胰腺源间充质干细胞对大鼠胰腺损伤的修复作用

目的：探讨从大鼠胰腺中分离出间充质干细胞（MSCs），并用于大鼠胰腺损伤的修复，为糖尿病治疗探寻新的细胞来源。方法：①取3日龄Wistar大鼠，无菌条件取出胰腺，通过Ⅴ型胶原酶消化获得细胞，常规培养传代、贴壁筛选法纯化细胞、Giemsa染色观察细胞形态、流式细胞仪测定表面标志CD34和CD44，同时与骨髓MSCs进行对照，观察两者在性质和作用上的异同。②实验大鼠随机分为实验组（20只）和对照组（20只）。结扎大鼠胰腺组织建立胰腺组织缺血性坏死模型，将分离、纯化的胰腺MSCs用DAPI（荧光）标记移植到实验组坏死胰腺，对照组移植稀释液。2周后统计两组生存率并做组织病理学检测。结果：①随培养时间延长，细胞形态驱于一致，增殖旺盛。形态学观察和表面抗原检测与骨髓MSCs具有相似性。②实验组大鼠存活率为75%，肉眼见坏死的胰腺组织外观基本恢复，组织病理学切片可见组织细胞结构完整。在荧光显微镜下可见到标记DAPI的蓝色细胞。对照组的大鼠存活率20％，解剖见腹腔大量渗水，组织粘连。实验组存活率大于对照组（P<0.05）。结论：胰腺中存在MSCs，可在体外培养、扩增并可用于修复损伤的胰腺组织。     

睾酮定向诱导MSC分化的实验研究

目的：激素体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞。方法：通过贴壁法分离大鼠MSC，体外扩增培养，睾酮定向诱导MSC分化为类神经元样细胞。光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志。结果：大鼠骨髓间质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。睾酮诱导6h后大部分MSC转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色NSE、Nestin呈阳性、GFAP阴性。结论：大鼠骨髓间质干细胞可在体外经睾酮诱导分化为神经元样细胞。     

黄芪诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经元样细胞.方法通过贴壁法分离大鼠MSC,体外扩增培养.中药黄芪定向诱导MSC分化为类神经元样细胞.光镜下观察细胞形态,免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志.结果大鼠骨髓间质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增.黄芪诱导90 min后大部分MSC转变为神经元样细胞,出现胞体和突起,免疫细胞化学染色NSE、Nestin呈阳性、GFAP阴性.结论大鼠骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞.     

不同来源胰腺干细胞分化为胰岛样细胞团比较研究

目的 比较不同来源的胰腺干细胞体外诱导分化为胰岛样细胞团的可行性及效率.方法 分别取孕16天胎鼠胰腺(A组,5只)、糖尿病大鼠胰腺(B组,5只)、正常大鼠胰腺(C组,5只)经体外分离纯化获得巢蛋白(nestin)阳性胰腺干细胞,免疫荧光组化法比较各组干细胞中PDX-1的表达情况;添加各种诱导分化因子,观察胰岛样细胞团出现的时间并行双硫腙染色鉴定.结果 各组均可分离纯化出Nestin阳性胰腺于细胞,免疫荧光组化显示A组PDX-1阳性的细胞数(50%)多于B组(45%)及C组(42%),经诱导分化各组胰腺干细胞均可分化成胰岛样细胞团,并经双硫腙染色鉴定证实为分化胰岛,但各组细胞团形成时间不同,以A组分化为胰岛样细胞团所需时间较短(10±3)天,而B组及C组所需时间较长,分别为15±2天及16±3天,各组分化时间存在统计学差异(P＜0.05).结论 不同来源的胰腺干细胞均可分化为胰岛样细胞团,以胎鼠胰腺干细胞定向分化为胰岛样细胞团的效率最高.     

