白念珠菌烯醇化酶重组蛋白质的制备及鉴定

目的 制备具有高免疫原性的白念珠菌重组烯醇化酶蛋白质。 方法 以白念珠菌C1标准株基因组DNA作为模板,用PCR法扩增烯醇化酶的全长DNA序列,以pET28a(+)为载体,构建重组表达质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导重组融合蛋白质表达。用抗his标签的单克隆抗体和白念珠菌抗体阳性的病人血清进行western blot鉴定,亲和层析柱纯化重组蛋白质。 结果 获得了含白念珠菌烯醇化酶全长基因的重组表达载体和相应工程菌株,经IPTG诱导后能高效表达重组融合蛋白质。经已含抗体的病人血清进行western blot鉴定,表明诱导的重组蛋白质有良好的免疫原性。 结论 成功克隆了白念珠菌烯醇化酶全长基因并在大肠埃希菌中获得高效表达;重组蛋白质具有良好的免疫原性。     

中国汉族人群中白色念珠菌的25S rDNA基因分型及耐药性分析

目的调查白色念珠菌25S核蛋白体脱氧核糖核酸(rDNA)基因型分布,并分析白色念珠菌各基因型与耐药性之间的相关性。方法以经API 20C AUX真菌鉴定板和科玛嘉念珠菌显色培养基鉴定到种的76株白色念珠菌为研究对象,转沙保罗氏培养基纯培养24 h,收集菌液,裂解法提取质粒DNA,用特异性引物扩增白色念珠菌25S rDNA基因,根据聚合酶链反应(PCR)产物电泳图谱进行基因分型;采用微量肉汤稀释法测定各基因型白色念珠菌对4种常用抗真菌药物5-氟胞嘧啶(5-FC)、两性霉素B(AMB)、氟康唑(FCZ)、伊曲康唑(ICZ)的最低抑菌浓度(MIC)。结果 76例白色念珠菌分为A、B、C 3个基因型(A型48例,B型8例,C型20例),按照有无长度为379 bp的Ⅰ型内含子的插入,将76例白色念珠菌分为有内含子组和无内含子组,分别进行4种抗真菌药物耐药率的比较,结果发现2组间对FCZ耐药率差异有统计学意义(P0.01),而对5-FC、AMB和ICZ耐药率差异无统计学意义(P值均大于0.05)。结论白色念珠菌25S rDNA基因内含子(379 bp)的缺失或者插入可能与其对FCZ的耐药性有关。     

白念珠菌H3K4甲基转移酶N末端肽段Set1-208p的原核细胞表达及鉴定

摘要：目的：原核细胞表达白念珠菌H3K4甲基转移酶N末端肽段Set1-208p,鉴定重组蛋白质的抗原性。 方法：用比对软件对白念珠菌H3K4甲基转移酶与其他物种甲基转移酶进行比对。选择与人类无同源性的抗原特异性片段,以白念珠菌C1标准株基因组DNA为模板,PCR扩增Set1-208p的编码基因,以pET28a (+) 为载体,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白质表达。用抗His标签的单克隆抗体鉴定融合蛋白,并用确诊侵袭性白念珠菌感染（IC）患者血清进行抗原性鉴定。 结果：成功克隆了白念珠菌抗原特异性H3K4甲基转移酶片段Set1-208p基因并诱导表达,获得了纯化的重组肽段,所得蛋白质分子量（Mr）约为29 000,带有His标签,经western blot鉴定,诱导的重组蛋白可与IC患者血清特异性反应。 结论：成功诱导表达了具有良好抗原反应性的Set1-208p重组蛋白质,为建立相应的抗原、抗体ELISA检测方法提供基础。     

一株临床不常见念珠菌的检验

目的对1株临床不常见念珠菌的检测进行探讨。方法采用4种不同方法（ATB、DADE、Remel和分子生物学方法）对1株不常见念珠菌进行检测。结果ATB、Remel系统检测结果为邹褶念珠菌;DADE系统检测结果为克柔念珠菌;分子生物学检测结果为近邹褶念珠菌。讨论对于临床不常见的念珠菌,仅用生化反应鉴定是不够的,为了正确鉴定到种,必要时还要用分子生物学方法作核酸序列分析。     

