GST-CTCF融合蛋白原核表达载体的构建及表达

目的构建人CCCTC结合因子(CCCTC-binding factor,CTCF)与谷胱甘肽转移酶(glutathione S-transferase,GST)重组蛋白的原核表达载体,并进行诱导表达。方法以pEASY-T1-SIMPLE-CTCF为模板,设计引入限制性酶切位点的CTCF引物,PCR方法扩增目的片段,产物经限制性内切酶酶切后与原核表达载体pGEX-4T-1连接,构建成pGEX-4T-1-CTCF原核表达载体,转化至大肠埃希菌BL21中,经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)进行诱导,Western blot检测GST-CTCF融合蛋白的表达情况。结果经菌液PCR、质粒双酶切分析、基因测序分析证实重组表达质粒pGEX-4T-1-CTCF构建成功,GST-CTCF融合蛋白产物经Western blot鉴定为特异性表达。结论成功构建了pGEX-4T-1-CTCF原核表达质粒,获得特异性的GST-CTCF融合蛋白,为进一步研究转录因子CTCF的功能奠定了基础。更多还原     

人细胞骨架调节蛋白基因Nelin N端片段的原核表达

[目的 ]构建Nelin基因N端片段的原核表达载体并表达此蛋白 .[方法 ]设计带有BamHI/EcoRI酶切位点的引物 ,以已构建好的质粒pGEX 5X Nelin为模板 ,用PCR扩增Nelin基因N端片段 ,并用BamHI/EcoRI酶切PCR产物和原核表达载体 pGEX 5X 1,然后用T4DNA连接酶将其连接 ,得到重组表达质粒 pGEX 5X Nelin 1,经双酶切鉴定和测序验证 .重组表达质粒转化大肠杆菌BL 2 1,用异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导 ,以SDS PAGE进行分析 .[结果 ]成功构建并表达了分子量约为 43KD的NelinN端片段的融合蛋白 .[结论 ]所表达的蛋白为蛋白纯化、抗体制备及研究其功能奠定了基础     

人卵透明带重组融合基因及其表达载体的构建

目的构建人卵透明带蛋白3（zona pelludda 3，ZP3）／GST蛋白融合基因原核表达载体。方法利用PCR法扩增出去N端的信号肽和C端的跨膜区huZP3成熟蛋白编码基因。先将其克隆到pGEM-T载体，进行序列测定和分析，然后将huZP3核心DNA片断克隆入GST蛋白融合原核表达载体pGEX4T-1内。结果获得一个核苷酸长度约为1000bp的基因，与GenBank（NCBI：M60504）公布的ZP3基因序列有99％的同源性。DNA序列分析发现。有一个氨基酸出现变异。酶切鉴定后证明ZP3基因完整插入GST融合蛋白原核表达载体pGEX4T-1中。结论成功构建出含ZP3基因的GST融合蛋白原核表达载体。     

人端粒酶逆转录酶原核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT,并观察融合蛋白的表达。方法：用RT-PCR方法从人肝癌组织中扩增出带有EcoRⅠ酶切位点的hTERT基因片段,与pGEM-T Easy连接,转化感受态大肠杆菌JM109,经蓝-白筛选、PCR扩增等筛选阳性菌落,用EcoRⅠ酶切获取目的片段,并与EcoRⅠ酶切过的pGEX-4T-1质粒连接,重组子转化BL21感受态大肠杆菌,PCR扩增筛选出阳性菌落。基因测序并用Omega 2．0软件比较分析重组质粒中hTERT基因片段与GenBank中的已知序列的同源性。通过诱导pGEX-4T-1融合蛋白表达,用抗hTERT多抗对融合蛋白进行Western blot鉴定,薄层凝胶光密度扫描测定融合蛋白表达量。结果：PCR扩增等方法证实,人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT构建成功,其中hTERT基因片段与GenBank中相应基因同源性为98．73％,氨基酸序列同源性为99．68％。Western blot检出GST-hTERT融合蛋白,其表达量达28．4％。结论：成功构建了pGEX-4T-1-hTERT原核重组质粒并获得高度表达。     