体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化和鉴定

[目的]探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)体外分离、培养、纯化、扩增的方法和生物学特性,研究其在诱导因子诱导下向心肌样细胞定向分化的能力。[方法]取大鼠骨髓,采用贴壁培养筛选法分离MSC,进行培养扩增,观察其生物学特性;用5-杂氮胞苷(5-AZA)诱导P3代MSC向心肌样细胞定向分化,并通过细胞免疫化学法鉴定分化细胞。[结果]大鼠MSC可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增;流式细胞仪分析所培养的P3代细胞为纯度超过95%的MSC;P3代MSC经5-AZA诱导后1周,相差鼹微镜下见细胞呈长梭形、多核;2周可见肌管样结构;细胞免疫化学染色肌钙蛋白I、结蛋白、α-肌动蛋白为阳性。[结论]MSC易分离和培养,体外培养条件下生长良好,可连续传代,在5-AZA的诱导下可定向分化为心肌样细胞。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化和鉴定

[目的]探讨大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）体外分离、培养、纯化、扩增的方法和生物学特性，研究其在诱导因子诱导下向心肌样细胞定向分化的能力。[方法]取大鼠骨髓，采用贴壁培养筛选法分离MSC，进行培养扩增，观察其生物学特性；用5-杂氮胞苷（5-AZA）诱导P3代MSC向心肌样细胞定向分化，并通过细胞免疫化学法鉴定分化细胞。[结果]大鼠MSC可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增；流式细胞仪分析所培养的B代细胞为纯度超过95％的MSC；P3代MSC经5-AZA诱导后1周，相差显微镜下见细胞呈长梭形、多核；2周可见肌管样结构；细胞免疫化学染色肌钙蛋白I、结蛋白、α-肌动蛋白为阳性。[结论]MSC易分离和培养，体外培养条件下生长良好，可连续传代，在5-AZA的诱导下可定向分化为心肌样细胞。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元细胞分化的实验研究

目的:体外分离培养骨髓间充质干细胞(MSC),并诱导其向神经元细胞分化.方法:分离大鼠骨髓间充质干细胞,并于体外扩增、培养,并通过诱导培养基进行体外诱导培养,比较对照组及实验组间细胞形态和神经丝蛋白(NFP)表达率的不同.结果:诱导后,实验组中80%的细胞表现出神经元样形态,且NFP阳性表达率明显高于对照组.结论:MSC在体外可以被诱导为神经元样细胞.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化

目的：探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)向神经细胞体外定向诱导分化的条件。方法：从正常SD大鼠骨髓中分离获取MSC,体外培养扩增纯化后传代于塑料培养皿中,采用丁羟茴醚(BHA)和二甲亚砜(DMSO)对传至3～5代的细胞进行体外诱导分化,采用免疫细胞化学对诱导后的细胞进行鉴定。结果：诱导1h、2h、3h后有部分细胞表达神经干细胞标志蛋白nestin,且随诱导时间延长呈下降趋势;诱导5h后,大部分细胞具有典型神经元形态,表达神经元标志物,神经元特异性烯醇化酶(NSE),少部分细胞呈星型胶质细胞状,表达胶质细胞标志物—胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结论：骨髓间充质干细胞可以在体外培养扩增并诱导成为神经元样细胞和星型胶质样细胞。     

成人骨髓间充质干细胞体外分化为胰岛β细胞的初步研究

目的 研究成人骨髓间充质干细胞体外诱导分化成为胰岛β细胞的可能性。方法采用Percoll分离液和差异贴壁法分离纯化成人骨髓间充质干细胞，在纤维连接蛋白包被。含有表皮生长因子和血小板源性生长因子BB的低浓度血清（2％FBS）培养液中培养，传代后用碱性成纤维细胞生长因子、B27添加剂、尼克酰胺诱导。放免法检测培养液中胰岛素．双硫腙和免疫细胞化学进行鉴定。并进行体外细胞功能测定。结果细胞诱导第二周逐渐聚集成胰岛样细胞团．开始分泌胰岛素，双硫腙染色成猩红色，免疫荧光显示细胞表达胰岛素，体外葡萄糖刺激胰岛素释放试验阳性。结论成人骨髓间充质干细胞可以在体外一定条件下实现向β细胞转分化。     