一株临床不常见念珠菌的检验

目的对1株临床不常见念珠菌的检测进行探讨。方法采用4种不同方法(ATB、DADE、Remel和分子生物学方法)对1株不常见念珠菌进行检测。结果ATB、Remel系统检测结果为邹褶念珠菌;DADE系统检测结果为克柔念珠菌;分子生物学检测结果为近邹褶念珠菌。讨论对于临床不常见的念珠菌,仅用生化反应鉴定是不够的,为了正确鉴定到种,必要时还要用分子生物学方法作核酸序列分析。     

聚合酶链反应反向斑点杂交快速检测及鉴定念珠菌

目晨培养为基础的快速检测与鉴定念珠菌的方法。方法 将白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌种特异探针加尾后固定在硝酸纤维素膜上;用氯化苄法提取念珠菌ＤＮＡ,采用真菌特异通用引物ＰＣＲ扩增ＤＮＡ,在扩增过程中用Ｂｉｏ－１１－ｄＵＴＰ标记扩增产物,然后分别与白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌特异探针杂交。结果 对１４种念珠菌扩增均为阳性,对３种常见细菌扩增均为阴性。３种念珠菌只与其对应探针杂交。结论 该方     

聚合酶链反应反向斑点杂交快速检测及鉴定念珠菌

目的　研究以非培养为基础的快速检测与鉴定念珠菌的方法。方法　将白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌种特异探针加尾后固定在硝酸纤维素膜上;用氯化苄法提取念珠菌ＤＮＡ,采用真菌特异通用引物ＰＣＲ 扩增ＤＮＡ,在扩增过程中用Ｂｉｏ１１ｄＵＴＰ 标记扩增产物,然后分别与白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌特异探针杂交。结果　对１４ 种念珠菌扩增均为阳性,对３ 种常见细菌扩增均为阴性。３ 种念珠菌只与其对应探针杂交。结论　该方法简便、快速、准确,适于临床实验室快速检测与鉴定念珠菌。     

核酸质谱技术检测常见念珠菌血症病原菌

目的联合聚合酶链反应与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术, 构建检测5种临床常见念珠菌血症病原菌的高通量检测方法。方法方法学建立。以白色念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌为目标菌株, 以内转录间隔区为靶基因, 设计特异的单碱基延伸引物, 在同一反应体系内进行单碱基延伸反应, 用MALDI-TOF MS检测各目的菌特征峰;使用模拟血流感染样本验证上述构建的检测体系敏感度、特异度;前瞻性收集2021年10月至2022年9月解放军总医院第一医学中心检验科108例疑似或确诊念珠菌血症患者血液样本并检测;将核酸质谱检测结果与金标准血培养方法进行比较。结果用所建立的核酸质谱检测体系同时检测5种临床常见念珠菌, 各菌种均可产生特异的产物峰且各菌种之间不存在相互干扰。白色念珠菌的最低检测限可达100 CFU/ml, 近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌的最低检测限可达10 CFU/ml。对108份血液样本进行检测, 核酸质谱的敏感度为94.74%(36/38), 特异度为97.14%(68/70), 阳性预测值为92.31%(36/39)...     