迁移侵袭抑制蛋白 MIIP 基因 K167E 位点突变体的构建和表达

目的构建人迁移侵袭抑制蛋白（MIIP）蛋白K167E突变体的原核表达载体pGEX-4T-1-MIIP（K167E）并进行表达和纯化,为MIIP的后续功能研究提供有效工具。方法以pGEX-4T-1-MIIP重组质粒为模板,PCR扩增得到人MIIP基因（K167E）突变体的eDNA全长,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建获得pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体,经酶切鉴定及测序验证完全正确后,将其转化至大肠杆菌B121细胞中诱导表达,纯化获得GST—MIIP（K167E）融合蛋白。结果酶切鉴定和测序结果显示,pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体表达载体构建成功。经诱导表达及纯化后,成功获得的GST—MIIP（K167E）融合蛋白。结论成功构建了pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体表达载体,并获得了GST—MIIP（K167E）融合蛋白。     

含自杀基因酵母菌Fcy::Fur融合基因重组逆转录病毒表达载体的构建与鉴定

目的：构建并鉴定含自杀基因酵母菌Fcy：：Fur融合基因的重组逆转录病毒表达载体，拟将用于肿瘤的基因治疗研究。方法：设计一对PCR引物，在引物的5′端分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点。以质粒pORF5-Fcy：：Fur为模板，采用常规PCR方法扩增Fcy：：Fur融合基因，并将其分别克隆进测序载体PCS2^ 及原核表达载体pGEX-6p-1进一步进行核酸序列测定和原核诱导表达研究。用EcoRⅠ和BamHⅠ将Fcy：：Fur融合基因从测序载体上切出，按正确阅读框架克隆进pLXSN中，重组子鉴定采用PCR法和酶切消化。结果：序列测定表明，扩增的基因即为Fcy：：Fur序列．Fcy：：Fur融合基因在大肠杆菌中获得了融合表达；重组逆转录病毒表达载体经PCR及双酶切鉴定表明：Fcy：：Fur以正确方向插入到pLXSN中。结论：成功构建含有自杀基因Fcy：：Fur的逆转录病毒表达载体，为进一步进行肿瘤实验性基因治疗奠定基础。     

大鼠RGS4基因的克隆及在原核中的表达

目的构建pGEX4T-1-RGS4载体,并检测融合蛋白GST-RSG4在原核中的表达水平。方法采用RT-PCR方法,将克隆SD大鼠G蛋白信号转导调节因子(regulator of G protein signaling4,RGS4)基因全长编码区的cDNA连接到原核表达载体pGEX4T-1中,IPTG诱导原核表达,通过Western blot检测融合蛋白GST-RSG4的表达水平。结果成功构建了pGEX4T-1-RGS4载体;经IPTG的诱导,RGS4可与GST以融合蛋白的形式高效表达。pGEX4T-1-RGS4在原核内表达产物相对分子质量约为50×103,与预期融合蛋白大小一致。结论构建的重组质粒能够在大肠杆菌中高效表达。     

迁移侵袭抑制蛋白MIIP的GST融合蛋白表达及生物学活性鉴定

目的构建人MIIP蛋白与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达及生物学活性鉴定。方法 RT-PCR扩增得到人MIIP基因全长编码序列,采用重组DNA技术将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建获得重组原核表达载体pGEX-4T-1-MIIP,经酶切鉴定及测序验证完全正确后,将其转化至大肠杆菌BL21细胞中,用异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经纯化获得目的蛋白,用Western blot鉴定所得融合蛋白。结果构建了pGEX-4T-1-MIIP原核表达载体,在大肠杆菌中表达获得了GST-MIIP融合蛋白,经Glutathione Agarose纯化和Western blot检测,证实所得GST-MIIP融合蛋白具有生物学活性。结论成功获得了有生物学活性的GST-MIIP融合蛋白。     

