CAD基因原核表达载体的构建及表达产物的活性鉴定

目的 构建pCool-GST-ICAD/CAD的表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达具有生物学活性的CAD核酸酶.方法 用PCR扩增CAD基因, 将扩增产物克隆入pCool-GST-ICAD载体中构建出pCool-GST-ICAD/CAD表达载体.经酶切和电泳鉴定正确后,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经亲和层析、离子交换层析及凝胶过滤等方法分离纯化,最后用SDS-PAGE和DNA降解实验进行鉴定.结果 构建了pCool-GST-ICAD/CAD原核表达载体,重组载体转化后表达出毫克级水平的GST-ICAD/CAD蛋白复合体.经分离纯化后得到纯度很好的CAD-ICAD蛋白复合体,在SDS-PAGE电泳上呈现清晰的两条蛋白带.经DNA降解实验证明纯化所得的CAD蛋白具有非特异性降解DNA的核酸酶作用.结论 成功制备了具有生物学活性的CAD核酸酶,为进一步研究细胞凋亡的作用机制提供了有效的制剂.     

结核分枝杆菌Zmp1基因原核表达载体的构建及表达鉴定

目的构建结核分枝杆菌锌离子依赖的金属蛋白酶1(Zmp1)基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。方法以卡介苗(BCG)基因组DNA为模板,采用PCR法扩增Zmp1基因;定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)的多克隆位点中,构建重组原核表达质粒pET-32a(+)-Zmp1;转化入大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot法鉴定。结果PCR法扩增出Zmp1基因;重组表达质粒经双酶切及基因测序鉴定构建正确;表达的重组Zmp1融合蛋白相对分子质量(Mr)约为94 000,大小与预期融合蛋白一致;重组Zmp1融合蛋白可与His标签单克隆抗体特异性结合。结论成功构建了Zmp1基因原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组Zmp1融合蛋白表达。     

凋亡素原核表达载体构建及活性测定

背景：体外合成或通过基因工程表达的凋亡素Apoptin 是一种可以特异性地诱导肿瘤细胞凋亡,而对人体正常细胞无毒性和转化活性的蛋白,为抑制肿瘤的生长提供可能。 目的：构建凋亡素基因的原核表达载体,优化诱导蛋白表达的相关条件,检测纯化所得目的蛋白的活性。 方法：将已构建好的凋亡素基因亚克隆至原核表达载体 pET-28b(+)中,将该质粒转化至大肠杆菌E.coli宿主菌中,以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)对其进行诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析目的蛋白,并检测所表达的目的蛋白对肿瘤细胞的增殖抑制作用。 结果与结论：凋亡素基因被成功的克隆至 pET-28b(+),在26 ℃、IPTG 0.5 mmol/L诱导8 h的情况下,Apoptin为包涵体表达,表达产物经 SDS-PAGE 分析,在相对分子质量约15 000的位置出现目的蛋白条带,大小与预期结果一致,经变复性和亲和层析纯化后,获得高纯度目的蛋白,进一步检测发现其对肺癌细胞H460及H1299具有一定的促凋亡作用。实验成功构建了凋亡素原核表达载体PET-28b-Apoptin,获得了具有一定生物活性的目的蛋白,为进一步研究凋亡素的功能和开发其应用价值研究奠定了基础。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植;肝移植;移植;心脏移植;组织移植;皮肤移植;皮瓣移植;血管移植;器官移植;组织工程全文链接：     

人HMGB1基因的原核表达、产物纯化及活性鉴定

目的　构建人高迁移率族蛋白 1(HMGB1)编码基因的表达载体 ,获得纯化的重组蛋白 ,研究其生物学功能。方法　通过RT PCR方法扩增出人HMGB1的编码基因 ,克隆于载体pGEM Teasy,再亚克隆于表达载体pGEX4T 2 ,经IPTG诱导可表达相对分子质量 (Mr)约 5 6× 10 3的融合蛋白GST HMGB1。经用GSTrapFF蛋白纯化柱和凝血酶行柱上酶切 ,得到纯化的重组蛋白HMGB1,用培养的人单核细胞系THP1检测蛋白活性。结果　构建了融合蛋白GST HMGB1的重组表达质粒 ,获得了Mr 约为 30× 10 3的纯化蛋白产物。该蛋白能刺激THP1细胞产生TNF α ,并能明显诱导THP1细胞的凋亡。结论　获得了纯化的人HMGB1原核表达产物 ,对研究其在脓毒症中的生物学功能具有重要的意义。     

SARS-CoV E蛋白基因的扩增及原核表达载体的构建

加拿大英属哥伦比亚癌症研究所基因组科学中心已完成了SARS冠状病毒的全基因组测序 (基因库登录号 :AY2 74 119)。SARS CoV基因组编码包括S蛋白、M蛋白、N蛋白和E蛋白等结构蛋白质。E蛋白是最小的结构蛋白 (为糖蛋白 ) ,散布于SARS病毒的包膜 ,疏水性最强 ,其核苷酸序列为 2 31bp ,编码 76个氨基酸 ,其等电点为 6 .0 1,相对分子质量为 8.36 1× 10 3。推测E蛋白的作用有利于病毒形状的形成 ,在病毒颗粒形成过程中起主要作用。本文利用已公布的SARS CoV基因组序列 ,克隆了E蛋白基因 ,以期为深入研究E蛋白的生物学功能和药物或疫…     