当归诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的：研究当归体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化的作用。方法：通过贴壁法分离大鼠MSCs，体外扩增培养。MSC用20μl当归注射液／ml含10％胎牛血清的L—DMEM为预诱导条件，预诱导24h后用当归注射液100μl/ml不含胎牛血清的L—DMEM进行诱导。光镜下观察细胞形态，免疫细胞化学检测神经细胞特异性抗原标志。结果：大鼠骨髓间充质干细胞可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。当归诱导3h后大部分MSCs转变为神经元样细胞，出现胞体和突起，免疫细胞化学染色NSE及nestin呈阳性、GFAP性。结论:大鼠骨髓间质干细胞可在体外诱导分化为神经元样细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞促肝组织损伤修复的作用

目的：探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）促肝组织缺血-再灌注损伤修复的作用。为肝脏疾病治疗提供新的思路。 方法：①取健康Wistar周龄大鼠的骨髓细胞悬液，进行BMSCs体外扩增培养与分化潜能检测。②健康Wistar成年大鼠随机分为实验组（30只）和对照组（10只）。建立肝组织缺血-再灌注损伤模型，将BMSCs肝局部移植到实验组，对照组移植生理盐水，1周后观察两组肝缺血-再灌注损伤后大鼠的存活率以及肝脏修复情况，并通过蓝色荧光标记观察供体BMSCs在受体内的踪迹，探讨BMSCs促宿主损伤肝组织修复的机制。结果：①分离培养的BMSCs增殖旺盛，纯度较高，且均质性和稳定性好；用诱导剂诱导后，BMSCs具有向成骨细胞和脂肪细胞分化的能力。②实验组大鼠成活率达80%，肝细胞逐渐恢复正常，损伤肝组织得到修复，在宿主恢复的肝组织中发现了较多的带有蓝色荧光的细胞存在，而对照组（未移植BMSCs）大鼠腹腔积水、粘连，成活率达30%。2组成活率比较差异有显著性（P<0.05）。 结论：BMSCs在体外易分离培养，具有多向分化的潜能；局部移植BMSCs后，可提高大鼠肝组织缺血-再灌注损伤后的恢复。     

诱导的人骨髓间充质干细胞在裸鼠体内生成软骨的实验研究

目的探讨利用组织工程方法,将人骨髓间充质干细胞(MSCs)在体外诱导、培养后,再造软骨组织的可能性。方法从胸外科手术所获得的肋骨骨髓腔中分离得到人MSCs,经无血清培养基诱导培养为软骨细胞,接种于支架材料上,埋植于裸鼠体内,6周后取材进行大体及组织学观察。结果大体观察见裸鼠皮下形成包块,触之有韧性;组织学观察可见有大量软骨细胞成堆形成,但尚有部分未降解的支架材料残留。结论人MSCs在体外经定向诱导后成为软骨细胞,与支架材料复合物可在裸鼠体内形成软骨组织;人MSCs可能成为组织工程软骨的“种子细胞”。     

In vivo chondrogenesis of induced human marrow mesenchymal stem cells in nude mice]

OBJECTIVE: To investigate the feasibility of generating cartilage tissues from human bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) cultured and induced in vitro using tissue engineering technique. METHODS: Human bone marrow MSCs were isolated from the ribs of patients receiving chest surgeries and induced into cartilage cells in serum culture-free medium. The cells were then seeded on perchloroethylene (PCE) as the scaffold material for the formation of cell-PCE composite, which was implanted under the dorsal skin of nude mice. Specimens of the implants were harvested 6 weeks after implantation and subjected to gross morphological observation and histological examination. RESULTS: Gross observation showed subcutaneous lump with considerable tenacity, and histologically, large amount of cartilage cells in clusters were seen to have evolved, in the presence of some scaffold material failing to be degraded, indicating that cartilage formation from the MSCs occurred approximately 6 weeks after the implantation of the induced MSCs. CONCLUSION: Human MSCs can be induced into chondrocytes in vitro, and the MSC-PCE composite possesses the potential to develop into cartilage in nude mice. Human MSCs can therefore be used as the seed cells to construct tissue-engineered cartilage.     