卡波济肉瘤相关疱疹病毒潜伏相关核抗原编码基因的克隆及表达

目的：分离卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)潜伏相关核心抗原(LANA)羧基端基因(ORF73C)，并在大肠杆菌中克隆和表达。方法：设计一对PCR引物，在引物的5’端分别引入BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点，提取稳定状态的BCBL-1细胞的总DNA作模板，通过PCR扩增KSHV ORF73C，PCR产物经双酶切后按正确的读码框克隆进原核表达质粒pGEx-6p-1中，并转化大肠杆菌感受态细胞BL21，以异丙基硫代-β—D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。结果：经核酸序列测定及分析，分离、克隆的ORF73C基因与基因数据库中登记的ORF73基因的羧基端的621bp的序列有99％同源性。经IPTG诱导的重组质粒转化菌体SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳显示有大小约为46ku的融合蛋白表达。结论：初步表明ORF73C基因在大肠杆菌中获得正确表达。     

肿瘤抗原基因MAGE-3的克隆、原核表达与纯化

目的: 克隆人MAGE-3基因并进行原核表达和分离纯化. 方法: 通过RT-PCR从人黑色素瘤细胞株中扩增MAGE-3全长cDNA,经PCR扩增MAGE-3基因3′端324 bp片段,克隆入pGEX-4T-1载体,构建重组原核表达质粒pGEX/MAGE-3,对含有该质粒的大肠杆菌DH5α进行诱导表达和分离纯化.结果: 经RT-PCR扩增出大小约950 bp的基因片段,以此为模板经PCR扩增出约320 bp片段,测序结果与GenBank公布的MAGE-3序列一致,成功构建了pGEX/MAGE-3原核表达质粒,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达Mr约42 000的GST融合蛋白,纯化的蛋白纯度为89%.结论: 成功克隆了人MAGE-3基因全长cDNA并对其3′端324 bp片段编码的108个氨基酸的蛋白进行了原核表达和分离纯化,为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础.     

人乳头瘤病毒16L1-E5表达质粒的构建及其蛋白表达

目的构建人乳头瘤病毒16L1-E5的原核表达质粒,并进行表达融合蛋白,为下一步探讨该蛋白是否能作为疫苗的研究作准备。方法以本室已构建好的阳性质粒pET32（＋）／HPV16E5为模板,PCR获得E5基因,经SalI和NotI双酶切插入已构建好的pGEX4T-1／HPV16L1,通过筛选获得正确的阳性克隆pGEX4T-1／HPV16L1-E5。pGEX4T-1／HPV16L1-E5转化入BL21感受态细胞,经IPTG诱导进行目的蛋白的表达,通过测定不同时间、不同IPTG浓度和不同温度时目的蛋白表达情况,获得蛋白表达的最佳条件,SDS-PAGE和Westernblot检测蛋白表达。结果成功构建了质粒pGEX4T-1／HPV16L1-E5,在1mmol／L IPTG、34℃、4h诱导获得最大量的目的蛋白表达。结论成功构建的pGEX4T-1／HPV16L1-E5质粒能表达出目的蛋白,为进一步研究目的蛋白功能打下了坚实的基础。     

重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1的构建及表达

目的:构建人肿瘤相关抗原MAGE-1基因原核表达载体.方法:从人肝细胞性肝癌组织中提取总RNA,RT-PCR扩增出MAGE-1基因.酶切鉴定后,将其插入pGEM-T载体,再克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-1.将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4 h,SDS-PAGE及凝胶密度扫描分析目的蛋白的表达情况.结果:RT-PCR扩增出长度为927 bp的MAGE-1基因.重组表达质粒pGEX-4T-1-MAGE-1转化大肠杆菌BL21(DE3)后经诱导表达,目的蛋白约57 000,占菌体总蛋白的23%.结论:成功构建出重组原核表达载体pGEX-4T-1-MAGE-1,该载体在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达.     

