人乳头瘤病毒16 E7抗原细胞毒性T细胞预测表位合成肽的纯化与鉴定

人乳头瘤病毒(HPV)16基因组中E7基因主要与细胞转化功能及致癌有关,从感染早期到肿瘤形成期均可持续检测到E7蛋白的表达。本研究选用已预测出的HLA-A2限制性CTL表位^[1],采用固相合成法合成多肽,产物经反相高效液相(RP-HPLC)纯化、分析和质谱分析鉴定,所获取的高纯度肽为预测表位抗原性的检测奠定了基础。     

HPV16型E7抗原B细胞表位的预测与鉴定

目的分析人乳头瘤病毒16型(HPV16)早期蛋白E7的B细胞优势表位,并对其进行免疫原性鉴定。方法采用亲水性方案、柔韧性方案、抗原指数方案及表面可能性方案综合评估其B细胞优势表位,并运用固相合成法合成多肽,经RP-HPLC纯化及纯度分析,用质谱进行定性鉴定。以合成肽免疫Balb/c小鼠,进行免疫效果评价。结果综合分析考虑HPV16 E714-21(P1),HPV16 E726-37(P2),HPV16 E744-51(P3)可能是B细胞优势表位,免疫小鼠后可明显诱导小鼠血清抗体滴度升高,但只有P1和P2产生的抗体与人宫颈癌组织上清液结合呈阳性反应。结论HPV16 E714-21和HPV16 E726-37具有较强的免疫原性,可能成为HPV感染肽疫苗的候选表位。     

HPV16E7抗原的HLA-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的筛选与鉴定

目的 筛选和鉴定人工合成的人乳头瘤病毒16型E7抗原人白细胞抗原A2分子限制性细胞毒性T细胞预测表位。方法 对预测的E7抗原人白细胞抗原A2分子限制性细胞毒性T细胞(CTL)表位运用标准Fmoc方案进行合成与纯化,采用标准⁵¹Cr释放试验检测特异性CTL诱导活性。结果 筛选并鉴定出E711-19(YMLDLQPET)和E7_49-57(RAHYNIVTF)2条人乳头瘤病毒16型E7抗原人白细胞抗原A2分子限制性CTL表位。结论 E711-19(YMLDLQPET)和E7_49-57(RAHYNIVTF)抗原性较强,有可能作为HPV感染治疗用肽疫苗的候选表位。     

负载人乳头瘤病毒16型E7多肽树突细胞诱导抗原特异性细胞免疫反应

目 的 观 察 负 载 人 乳 头 瘤 病 毒 16 型 (H PV16)E749-57 多 肽 树 突 细 胞 (DC)体 外 诱 导 针 对H PV16 肿 瘤细 胞 的特 异性 细 胞免 疫反 应 。方 法 用粒 细 胞-巨 噬细 胞 集落 刺激 因 子(GM -CSF)及 白 介素 4(IL-4)从 健康 成人 外 周血 单一 核 细胞 诱导 DC 并 负载 H PV 16 E749-57 多肽 ,流 式细 胞 仪检 测 DC 表 面 抗 原;混 合淋 巴 细 胞 反应 观 察 DC 对 同 种 淋 巴 细 胞 增 殖 的 激 发 效 应 ;乳 酸 脱 氢 酶 (LDH )释 放 法 评 价 DC 诱 导 的细胞 毒 性 T 淋 巴 细 胞 (CTL)对 Caski肿 瘤 细 胞体 外 杀 伤 效应 。 结 果 负 载 H PV16 E749-57 多 肽 的 DC 表面表 达 CD 1a(58.4 ±6.7)%、CD 80(70.6 ±3.4)%及 H LA -DR (74.8 ±4.2)%分 子 ;具 有 刺 激 同 种 T 淋 巴 细 胞增 殖的 能 力 ;其 诱 导 的 抗 原 特 异 性 CTL 对 Caski肿 瘤 细 胞 产 生 特 异 性 杀 伤 ,而 对 SiH a、A N3CA 肿 瘤 细 胞无明 显 杀伤 作用 。 结论 负 载 H PV16 E749-57 多 肽的 DC 体 外可 诱导 高 效、特 异 性的 CTL 效应 。     

