肝癌细胞的作用,那么肝癌细胞ERS-自噬是否影响金刚藤抑制肝癌细胞的作用尚不清楚.目的探讨ERS-自噬肝癌SMMC-7721细胞模型的复制及金刚藤的干预.方法ERS-自噬肝癌SMMC-7721细胞模型的复制:采用不同剂量的DTT(50、200、500μmol/L)处理SMMC-7721细胞24 h,设DTT 0μmol/L组为control组,透射电镜观察各模型组细胞自噬小体,运用western blot法测定各组细胞微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(microtubuleassociated protein 1 light chain 3-Ⅱ, LC3-Ⅱ)蛋白的表达.金刚藤对ERS-自噬肝癌SMMC-7721细胞存活率的影响:将SMM C-7721细胞分为空白组(control组)、金刚藤组(JGT组)、DTT+JGT组, control、JGT组分别给予空白血清、金刚藤含药血清处理, DTT+JGT组予DTT构建的ERS模型后给予金刚藤含药血清处理,采用CCK-8法检测细胞的存活率.结果 DTT(50、200、500μmol/L)组细胞的细胞质内均可见自噬小体,随着DTT浓度的增加,自噬小体数量逐渐增加, DTT 500μmol/L组可见大量自噬小体;各模型组细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达:与control组比较,DTT(50、200、500μmol/L)组细胞中自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达均显著升高(P均0.05);与DTT 200μmol/L组比较, 500μmol/L组LC3-Ⅱ蛋白的表达显著升高(P0.05).金刚藤对ERS-自噬肝癌细胞模型存活率的影响:JGT、DTT+JGT组细胞存活率均显著低于control组(P均0.05); JGT组细胞存活率显著低于DTT+JGT组(P 0.05).结论 DTT可诱导肝癌SMMC-7721细胞ERS-自噬;金刚藤可抑制SMMC-7721细胞的存活率, DTT诱导的ERS-自噬可抵抗金刚藤抑制SMMC-7721细胞的存活率.     

携带IFN—β基因的丙型肝炎病毒微型基因组构建及抑制病毒复制的效应

目的构建丙型肝炎病毒（HCV）反应性干扰素（IFN）-β的微型基因组及其抑制效应的初步评价。方法提取poly I：C刺激的淋巴细胞总RNA,RT-PCR扩增IFN-β基因,克隆入前期构建的HCV微型基因组pT7-5U△131-315rI3Urz;PCR并鉴定插入方向,将反向插入的质粒命名为pT7-5U△131-315rIFNI3Urz。将微型基因组5U△131-315rIFNI3URz克隆入pcDNA3.1载体,获得pCMV-5U△131-315rIFNI3URz。将体外转录的5U△131-315rIFNI3URz RNA转染Huh7.5BB7细胞,48 h后检测IFN-β的表达。将pCMV-5U△131-315rIFNI3URz转染Huh7.5 JFH-1细胞系,荧光实时定量PCR法测定细胞中HCV RNA。结果成功建立了Huh7.5JFH-1细胞系;含有IFN-β的微型基因组在复制子细胞和HCV感染细胞中可以特异表达IFN-β;携带IFN-β的HCV微型基因组可以降低细胞中病毒的RNA拷贝水平,具有一定的剂量依赖效应。结论反向插入IFN-β基因的HCV微型基因组进入HCV感染细胞内表达IFN-β并靶向抑制病毒的复制,为抗HCV感染研究提供了一个新的方法和思路。     

紫草素上调RIP1和RIP3表达诱导量引发肺腺癌A549细胞程序性坏死的机制

目的探讨紫草素诱导肺腺癌A549细胞死亡的作用机制。方法使用紫草素及人肺腺癌A549细胞系;通过MTT法来检测细胞活性;Annexin V/PI双染色法来检验细胞的死亡方式;应用Western印迹来检验程序性坏死相关蛋白水平变化;使用2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)探针来检测细胞内活性氧簇(ROS)水平变化。结果紫草素诱导肺腺癌A549细胞死亡与紫草素作用浓度相关;Annexin V/碘化丙啶(PI)双染色法表明紫草素作用后的肺腺癌A549细胞形态以坏死为主;紫草素处理后的肺腺癌A549细胞中受体相互作用蛋白酶(RIP)1和RIP3的水平升高(P0.001);但使用Nec-1和GSK后,紫草素对于肺腺癌A549细胞的杀伤作用均有所缓解(P0.001);DCHF-DA探针表明经紫草素处理后的A549细胞中ROS水平显著增高(P0.001),而用Nec-1、GSK及抗氧化抑制剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)后,ROS水平降低(P0.001)。结论紫草素诱使RIP1和RIP3的增高导致肺腺癌A549细胞程序性坏死。这为肺腺癌A549的治疗提供了新的理论支持。     