一种合成人血小板因子4基因的简便有效方法

目的:用一种简便有效的方法合成hPF4基因,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行高效表达.方法:根据hPF4基因的序列,用touch-down PCR的方法合成hPF4基因,将合成的基因片断克隆到表达载体pCEX-4T-1中,构建了重组质粒pGEX-4T-1-hPF4,并将之转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达由谷胱甘肽转移酶和hPF4组成的融合蛋白.结果:用touch-down PCR的方法成功合成了hPF4基因.融合蛋白形成包含体,表达量约为全菌体蛋白的30%.结论:Touch-down PCR方法可作为合成其它目的基因的简便有效方法.BL21(DE3)/pGEX-4T-1表达系统能高效表达合成的hPF4基因,为下一步hPF4的纯化与生物学活性研究打下了基础.     

家蝇幼虫Defensin成熟蛋白序列的克隆及在原核中的表达

目的 克隆家蝇幼虫defensin成熟蛋白编码序列并在大肠杆菌中表达，为进一步的研究该基因的功能奠定基础。方法 以家蝇幼虫cDNA文库为模板扩增出defensin基因的成熟蛋白全长编码序列，构建重组原核表达载体pGEX／MDEF，转化的克隆(质粒)通过筛选并测序鉴定。重组的pGEX／MDEF在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，SDS-PAGE鉴定其表达情况和分子质量并用抗鼠GST单抗作western blot杂交进一步鉴定融合蛋白的表达。结果 以家蝇幼虫cDNA文库扩增出一条长约为140bp的cDNA片段，经测序证实其为defensin基因成熟蛋白的编码序列，它编码含40个氨基酸的蛋白质，预测其分子质量单位为4kD。被成功克隆入pGEX-4T-1载体的家蝇幼虫defensin基因的cDNA，在重组大肠杆菌BL21(DE3)中诱导可大量生成相对分子质量30KD融合蛋白。结论 成功构建了家蝇幼虫defensin基因原核表达载体，且其成熟蛋白的编码序列在大肠杆菌高效表达。为下一步表达蛋白纯化，以及研究其生物活性提供了材料。     

GST-p43/AIMP1融合蛋白表达和纯化以及与NF-L的相互作用

目的 构建人p43/AIMP1蛋白与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达纯化,通过GST-pull down方法验证其与神经中间丝轻链(NF-L)的体外直接相互作用.方法 以重组质粒pcDNA3.1-p43为模板,扩增p43/AIMP1基因,产物经纯化回收后与原核表达载体pGEX4T-1连接构建成新载体GST-p43/AIMP1,经鉴定完全正确后转化大肠埃希菌B.21(DE3),通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,并纯化获得目的蛋白;将myc-NF-L体外转染HEK293T细胞,利用GST pull-down原理和方法验证人p43蛋白与神经中间丝轻链蛋白NF-L之间的相互作用.结果 酶切鉴定和测序结果显示,成功构建了GST-p43/AIMPI融合蛋白原核表达载体;考马斯亮蓝染色和Western blotting结果显示,成功获得有生物活性的GST-p43/AIMPI融合蛋白;GST pull-down实验结果证实,p43/AIMP1与NF-L存在直接相互作用.结论 获得有生物活性的GST-p43/AIMP1蛋白,并成功应用GST pull-down方法证实p43/AIMP1与NF-L在体外存在直接的相互作用.     

TTV病毒ORF1抗原的基因克隆及原核表达

目的 扩增和克隆TTV-ORF1 DNA,构建原核表达载体并在大肠杆菌表达.方法 从TTV病毒感染者外周血中提取DNA,用PCR从中扩增出TTV-ORF1 DNA,插入载体pGEM-T Easy中;测序正确后,克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达载体pGEX-4T-1-ORF1,转化大肠杆菌BL21株进行表达.结果 成功获得TTV-ORF1编码基因并构建原核表达载体,测序结果与GenBank收录序列相一致.诱导表达得到51kD的TTV-ORF1融合蛋白,占细菌总蛋白量的27.2%.Western blot证实为目的蛋白.结论 成功获得TTV-ORF1 DNA,构建得原核表达载体并获得高效表达.为TTV的ELISA检测和疫苗提供抗原.     