Study on the adoption of Schwann cell phenotype by bone marrow stromal cells in vitro and in vivo

To explore the possibilities of bone marrow stromal cells （MSCs） to adopt Schwann cell phenotype in vitro and in vivo in SD rats. Methods MSCs were obtained from tibia and femur bone marrow and cultured in culture flasks. Beta-mercaptoethanol followed by retinoic acid, forskolin, basic-FGF, PDGF and heregulin were added to induce differentiation of MSCs＇. Schwann cell markers, p75, S-100 and GFAP were used to discriminate induced properties of MSCs＇ by immunofluorescent staining. PKH-67-1abelled MSCs were transplanted into the mechanically injured rat sciatic nerve, and laser confocal microscopy was performed to localize the PKH67 labelled MSCs in the injured sciatic nerve two weeks after the operation. Fluorescence PKH67 attenuation rule was evaluated by flow cytometry in vitro. Results MSCs changed morphologically into cells resembling primary cultured Schwann cells after their induction in vitro. In vivo, a large number of MSCs were cumulated within the layer of epineurium around the injured nerve and expressed Schwann cell markers, p75, S- 100, and GFAP. Conclusion MSCs are able to support nerve fiber regeneration and re-myelination by taking on Schwann cell function, and can be potentially used as possible substitutable cells for artificial nerve conduits to promote nerve regeneration.     

骨髓间充质干细胞移植治疗实验性大鼠肺动脉高压损伤的作用

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)移植治疗肺动脉高压(PAH)致右心室损伤的作用效果及其机制,观察MSCs移植后存活及转化情况。方法 取SD大鼠骨髓,经贴壁筛选法体外培养并纯化MSCs,CM DiI荧光染料标记后备用。将实验动物随机分为MSCs移植治疗组(MSCs组)、肺动脉高压模型组(PAH组)和生理盐水阴性对照组(对照组),每组10只。MSCs组和PAH组大鼠皮下注射野百合碱(MCT)建立肺动脉高压模型,对照组皮下注射等量0.9%生理盐水代替MCT;1周后MSCs组大鼠经舌下静脉注射MSCs细胞悬液1mL,对照组及PAH组注射等量低糖DMEM液。移植3周后荧光显微镜下观察MSCs体内存活及转化情况,并对右心室(RV)肥厚和右心室收缩压(RVSP)升高情况进行评价。结果 MSCs在大鼠体内能存活至少3周,荧光显微镜可见MSCs转化为血管平滑肌细胞,与PAH组相比,MSCs组RVSP及RV质量与体质量比值明显降低。结论 静脉移植MSCs可明显减轻甚至逆转MCT诱导的肺动脉高压的进程,改善心功能及血流动力学指标,其机制可能是通过旁分泌作用实现的。     

体外诱导人骨髓间质干细胞分化为肝细胞样细胞

目的:探讨人骨髓间质干细胞(MSCs)在体外特定条件下是否可以转化为肝细胞样细胞.方法:分离培养人骨髓间质干细胞,采用肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)及CCl4损伤的小鼠肝脏共培养等诱导方式,在不同时间点分别用RT-PCR和荧光定量PCR检测肝细胞特异性基因的表达,免疫组织化学染色检测肝细胞标志. 结果: 在HGF和bFGF诱导第7天时甲胎蛋白(alpha fetal protein,AFP)、细胞角蛋白18(cytokeratin-18, CK18)和色氨酸2,3-双加氧酶(tryptophan 2,3-dioxygenase,TDO)基因表达阳性,CK18和TDO的表达随诱导时间延长增高;第7天诱导细胞组织化学染色AFP、白蛋白(ALB)、肝细胞核因子(hepatocyte nuclear factor,HNF)、肝细胞特异性抗原(HSA)和CK18表达阳性.与损伤小鼠肝组织共培养21 d后细胞表达AFP和TDO.结论:HGF和bFGF联合诱导以及与CCl4损伤肝组织共培养的方法可体外促进人MSCs分化为肝细胞样细胞,可为肝脏疾病或肝损伤的干细胞治疗提供细胞来源.     