丙型肝炎病毒抑制DNA损伤修复相关基因生长阻滞和DNA损伤诱生蛋白45α的表达

目的 探讨HCV感染对DNA损伤修复相关基因生长阻滞和DNA损伤诱生蛋白45 α(GADD45 α)表达的影响. 方法 建立全基因HCV JFH1感染的Huh7,5.1细胞模型.用相对荧光定量PCR和Western blot分别检测HCV JFH1感染和未感染的Huh7.5.1细胞中GADD45 α mRNA和蛋白质的表达水平.组间数据比较用单因素方差分析.结果 HCV JFH1感染的Huh7.5.1细胞内有HCV RNA高水平复制及HCV NS5A蛋白质和核心蛋白的表达.与未感染Huh7.5.1细胞相比,HCV JFH1感染72h的细胞内GADD45αmRNA和蛋白质相对表达量均明显降低,分别为0.57±0.09比1.00±0.11和0.28±0.03比1.00±0.07,差异均有统计学意义(F值分别为75.407和560.04,P值均＜0.01). 结论 HCV下调GADD45 α的转录和蛋白质表达,影响DNA损伤修复,这可能是HCV感染致肝癌发生的机制之一.     

HCV非结构蛋白5A对HIV长末端重复序列影响的初步探讨

目的本研究拟探讨HCV非结构蛋白5A(NS5A)对HIV长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)影响,从而为HCV对HIV的影响提供实验依据。方法将构建的LTR启动子驱动的荧光素酶(Luc)报告基因表达质粒(pGL3-LTR-Luc)和含HCV NS5A基因的表达质粒pCNS5A共转染肝癌细胞株(Huh7细胞),采用免疫细胞化学技术、Western Blot及逆转录聚合酶链反应检测HCV NS5A蛋白及mRNA的表达;本实验分三组,将质粒pGL3-LTR-Luc(空白组)、质粒pRc/CMV+pGL3-LTR-Luc(对照组)、质粒pCNS5A+pGL3-LTR-Luc(实验组)分别转染Huh7细胞,48 h后收集细胞,采用Luc活性检测LTR的活性,以观察HCV NS5A对LTR的调控影响。所得荧光活性值以均数±标准差表示,采用Levene's方差齐性检验,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较行LSD-t检验。结果转染pcNS5A质粒的Huh7细胞质经RT-PCR及Western Blot检测,HCV NS5A mRNA及蛋白在细胞中获得表达。方差分析结果提示LTR荧光活性在三组间有明显的差异(F=7.876,P=0.002),进一步比较各组间的差异,结果提示共转染质粒pcNS5A+pGL3-LTR-Luc组的Huh7细胞中Luc相对活性(22 476±4471)明显高于单转染pGL3-LTR-Luc组(15 887±3039,P=0.002)及共转染质粒pRc/CMV+pGL3-LTR-Luc组(16 321±4162,P=0.008),差异有统计学意义。结论表达HCV NS5A的质粒pCNS5A成功转染至Huh7细胞;HCV NS5A蛋白能激活HIV LTR,提示HCV NS5A可能为HCV促进HIV复制的分子机制之一。     

miR-200c改善转化生长因子－β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化的机制

目的探讨miR-200c是否通过调节自噬缓解转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的肾小管上皮细胞纤维化。方法不同浓度(0、5、10、15、20、30 ng/ml)TGF-β1刺激HK2细胞48 h后倒置显微镜下观察细胞形态,CCK-8检测细胞增殖情况。选择致HK2细胞增殖最快的TGF-β1浓度(c)进行转染实验:细胞转染40 nmol/L无意义序列RNA(NC组);细胞转染40 nmol/L无意义序列RNA后c浓度TGF-β1处理细胞48 h(NC+T组);细胞转染40 nmol/L miR-200c mimics(M组);细胞转染40 nmol/L miR-200c mimics后c浓度TGF-β1处理细胞48 h(M+T组)。qRT-PCR检测miR-200c转染效率。Western blotting检测4组细胞Smad通路蛋白Smad2和Smad3、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、钙黏蛋白(E-cad)表达量,以及自噬相关蛋白LC3(包括LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值)和P62。结果 10 ng/ml的TGF-β1刺激HK2细胞48 h后增殖最快,镜下细胞形态由正常的卵圆形铺路石状变为长梭形,纤维化形态最明显。qRT-PCR显示M组miR-200c表达量是NC组(212.42±12.25)倍(t=24.41,P=0.000),说明转染有效。Western blotting结果显示,与NC组比较,NC+T组加入10 ng/ml TGF-β1的HK2细胞Smad2、Smad3和α-SMA表达量增加,E-cad蛋白表达量降低(P0.05)。与NC+T组比较,M+T组Smad2、Smad3和α-SMA表达量减少,E-cad表达量增加(P0.05),提示miR-200c表达增加抑制了纤维化。进一步发现,M组较NC组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平增加,P62表达水平降低,提示自噬活性增加;M+T组较NC+T组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达水平增加,P62表达水平降低,提示miR-200c表达升高缓解了纤维化程度。结论 miR-200c可能通过激活细胞自噬缓解TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化。     