人乳头瘤病毒16E749-57的分子修饰与鉴定

目的 对人乳头瘤病毒(HPV)16型E7抗原的人白细胞抗原A2分子限制性细胞毒性T细胞表位HPV16E7_49-57进行氨基酸置换修饰,并鉴定修饰表位。方法 运用量化模体方案对置换后的多肽与人白细胞抗原A2分子的结合系数进行比较,以分子模拟方法确定合成序列,采用标准Fmoc方案进行合成与纯化多肽以及乳酸脱氢酶释放法检测特异性细胞毒性T细胞诱导活性。结果 修饰多肽符合人白细胞抗原A2分子限制性细胞毒性T细胞的表位要求,9肽RLHYNIVTF具有特异性细胞毒性T细胞诱导活性。结论 修饰表位(氨基酸序列RLHYNIVTF)具有更好的结合力和较强的抗原性,可以代替原有序列E7_49-57(氨基酸序列RAHYNIVTF)作为人乳头瘤病毒感染治疗性肽疫苗分子设计的候选表位。     

人乳头瘤病毒16 E7限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的穿膜肽疫苗设计及体外免疫学研究

目的：利用穿膜肽人免疫缺陷病毒（HIV）-Tat49-57的穿膜能力,设计穿膜肽人乳头瘤病毒（HPV）16E7限制性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位（第49～57位氦基酸）的融合肽疫苗,并在体外研究其诱导特异性CTL的应答能力。方法：应用多肽固相合成技术,分别合成含HIVTat49-57和人类白细胞抗原（HLA）-A2．1限制性CTL优势表位HPV16E749-57的18肽,和该CTL表位的9肽,并用一无关肽作对照,在体外用乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性试验分别检测了上述18肽和9肽在HLA—A2阳性健康者外周血单个核细胞（PBMC）中诱导的表位E749-57的特异性CTL活性。结果：经质谱分析,上述多肽成功合成,纯度均在95％以上。与9肽相比,18肽能在体外诱导出明显增强的特异性CTL活性（P〈0．05）。结论：在HPV16E7HLA—A2．1限制性CTL表位（49～57）的N-末端加上HIV—Tat49-57序列,不会影响表位的提呈效率,而且在体外能有效激发针对E749-57特异性的CTL应答,为新型抗肿瘤及细胞内感染的多肽疫苗设计提供了新思路。     

HPV16型E7抗原表位的研究进展

人乳头瘤病毒(HPV)常见型别中,良性型HPV6、11型和恶性型HPV16、18型等感染可以导致尖锐湿疣、宫颈上皮内瘤和宫颈癌等疾病^[1,2]。HPV16基因组中E7基因主要与细胞转化功能及致癌有关,由于HPV感染局部抗原呈递障碍^[3,4]、HPV抗原对局部免疫反应的负性调节^[5,6]和细胞毒性T淋巴细胞(cyto-toxic Tlymphocyte,CTL)难与HPV感染的角质形成细胞相互作用^[7]等原因,从感染早期到肿瘤形成期均可持续检测到E7蛋白的表达。该蛋白作为一种理想的免疫治疗靶抗原在研究中倍受重视。筛选和鉴定E7抗原CTL表位并进行特异性免疫治疗具有重要的临床应用价值。     

宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型E6、人乳头瘤病毒16型E7蛋白表达及DNA病毒载量与调节性T细胞浸润的相关性分析

目的 探究宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6、HPV16 E7蛋白表达及DNA病毒载量与调节性T(Treg)细胞浸润的相关性及临床意义。方法 选取成都医学院第一附属医院2018年1月至2020年1月84例行手术治疗的宫颈癌患者的癌组织作为宫颈癌组,选取同一医院同期手术治疗的42例宫颈上皮内瘤变(CIN)患者的宫颈组织作为CIN组,另选取42例因子宫肌瘤行全子宫切除术的患者的正常宫颈组织作为正常组。对比分析三组组织中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白表达及DNA病毒载量、Treg细胞浸润的情况。结果 宫颈癌组HPV16 E6、HPV16 E7蛋白阳性表达率及DNA病毒载量、Treg细胞占CD4⁺T细胞比例均高于CIN组、正常组,CIN组上述指标均高于正常组(P<0.05);宫颈癌组织中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白阳性表达率及DNA病毒载量与Treg细胞占CD4⁺T细胞比例呈正相关(P<0.05);HPV16 E6、HPV16 E7蛋白阳性表达率及DNA病毒载量、Treg细胞占CD4⁺...     