变异念珠菌常见菌落和菌体形态

目的 研究白色念珠菌变异后菌落及菌体形态的变化特征.方法 用唑类抗真菌药物对白色念珠菌标准菌进行实验室诱导得到不同的变异株;不同培养环境下获得白色念珠菌自发变异株.从抗真菌药物治疗效果不佳的临床念珠菌感染患者标本中分离培养的念珠菌变异株.将以上变异株进行培养,革兰染色,镜下观察菌体形态.结果 氟康唑诱导变异株菌落呈黏液状,革兰染色为阳性长杆状;伊曲康唑诱导的变异株菌落呈水滴状,革兰染色为阴性球杆状;酮康唑诱导的变异株菌落呈灰白色,革兰染色为阳性葡萄状;白色念珠菌自发变异株和临床分离念珠菌变异株菌落多产红色、黄色等色素形态为革兰阳性球菌状、革兰阴性杆状,也可呈白色毛绒状、淡粉色粉末样菌落,革兰染色为阳性念珠菌.结论 常用抗真菌药物、生长微环境改变、体内某些因素极易诱发念珠菌发生变异,变异后念珠菌无论菌落和菌体可发生类细菌样改变,因此,容易造成实验室在诊断念珠菌感染时的误诊和漏诊.     

白念珠菌烯醇化酶双抗体夹心ELISA检测方法的建立

摘要：目的：建立检测白念珠菌烯醇化酶（enolase, Eno）的双抗体夹心ELISA法,并试用于几种真菌培养上清液的检测。 方法：将抗白念珠菌Eno单抗作为包被抗体,辣根过氧化物酶标记的羊抗Eno抗体作为检测抗体,用方阵滴定法确定包被抗体和酶标抗体浓度,建立检测Eno的ELISA法,对方法的精密度、特异性、最低检测限等指标进行评价。用该法检测白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母等不同真菌培养上清中Eno水平。 结果：Eno浓度为20 ng/mL和5 ng/mL时,批内和批间变异系数(CV)分别为6.61%、9.19%和6.98%、13.81%;最低检测限为1.25 ng/mL。本法可从白念珠菌37 ℃培养24 h后的上清中检出Eno,Eno含量与白念珠菌菌丝含量呈正相关。本法对近平滑念珠菌有微弱交叉反应,与热带念珠菌、光滑念珠菌、季也蒙念珠菌、新生隐球菌和酿酒酵母均无交叉反应。 结论：建立的检测白念珠菌Eno的双抗体夹心ELISA方法有较好的特异性,可用于评价Eno检测在侵袭性白念珠菌感染中的诊断价值。     

宫颈癌蛋白质组提取方法的建立及优化

目的:建立及优化人宫颈癌组织蛋白质提取方法,为下一步寻找差异表达的蛋白质并早期诊断宫颈癌提供新的思路.方法:利用一步法和三步法提取宫颈癌组织蛋白质,并分别用Bradford法测定相应样品总蛋白质浓度,并进行双向丙烯酰胺凝胶电泳分离,观察两种方法提取样品蛋白质含量及2-DE蛋白质图谱高分辨率的情况.结果:三步法提取的宫颈癌组织蛋白质含量较一步法有明显的增高,2-DE蛋白质图谱较一步法清晰、分辨率高.结论:与一步法相比较,三步法具有高蛋白质浓度、高分辨率、高清晰度的二维电泳图谱的优点,利于全面准确地进行蛋白质学研究.     

三种大鼠骨髓间充质干细胞双向电泳样品制备方法的比较

背景：骨髓间充质干细胞双向电泳样品制备方法很多,但目前尚未有统一标准。目的：通过对比确定合适的大鼠骨髓间充质干细胞双向电泳样品制备方法。方法：充分裂解体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞,所得蛋白样品分为3组：未进一步处理组、丙酮沉淀法处理组、2-D clear-up kit处理组,Bradford法测定蛋白质浓度后分别进行双向电泳,对比分析3组所得电泳图谱。结果与结论：2-D Clean-up kit处理组所得双向电泳图谱在背景,图像清晰度,分辨率,重复性上比丙酮沉淀法处理组和未进一步处理组要好,说明经2-D Clean-up kit处理的样品制备方法更适合用于大鼠骨髓间充质干细胞双向电泳样品的制备。     