应用感染性丙型肝炎病毒2a质粒制备小鼠丙型肝炎模型的初步研究

目的制备表达丙型肝炎病毒（HCV）2a型RNA的小鼠模型,为研究HCV高亲和力中和单克隆抗体在体内的病毒清除能力提供可行的动物模型。方法采用引进的HCV 2a型的质粒Jc1,体外表达HCV RNA后转染Huh7细胞,建立可持续感染的Huh7-Jc1丙肝细胞模型。然后以该细胞腹腔注射裸鼠,或以该细胞尾静脉注射裸鼠,并通过小鼠血液中HCV 2a的RNA水平检测,观察小鼠体内的HCV存留情况,以移植未转HCV的Huh7细胞和培养上清为阴性对照。结果建立了可表达HCV RNA和核心蛋白的Huh7-Jc1细胞,且该细胞模型具有一定感染能力,以其培养上清孵育Huh7细胞,可使后者也表达HCV RNA和核心蛋白。BALB/c-nu裸鼠腹腔或尾静脉移植Huh7-Jc1细胞后,裸鼠血清中可检测到HCV RNA的表达。结论显示利用Huh7-Jc1细胞可初步制备表达HCV的丙型肝炎小鼠模型,但高效、长久表达HCV的小鼠模型还有待进一步完善。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A影响p53抑制肝癌细胞甲胎蛋白表达的分子机制

目的了解丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)对p53抑制甲胎蛋白(AFP)基因表达的影响及分子机制。方法采用质粒转染技术及微粒体酶免疫法观察p53蛋白对Huh7肝癌细胞AFP表达的抑制作用及HCV NS5A对其抑制作用的影响;蛋白印迹实验观察HCV NS5A对p53蛋白表达的影响;谷胱甘肽转移酶沉淀实验鉴定HCV NS5A与p53蛋白能否相互作用形成复合物。结果转染pRc/CMV空质粒的Huh7细胞上清液AFP浓度为(14 322±2412)ng/ml,转染pCNS5A质粒的Huh7细胞上清液的AFP 浓度为(13 843±3218)ng/ml,两组问t=1.42,P>0.05;转染pC53-NS3质粒的Huh7细胞上清液的AFP 浓度为(10 241±1326)ng/ml,与上述两组比较,t值分别为2.41及2.38,P值均<0.05;pCNS5A和pC53- NS3共转染者AFP浓度为(14 582±1238)ng/ml,与pC53-NS3单独转染组比较,t=3.12,P<0.01; pCNS5A和pC53-NS3共转染者和pC53-NS3单独转染者Huh7细胞p53蛋白表达无变化。在谷胱甘肽转移酶沉淀实验中,加入谷胱甘肽-p53融合蛋白后出现HCV NS5A蛋白条带,而仅加入谷光甘肽者则未出现此条带。结论p53蛋白能抑制Huh7细胞AFP的表达,HCV NS5A能减轻p53蛋白对AFP表达的抑制作用。HCV NS5A不影响p53蛋白的表达但能与p53蛋白结合形成复合物是使p53功能失活的分子机制。     

Inhibition of hepatitis C virus replication by single-stranded RNA structural mimics

AIM: To examine the effect of hepatitis C virus (HCV) structural mimics of regulatory regions of the genome on HCV replication.METHODS: HCV RNA structural mimics were constructed and tested in a HCV genotype 1b aBB7 replicon,and a Japanese fulminant hepatitis-1 (JFH-1) HCV genotype 2a infection model.All sequences were computer-predicted to adopt stem-loop structures identical to the corresponding elements in full-length viral RNA.Huh7.5 cells bearing the BB7 replicon or infected with JFH-1 virus were trans...     