人乳头瘤病毒11型E7蛋白基因的克隆和表达

目的 从尖锐湿疣皮损标本中扩增出人乳头瘤病毒11型(HPV11)E7蛋白基因．并进行表达、纯化和鉴定。方法用PCR法，从尖锐湿疣标本中扩增出HPV11E7蛋白基因，与pGEX-6P-1载体连接成重组表达质粒pGEX-6P-1／E7；重组质粒转入BL21大肠杆菌，经诱导表达融合蛋白GST-E7；该蛋白经剪刀酶切除GST，Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱纯化，SDS-PAGE和蛋白质印迹法检测鉴定。结果经酶切及序列分析鉴定，重组质粒pGEX-6P-1／E7成功构建．诱导后高表达GST-E7融合蛋白并得到纯化，蛋白质印迹证实表达蛋白为E7蛋白。结论获得高表达、高纯度的HPV11 E7蛋白，为该蛋白的功能及免疫学分析及尖锐湿疣疫苗研究打下了基础。     

16型人乳头瘤病毒E6/E7诱导角质形成细胞表达热休克蛋白70

目的 了解１６型人乳头瘤病毒（ＨＰＶ１６）Ｅ６／Ｅ７、ＨＳＰ７０与角质形成细胞永生化及转化之间的关系。方法 Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ介导法进行转染,以Ｇ４１８筛选阳性克隆,免疫印迹分析及免疫荧光双标记染色结合激光扫描共聚焦显微镜对ＨＳＰ７０和ＨＰＶ１６Ｅ６／Ｅ７在转染然质形成细胞中的表达进行了观察。结果 免疫印迹分析显示正常负擀形成细胞和转染角质形成细胞均在相对分子质量７００００处出现一条染色带     

Mapping of cytotoxic T lymphocytes epitopes in E7 antigen of human papillomavirus type 11

One of the critical steps in the progression to condyloma acuminatum (CA) is the establishment of a persistent human papillomavirus (HPV) infection, majority of HPV type 6 and 11. Cytotoxic T lymphocytes (CTL), which can be induced by the epitope-based peptides in vitro, are thought to be able to recognize and destroy virus-infected cells. In order to screen and identify HLA-A*0201 restricted HPV-11E7 CTL epitopes, five epitope peptides and tetramers were selected including HPV-11E7 7–15 (TLKDIVLDL), 15–23 (LQPPDPVGL), 47–55 (PLTQHYQIL), 81–89 (DLLLGTLNI) and 82–90 (LLLGTLNIV). Human monocyte-derived dendritic cells (DCs) from HLA-A*0201 healthy individuals were pulsed with these peptides to assess the expression of CD83, CD86, HLA-DR and the secretion of IL-12. The ability of peptide-loaded mature DCs to activate autologous T cells was evaluated by analyzing the frequency of specific tetramer⁺ CD8⁺ T cells using flow cytometry, and the level of IFN-γ secretion by ELISA. The ability of the epitope-specific CTLs to kill the target cells was also analysed. It was found that the immature DCs could be fully activated by all the five HPV-11E7 peptides and peptide-loaded mature DCs were able to stimulate the epitope-specific T cells in vitro. There was an increased frequency of CD8⁺ T cells specific for the E7 7–15 epitope when compared to other four predicted epitopes of HPV-11E7 (P < 0.05). The epitope-specific CTLs for E7 7–15 induced the strongest cytotoxicity to HPV-11E7 expressing cell line at an E:T ratio of 50:1 (P < 0.05). Taken together, these findings demonstrate that E7 7–15 (TLKDIVLDL) is an HLA-A*0201-restricted CTL epitope of HPV type 11. We propose that this epitope could be more helpful in the characterization of HPV control mechanism and be useful for the development of immunotherapeutic approaches for low-risk HPV infectious diseases such as CA. The abstract was accepted by 23rd HPV International Conference and by the American Academy of Dermatology Academy 2007.     