兔椎间盘软骨终板总蛋白提取方法的改良

目的:探讨快速有效的椎间盘软骨终板组织总蛋白提取方法.方法:采用一般法、外加超声法及液氮研磨法提取兔椎间盘软骨终板组织的总蛋白,并用BCA法测蛋白浓度,再用蛋白印迹检测软骨终板组织中目的蛋白1(65 kDa)、目的蛋白2(30 kDa)及β-actin(42 kDa)的表达.结果:提取107个兔椎间盘软骨终板组织,其中一般法17个,其浓度为(0.911±0.211)mg/mL;外加超声法14个,其浓度为(2.021±0.258)mg/mL;液氮研磨法76个,其浓度为(3.121±0.248) mg/mL,经统计分析,任何两种方法间蛋白浓度差异有统计学意义,液氮研磨法所得蛋白浓度最高;且液氮研磨法所得的总蛋白经蛋白印迹得到目的蛋白-1、目的蛋白-2及β-actin的清晰条带.结论:液氮研磨法可以作为少量软骨组织蛋白提取的一种理想方法,可以在一般实验室中展开,进而可在蛋白质水平上进行相关功能的研究.     

白色假丝酵母菌ERG11基因突变与唑类抗真菌药物耐药的关系

目的探讨白色假丝酵母菌ERG11基因突变与唑类抗真菌药物耐药的关系。方法纸片扩散法初步筛选临床分离的耐唑类抗真菌药物的白色假丝酵母菌,测定初筛耐药株对氟康唑和伊曲康唑的最低抑菌浓度,随机选择10株白色假丝酵母耐药株,提取基因组DNA。利用DNASTAR软件辅助设计3对PCR引物,以提取的目的 DNA为模板,分别从前(P1)、中(P2)、后(P3)3段扩增ERG11基因全序列。扩增后的PCR产物经纯化后测序,将测序结果与GenBank中已知标准序列(X13296)进行比较分析。结果电泳结果显示,获得的3段PCR产物大小与预期结果一致。测序结果显示成功获得10株白色假丝酵母菌ERG11全基因序列。与GenBank中标准株序列(X13296)比较,耐药株均存在同义突变和错义突变,共27个碱基突变位点。15个位点是错义突变,其中F126LI、166N、H183Q、V437I、S453F和N490K为新发现的突变位点。结论耐唑类抗真菌药物的白色假丝酵母菌ERG11基因有多个发生错义突变的位点,且为多点突变,可能与其耐药有关。     

小鼠主动脉平滑肌细胞Robo4膜蛋白的提取

目的优化小鼠主动脉平滑肌细胞膜蛋白提取方法，获得高纯度的Rob04膜蛋白。方法高速离心法选择性地分离提取总膜蛋白，BCA法测定总膜蛋白含量，Western—Blot检测目的蛋白条带。结果成功提取总膜蛋白，总膜蛋白浓度达1．47μg／μL，Western-Blot检测出Rob04膜蛋白条带。结论该提取方法简单、可靠、快速，获得的膜蛋白纯度高，可用于Western—Blot后续试验。     

High-Pressure Liquid Chromatographic Assay of Netilmicin in Plasma

A high-pressure liquid chromatographic method for the quantitative determination of netilmicin in plasma was developed. The procedures involve acetonitrile protein precipitation, methylene chloride extraction, and dansylation to form the fluorescent dansyl derivative of netilmicin, which is extracted into ethyl acetate and chromatographed on a reverse-phase column with aqueous acetonitrile as the mobile phase. A good linear relationship between peak height measurements and netilmicin concentrations was found. This method is sensitive and reproducible; a netilmicin concentration as low as 0.5 μg/ml can be measured with only 0.1 ml of plasma sample. The results of assays of plasma or serum samples by this high-pressure liquid chromatographic method correlate well with those obtained by microbiological assays.     