人颗粒裂解肽突变子在大肠埃希菌中的构建与表达研究

目的构建NKG5突变基凶的原核表达载体并进行表达研究。方法采用寡核苷酸合成的方法,拼接成为NKG5-Set的编码序列．克隆到pGEMT载体上,测序正确后,再切下编码序列连接到质粒pGEX-4T—1中,重组表达载体转化大肠埃希菌BL21（DE3）plysS,用IPTG诱导使融合蛋白高效表达。结果成功获得重组表达载体pGEX-4T-1-NKG5-Ser,转染大肠埃希菌BL21（DE3）pLysS,诱导表达后,SDS—PAGE和免疫印迹反应均显示显示出相对分子量（Mr）为35kD的蛋白条带,证明融合蛋白表达成功。结论获得了突变NKG5与GST的融合蛋白,为进-步的工作打下了基础。     

犬博卡病毒结构基因VP2多片段原核表达载体的构建及表达条件的优化

目的 构建重组pGEX-4T-3-VP2-A、pGEX-4T-3-VP2-B、pGEX-4T-3-VP2-C、pGEX-4T-3-VP2-D原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达,对诱导表达条件进行优化,为下一步获得大量纯化的融合蛋白奠定基础.方法 应用蛋白二级结构软件,设计合成MVC-VP2基因片段引物.用PCR法扩增不同长度的cDNA片段,通过EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点分别将四个不同的片段插入到pGEX-4T-3中,构建四种原核表达重组质粒,并转化E.coli DH5α,筛选阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测定正确后,转入E.coli BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷（IPTG）诱导表达,对表达条件（诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度）进行优化,并通过SDS-PAGE鉴定.结果 酶切及测序结果证明,成功构建了四种原核表达重组体质粒pGEX-4T-3-VP2-A、pGEX-4T-3-VP2-B、pGEX-4T-3-VP2-C、pGEX-4T-3-VP2-D,成功表达四种融合蛋白,优选出IPTG诱导终浓度为0.5 mmol＆#183;L-1,诱导时间为12h,诱导温度为18℃.结论 成功构建了原核表达重组体质粒pGEX-4T-3-VP2-A、pGEX-4T-3-VP2-B、pGEX-4T-3-VP2-C、pGEX-4T-3-VP2-D,优化出最佳诱导条件,为下一步获得大量纯化的目的蛋白、制备VP2多克隆抗体奠定基础.     

鼠HMGB1蛋白的原核表达及分离纯化

目的:克隆小鼠HMGB1基因,构建原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并分离纯化获得His-HMGB1的融合蛋白.方法:脂多糖刺激后的RAW264.7细胞,提取总RNA,经RT-PCR扩增出含HMGB1的目的片段,克隆于pMD-19T载体,再亚克隆至含有pelB引导肽及His-标签肽的高效表达载体pET-26b( ),转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后行SDS-PAGE鉴定目标蛋白表达,用镍鳌合琼脂糖凝胶亲和层析法分离纯化含His-标签肽的目的蛋白.结果:经PCR扩增出大小为648 bp的HMGB1基因片段,成功构建目标蛋白的融合表达载体,经诱导表达及分离纯化,获得了约30 kD的融合蛋白.结论:构建HMGB1的融合表达载体,获得分离纯化融合蛋白His-HMGB1,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

A型流感病毒株A/Henan/703/2001(H3N2)核蛋白部分序列的原核表达

目的构建A型流感病毒核蛋白（NP）基因部分序列的原核表达质粒。并诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白。方法采用PCB方法扩增NP基因部分序列,并定向插入原核表达载体pGEX-4T-1中。转化大肠杆菌BL21．将阳性菌落经IPTG诱导目的基因融合蛋白的表达。结果扩增到NP基因部分序列,构建成重组表达质粒pGEX—S NP,并在大肠杆菌中进行了表达。结论成功构建A型流感病毒NP部分基因序列的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了目的基因融合蛋白。