糖尿病大鼠主动脉自噬水平的变化及雷帕霉素的干预作用

目的观察糖尿病大鼠主动脉自噬水平的变化及雷帕霉素的干预作用,探讨雷帕霉素是否通过调节自噬、内质网应激和细胞凋亡对糖尿病大鼠主动脉产生保护作用。方法雄性SD大鼠用随机数字表法分为正常对照组、糖尿病组和雷帕霉素干预组。采用链脲佐菌素制备1型糖尿病大鼠模型。雷帕霉素干预组给予雷帕霉素2mg/(kg·d)灌胃。于实验第8周留取血标本,用于血生物化学指标和脂联素水平检测,然后处死动物并迅速取出胸主动脉和腹主动脉,测定主动脉Beclin1、微管相关蛋白轻链3(LC3)、p62、C/EBP同源蛋白(CHOP)、Caspase-12、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白表达。结果与正常对照组比较,糖尿病组大鼠血清脂联素水平显著降低(P0.05),主动脉壁增厚,内皮严重受损,主动脉Beclin1、LC3的mRNA和蛋白表达水平及Bcl-2mRNA表达水平显著降低(P 0. 05),主动脉p62、CHOP、Caspase-12和GRP78的mRNA和蛋白表达水平及Bax mRNA表达水平显著升高(P0.05)。与糖尿病组比较,雷帕霉素干预组大鼠血清脂联素水平显著升高(P0.05),主动脉组织病理改变显著减轻,主动脉Beclin1、LC3的mRNA和蛋白表达水平及Bcl-2 mRNA表达水平显著升高(P0.05),主动脉p62、CHOP、Caspase-12和GRP78的mRNA和蛋白表达水平及Bax mRNA表达水平显著降低(P0.05)。结论糖尿病大鼠主动脉组织自噬水平降低,雷帕霉素可能通过激活自噬和减轻内质网应激和细胞凋亡水平对糖尿病大鼠主动脉产生保护作用。     

羟基红花黄素A对缺血性心力衰竭大鼠心肌自噬及ERK1/2通路的影响

目的:探讨羟基红花黄素A(HSYA)对缺血性心力衰竭(IHF)大鼠心肌自噬及细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)通路的影响。方法:将72只大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照组(卡托普利组)、低剂量HSYA组(L-HSYA)、中剂量HSYA组(M-HSYA)、高剂量HSYA组(H-HSYA),每组12只。采用冠脉结扎法建立缺血性心力衰竭大鼠模型。超声仪检测大鼠左心室心功能水平,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清N-末端脑钠肽前体(NTpro BNP)和超敏肌钙蛋白(hs-TnT)水平,透射电镜观察心肌细胞自噬,Western blot法检测心肌组织自噬相关因子微管相关蛋白1(Beclin1)、微管相关蛋白轻链3(LC3)、泛素和LC3结合蛋白p62(p62)、ERK1/2蛋白表达。结果:与模型组比较,阳性对照组、M-HSYA和H-HSYA组大鼠左室收缩末期室间隔厚度(LVSs)、左室舒张末期室间隔厚度(LVSd)、收缩末期左心室后壁厚度(LVPWs)、舒张末期左心室后壁厚度(LVPWd)、左心室射血分数(LVEF)及LHSYA组LVSd显著升高(均P 0. 05);心电图T波幅度和ST段抬高幅度显著降低,QT间期显著缩短(均P 0. 05);大鼠血清NT-proBNP和hs-TnT水平显著降低(均P 0. 05),心肌细胞自噬小体数量减少,自噬率显著降低(P 0. 05);心肌组织Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白表达显著降低(均P 0. 05),p62和p-ERK1/2蛋白表达显著升高(均P 0. 05)。结论:IHF大鼠心肌损伤与自噬关系密切,HSYA可能通过激活ERK1/2信号通路抑制IHF大鼠心肌细胞自噬。     