Identification of rare Candida species and other yeasts by polymerase chain reaction and slot blot hybridization

Invasive candidiasis has become a major cause of morbidity and mortality in immunocompromised hosts. Here we describe a fast and reliable DNA extraction and PCR amplification method in combination with a slot blot hybridization assay. A genus-specific probe was designed that allowed to detect DNA from a broad range of Candida species and 3 other yeasts. In addition, species-specific oligonucleotides for emerging Candida and other yeast species allowed to identify DNA extracted from Candida lusitaniae, Candida humicola, Candida kefyr, Candida inconspicua, Candida solani, Malassezia furfur and Trichosporon cutaneum. A sensitivity of at least 10(1) CFU, corresponding to 100 fg of fungal DNA, was documented for all species-specific probes and the common Candida probe. In addition, the 18S rRNA genes of 7 yeast species (C. humicola, C. kefyr, C. solani, C. inconspicua, C. norvegensis, C. utilis and M. furfur) were completely sequenced. The sequencing primers described bind to highly conserved primer binding sites. Therefore, these primers would allow rapid cycle sequence of additional ribosomal genes throughout the whole kingdom of fungi.     

真菌基因组DNA的提取和通用PCR检测方法的建立

目的改良真菌基因组DNA的提取方法,建立真菌通用聚合酶链反应（PCR）,为目前临床真菌感染的早期诊断、预防和治疗提供有效工具。方法参考前人报道的多种真菌基因组DNA的提取方法,作改良以确立本研究中所采纳的手段,并应用真菌核糖体DNA（rDNA）通用引物,以实验室保存的标准菌株及临床分离菌株来建立临床真菌感染检测用通用PCR。结果白念珠菌和烟曲霉在75℃温度下分别作用60和80min可以完全被灭活。经目前多种破壁方法的探讨,发现对于白念珠菌（单细胞真菌）选用酶消化法,破壁效率高达98．29％,而烟曲霉（多细胞真菌）则需要酶消化法与打击器振荡法联合应用,其破壁率也可达66．68％,进一步用酚氯仿法抽提其基因组DNA,能够获得相对纯度高且有一定得量。当选择真菌rDNAITS2区间的一对通用引物,通过PCR反应体系的优化,使得本研究中建立的通用PCR,对于白念珠菌和烟曲霉的检测下限分别为5个和9．7个,其PCR产物测序结果与数据库比对完全一致,同时选择临床分离的或实验室保存的其他真菌、细菌和病毒株进行验证,该方法仅针对真菌群,结合测序分析可以实现种属水平的鉴定。结论改良真菌基因组DNA提取后所建立的针对真菌rDNA的通用PCR敏感且特异,适宜实验室操作。     

一种快速提取新生隐球菌及其他酵母样真菌DNA方法

目的寻找一种快速提取酵母样真菌DNA的方法。方法使用酶溶解法提取新生隐球菌及其他酵母样真菌DNA,并对提取的DNA通过特异性引物进行PCR,所得产物进行酶切验证。结果用此方法提取的新生隐球菌基因组DNA浓度为280～395ng/μL,OD260/OD280比值为1.6～1.8,所提取的DNA可用于PCR的扩增检测特异性酵母样真菌。结论该方法可以用于提取新生隐球菌及其他酵母样真菌。     

B6-Co突变系小鼠混浊角膜组织蛋白的二维凝胶电泳分析

背景：从蛋白质组学水平研究B6-Co突变系小鼠浑浊角膜与正常B6小鼠角膜组织的异同,有利于阐释人类角膜混浊的发生机制,开辟从表型驱动研究基因功能的新途径。目的：应用二维凝胶电泳分析技术比较分析B6和B6-Co小鼠的角膜蛋白质组学差异。方法：分别提取B6与B6-Co突变系小鼠角膜组织蛋白,将所获得的蛋白质样品进行二维凝胶电泳和凝胶染色,分析电泳图谱,比较正常角膜组织与混浊角膜组织的蛋白质异同。结果与结论：实验成功建立了对小鼠两种角膜组织蛋白的提取及二维凝胶电泳的基本方法和条件,二维凝胶电泳图谱清晰,通过比较分析发现B6-Co突变系小鼠混浊角膜蛋白质组中有13个蛋白质点显著下调,6个表达显著上调。B6小鼠和B6-Co突变系小鼠角膜蛋白质组有显著差异表达,提示由于基因的突变导致了相关信号通路的基因表达上调、下调或沉默。