HPV16E7多肽体外诱生抗原特异性细胞毒性T细胞表型及功能的研究

目的 探讨高致癌性HPV16E7病毒抗原肽体外诱生HLA-A2阳性正常人外周血抗原特异性CD8＋细胞毒性T细胞（CTL）的表型及功能状态。方法 以HPV16E711－20合成多肽、重组人IL-7、IL-2体外刺激26例HLA-A2阳性正常人外周血T细胞,用HLA-A*0201限制性表位肽/ YMLDLQPETT五聚体技术,结合流式细胞仪对抗原特异性CTL进行频率、表型［CD45RA+CD27-效应性CTL、CD45RA-CD27-效应性记忆CTL（TEM）、CD45RA-CD27＋中枢性记忆CTL（TCM）、CD45+CD27+初始性CTL］及功能（穿孔素、颗粒酶B、FasL）分析,并以无关肽HBVcore18－27作为阴性对照。结果 病毒多肽体外刺激T细胞7 d后,抗原特异性CD8＋ CTL数为（0.73 ± 0.33）%,比未刺激组的（0.02 ± 0.03）%明显增多（P < 0.01）。进一步分析,在抗原特异性CTL中,效应性CTL、TEM、TCM及初始性CTL百分比分别为（26.07 ± 13.46）%、（7.97 ± 7.11）%、（33.25 ± 19.68）%及（32.73 ± 13.89）%,均比未刺激组的（0.02 ± 0.03）%、（0.02 ± 0.03）%、（0.02 ± 0.03）%及（0.02 ± 0.05）% 明显增多,P值均 < 0.01。HPV16E711－20表位特异性CTL分泌穿孔素、颗粒酶B、Fas-L的水平分别为（47.01 ± 18.69）%、（80.53 ± 13.32）%及（26.48 ± 7.81）%,均比未刺激组的（0.38 ± 0.55）%、（0.34 ± 0.22）%及（0.16 ± 0.16）%明显增多,P值均 < 0.01。结论 HPV16E711－20多肽诱导CD8＋ T细胞克隆扩增,产生抗原特异性CD8＋ CTL,分泌毒性细胞因子,通过不同机制特异性杀伤病毒感染的靶细胞,在抗病毒免疫应答中发挥作用。     

北京地区人乳头瘤病毒16E6E7基因变异和序列分析

目的 了解北京地区人乳头瘤病毒(HPV)16型E6E7结构特点，为研制HPV16疫苗奠定基础。方法 从HPV感染组织中提取DNA，PCR鉴别其型别，从单独HPV16感染的标本中分离HPV16 E6E7基因，克隆入载体pGEM-3ZF，进行双向测序，与德同标准株进行比较。结果 构建了北京地区HPV16E6E7的重组质粒。测序结果表明该基因全长为776bp，与已发表的德同标准株长度相等，3处核苷酸发生变异，同源性99．7％。分别位于第60、96和565nt(相当于HPV16全长序列中第142、178和647nt)，2处位于F6区，1处位于E7，其对应氨基酸分别为第20、32和188个氨基酸，分别由Pro(CCA)、Asp(GAT)和Asn(AAT）变异为Pro(CCG)、Glu(GAG)和Ser(AGT)。结论 北京地区HPV16E6E7基因结构与德国标准株存在差异。     

穿膜肽对HPV16E7细胞毒性T细胞表位MHC-Ⅰ类抗原提呈影响的初步研究

目的研究穿膜肽（Tat49-57）对HPV16E7 MHC—Ⅰ类限制性细胞毒性T细胞（CTL）表位（E749-57）在抗原提呈细胞内经MHC—Ⅰ类途径被提呈的动力学影响。方法应用多肽固相合成技术，分别合成含穿膜肽与HPV（人乳头瘤病毒）16E7惟一HLA-AJH2-K^b＋限制性CTL表位E749-57的融合多肽，同时合成该表位N端自然延伸的抗原肽和无关对照肽。采用流式细胞仪（FACS）分析技术，检测抗原提呈细胞（APC）在不同时相点对上述各抗原肽进行MHC—Ⅰ类提呈的情况。结果在与APC孵育早期，Tat—E749-57在短时间内即被APC快速提呈并进人MHC—Ⅰ类抗原提呈途径，提呈的效率略低于E749-57（P〉0．05）；在孵育的后期，与Tat—E749-57组孵育的APC细胞表面，E749-57／K^b复合物存在时间较其他组明显延长（P〈0．05）。结论在外源性抗原肽中引人穿膜肽可明显促进其MHC—Ⅰ类限制性CTL表位的提呈效率，从而有效增强外源性抗原肽的免疫原性。     

HPV16 E7对A431细胞中Smad7表达的影响

目的研究HPV16 E7对A431表皮鳞癌细胞Smad7表达的影响,并分析其潜在的意义。方法应用基因工程技术转染并筛选出稳定表达HPV16 E7的A431细胞,采用qRT-PCR、Western blotting及激光共聚焦技术,观察并比较转染前后A431细胞中Smad7的表达。结果 A431细胞中Smad7的表达强度随转染HPV16 E7后时间的延长而升高(P0.05)。Smad7蛋白的亚细胞定位,存在胞浆向胞核移位的现象。结论稳定高表达HPV16 E7后的A431细胞中Smad7表达水平升高,并可以影响Smad7的细胞定位。