紫草素对HepG2细胞增殖、凋亡和PI3K/Akt/NF-κB信号通路蛋白表达的影响*

目的 研究紫草素对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶(Akt)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路的影响。方法 以0(对照)、1、2.5和5 μmol/L紫草素分别处理对数生长期的HepG2细胞48 h,分别采用MTT法检测细胞增殖,使用流式细胞仪检测细胞凋亡,采用Western blot法检测凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、Caspase-3)、细胞自噬相关蛋白(LC3-I、LC3-II、p62)和PI3K/Akt/NF-κB通路蛋白表达情况。结果 自小剂量、中剂量到大剂量,紫草素处理HepG2细胞增殖抑制率分别为(23.7±3.5)%、(36.2±6.1)%和(56.9±8.3)%,均显著高于对照组[(0.0±0.0)%,P<0.05],细胞凋亡率分别为(19.2±5.3)%、(37.4±7.6)%和(58.6±8.8)%,均显著高于对照组[(2.5±1.2)%,P<0.05];细胞凋亡相关蛋白表达Bax/Bcl-2比值和Caspase-3相对表达量分别为(1.3±0.2)和(2.7±0.3)、(8.2±0.6)和(0.45±0.10)和(0.78±0.16)和(0.95±0.21),显著高于对照组[分别为(0.6±0.1)和(0.18±0.06),P<0.05];细胞自噬相关蛋白表达LC3-II/LC3-I比值为(1.25±0.08)、(1.43±0.10)和(1.76±0.22),显著高于对照组[(0.96±0.08),P<0.05],p62相对表达水平分别为(0.81±0.09)、(0.62±0.15)和(0.43±0.08),显著低于对照组[(1.06±0.05),P<0.05]; PI3K、Akt和p65蛋白表达水平分别为【(0.64±0.16)、(0.51±0.12)和(0.32±0.06)】、(【0.54±0.17)、(0.37±0.05)和(0.05±0.01)】和【(0.63±0.15)、(0.52±0.10)和(0.36±0.09)],均显著低于对照组[分别为(0.84±0.13)、(0.76±0.15)和(0.89±0.11),P<0.05]。结论 紫草素可能通过抑制PI3K/Akt/NF-κB信号通路关键蛋白表达促进HepG2细胞凋亡和自噬,从而具有抑瘤作用。     

miR-34a对膀胱尿路上皮癌细胞Beclin1介导的自噬及吉西他滨化疗敏感性的影响

目的 探讨miR-34a对膀胱尿路上皮癌细胞J82中Beclin1介导的自噬及吉西他滨化疗敏感性的影响。方法 研究前期通过吉西他滨诱导,建立J82耐吉西他滨细胞系(J82/Gem),实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测J82细胞和J82/Gem细胞中miR-34a的表达;将J82/Gem细胞随机分为J82/Gem组(未转染)和转染组(miR-34a NC组、miR-34a mimics组),另取J82细胞(J82组),各组均使用含0.5μg/ml的吉西他滨培养24 h。CCK-8法检测各组增殖能力和吉西他滨的半数抑制浓度(IC50);流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;单丹磺酰尸胺(MDC)染色法观察各组细胞自噬小体,计算细胞自噬率;Western印迹检测各组细胞中自噬相关蛋白Beclin1、微管相关蛋白轻链(LC)3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62表达水平。结果 与J82组相比,J82/Gem组和miR-34a NC组细胞miR-34a表达水平、细胞凋亡率和p62蛋白表达水平显著降低,细胞增殖活性、吉西他滨IC50值、细胞自噬率、Beclin1、LC3-I、LC3-II蛋白表达水平显著...     

脂滴自噬在丙型肝炎病毒核心蛋白下调沉默信息调节因子1诱导小鼠肝脂肪变性中的作用

目的研究脂滴自噬在HCV核心蛋白下调沉默信息调节因子1(SIRT1)诱导小鼠肝脂肪变性中的作用。方法小鼠随机分为两组,每组10只。实验组小鼠尾静脉注射HCV core重组表达载体。对照组小鼠尾静脉注射磷酸盐缓冲溶液。1个月后处死小鼠。检测肝功能、脂联素、血清和肝内甘油三酰(TG)、肝脏组织病理学检查肝脂肪变性程度。蛋白质免疫法检测肝脏SIRT1蛋白、脂联素受体(AdipoR)蛋白以及脂滴自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、脂肪分化相关蛋白(ADRP)、尾部作用蛋白(TIP-47)和P62蛋白的表达。计量资料采用t检验。结果与对照组相比,HCV组小鼠出现肝脂肪变性;肝脏TG含量明显增加[(80.9±20.1)比(45.8±10.5)μg/mg,t=4.964,P0.01];血清脂联素[(1.05±0.25)比(1.41±0.45)ng/mL,t=2.211,P0.05]水平下降;SIRT1蛋白水平(0.4±0.1比0.9±0.2,t=7.071,P0.01)和AdipoR2蛋白水平(0.4±0.1比0.8±0.2,t=5.656,P0.01)下降;LC3-Ⅱ蛋白(0.8±0.2比0.4±0.1,t=5.656,P0.01)、TIP-47蛋白(0.9±0.3比0.4±0.1,t=5.000,P0.01)和ADRP蛋白(0.8±0.3比0.4±0.1,t=4.000,P0.01)表达增加;而p62蛋白(0.7±0.2比0.8±0.3,t=0.877,P0.05)表达水平差异无统计学意义。结论 HCV核心蛋白下调SIRT1表达,下调脂联素及受体表达,引起不完全脂滴自噬导致肝脂肪变性。