兔骨髓间充质干细胞自体移植治疗急性心肌梗塞

目的 :了解骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells ,MSCs)在缺血心肌中转化为心肌细胞并改善心功能的可行性。方法 :结扎兔左前降支制作急性心肌梗塞 (acutemyocardiuminfarction ,AMI)模型 ,骨穿抽取骨髓 ,分离、培养、扩增骨髓间充质干细胞。术后 2周进行心肌梗塞瘢痕处移植 5 溴脱氧尿嘧啶 (Bromodeoxyuridine,Br dU)标记的骨髓间充质干细胞 ,对照组注射培养基。AMI术前、AMI术后 3d及移植后 4周做超声心动图检测心功能 ,移植后 4周用导管检查法测左室压力变化 ,随后处死动物取左室标本切片 ,采用免疫荧光方法鉴定植入细胞。结果 :细胞移植组左室切片中可见BrdU染色阳性细胞即植入细胞 ,对照组未见BrdU染色阳性细胞。超声心动图检查证实MSCs移植后 4周左室收缩末期直径 (LVESD)、舒张末期直径 (LVEDD)均小于对照组 (分别为P <0 .0 1及P <0 .0 5 ) ,小轴缩短率 (△D % )、射血分数 (EF)均大于对照组 (均为P <0 .0 1 )。导管测压显示MSCs移植组左室舒张末期压 (LVEDP)低于对照组、左室压上升及下降最大速率 (±dp/dt)高于对照组 (均为P <0 .0 1 )。 结论 :缺血心肌内注射骨髓间充质干细胞可依赖组织微环境转化为心肌细胞修复梗塞心肌 ,显著改善心功能 ,可用于心肌梗塞的治疗。     

间充质干细胞实现心肌修复:机遇与挑战

间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一类存在多种组织内的成体干细胞,主要来源于骨髓、脂肪组织和脐带血。随着对MSCs分离、培养、鉴定的程序化、标准化,使其成为实现心肌修复的理想种子细胞。MSCs植入受损心肌后可分泌多种生物活性物质,抑制心肌重构、促进新生血管形成。然而MSCs体内存活时间短、有形成肿瘤风险,使其尚未大规模应用于临床。为提高MSCs的治疗潜能、保障其治疗安全,基因修饰、药物诱导、生物工程等多种方法从基础走向了临床,使MSCs成为实现心肌修复的优质资源,为心肌梗死、终末阶段心力衰竭带来新的曙光。     

Y染色体追踪大鼠骨髓间充质干细胞心肌移植的实验研究

目的 利用Y染色体检测雄性大鼠的骨髓间充质干细胞(MSCs)移植到雌性大鼠心肌梗死模型中的存活情况。方法 采用全骨髓贴壁筛选法体外培养雄性大鼠的骨髓间充质干细胞作为移植细胞,选取80只雌性大鼠通过结扎左冠状动脉前降支制备心肌梗死模型,其中45只成功建立模型。成模后2周按以下分组进行细胞移植：将模型动物随机分为心外膜直接注射MSCs组(A组,n=15)、经静脉移植MSCs组(B组,n=15)和经静脉注射等量DMEM培养液组(C组,n=15),通过实时定量PCR检测雄性大鼠Y染色体特有的SRY基因,观察移植后1d、1周、2周及3周时MSCs在梗死心肌的存活情况。结果 经心外膜直接注射组和经静脉移植组通过PCR均可检测出SRY基因的存在,移植后两组的心功能得到明显的改善(P<0.05)。结论 MSCs经心外膜和静脉移植均可分布于心肌梗死周围区域,对梗死后大鼠的心脏具有保护作用。