人CIDE-3基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达

目的:构建人CIDE-3基因的原核表达载体,并在E.coliBL21(DE3)中表达。方法:提取人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞的总RNA,经RT-PCR扩增人CIDE-3基因片段,并将其克隆入原核表达载体pET28a( )中,构建重组质粒pET28a( )-CIDE-3。经限制性内切酶BamHI、XhoI双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果:获得全长为516bp的人CIDE-3基因片段。以构建的重组质粒pET28a( )-CIDE-3转化E.coliBL21(DE3)后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量(Mr)约为23000的重组CIDE-3蛋白。SDS-PAGE分析显示,表达的蛋白主要以不溶性包涵体的形式存在于E.coliBL21(DE3)的胞质中,表达量约占全菌蛋白的32%。结论:成功地构建了原核表达载体pET28a( )-CIDE-3,并表达出重组CIDE-3蛋白,为进一步多克隆抗体的制备和凋亡的相关研究奠定了实验基础。     

人Cyclin E原核表达载体的构建及表达

目的：构建人Cyclin E基因原核表达载体,并在E.coli BL21中表达并纯化。方法：PCR扩增人Cyclin E基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET32a（＋）中,构建重组质粒pET32a（＋）-Cyclin E。经限制性内切酶EcoRⅠ与XhoⅠ双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coli BL21,经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果：获得全长约为1200bp的人的Cyclin E基因片段。以构建的重组质粒pET32a（＋）-Cyclin E转化E.coli BL21后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量（Mr）约60000的融合蛋白。经SDS-PAGE、Western blot分析显示,诱导表达的蛋白为Cyclin E。结论：成功地构建了表达载体pET32a（＋）-Cyclin E,并表达出重组蛋白His-Cyclin E,为进一步筛选在体内外能与Cyclin E和CDK2结合的新蛋白奠定了基础。     

人IL-10基因的克隆表达及表达产物活性的初步鉴定

目的:构建含人IL-10全基因序列的原核表达载体,并进行表达及产物活性的鉴定。方法:利用RT-PCR方法,从人肝癌细胞系HepG2的总RNA中扩增IL-10的全长编码序列。编码序列经测序验证后,将其克隆入表达载体PET-28 a( ),构建IL-10基因的重组原核表达载体。在大肠杆菌中诱导表达目的蛋白,表达产物采用Western blot和ELISA进行鉴定。结果:表达产物主要位于包涵体内。经Western blot分析和ELISA检测显示,表达产物的相对分子质量(Mr)同预期的结果相符,有结合抗体活性。结论:成功地扩增人IL-10全基因序列,并构建了含该基因序列的原核表达载体,在大肠杆菌中高效表达的表达产物具有抗原活性,为下一步制备抗IL-10的单克隆抗体(mAb)提供了必要的前提。     

VEGF189基因合成、原核表达及鉴定

目的 获得编码VEGF189蛋白的基因,并通过原核表达系统表达VEGF189融合蛋白.方法 应用SOE PCR技术合成VEGF189基因,克隆入pET-32a(+)原核表达载体,转化E coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE和Western blot检测,表达产物经HisTrapTM HP亲和柱层析纯化,测定蛋白浓度.结果 DNA测序分析表明,合成的VEGF189基因与文献报道相一致.在大肠杆菌BL21(DE3)中表达的Trx-VEGF189融合蛋白,以包涵体和可溶2种形式存在.表达产物可被兔抗鼠VEGF多抗特异识别.经HisTrapTM HP亲和柱纯化,获得纯度达85%的融合蛋白.结论 成功合成VEGF189基因,并在原核表达系统中获得高表达,为研制高效抗肿瘤的VEGF抗体和疫苗奠定了前期基础.     

汉坦病毒S基因的分段表达及其表达产物的鉴定

用含ＰＲＰＬ启动子的原核表达载体ＰＧＥＸ－４Ｔ系统，构建了含汉坦病毒７６－１１８株Ｓ基因全长片段（１．３ｋｂ）及部分片段（１．１ｋｂ和０．７ｋｂ）的表达载体ｐＧＥＸ－ＨａｎＳ，并大肠杆菌中分别进行了表达，用１８析具有不同特异性的抗汉坦病毒ｍＡｂ以ＥＬＩＳＡ夹心法对上述表达产物进行了检测，结果表明，重组基因组全长片段的表达产物（ＮＰ）与其中１３株抗汉坦病毒组特异性和Ｉ型特异性ＮＰ的ｍＡｂ均可发生反应     

幽门螺杆菌vacA基因毒性相关片段原核表达载体的构建和表达

目的 构建幽门螺杆菌（Hp)vac A基因片段原核表达载体并进行表达。方法 采用PCR技术,扩增Hp vac A基因的1个片段B,并克隆入pGEM－3Zf(-)质粒。测序正确后,再克隆入质粒pRSETA中,构建重组表达载体pRSETA-B。结果 经过转化E.coli BL21 DE3(plysS)后,诱导表达出相对分子质量（Mr)为33000的蛋白。SDS－PAGE分析显示,表达量占全菌总蛋白质的47．8％。清中目的蛋白占全菌总蛋白的10．9％。ELISA和Western blot分析表明,表达蛋白能与免抗Vac A多抗结合。结论 成功地构建原核表达载体pRSETA-B,为进一步探讨该片段的生物学活性,以及临床上通过检测患者血清预测Hp的感染提供了实验依据。     

小鼠肿瘤/睾丸抗原Biot2的原核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠睾丸特异表达基因Biot2的原核表达载体,表达pQE30-Biot2融合蛋白。方法提取小鼠睾丸组织总RNA,经RT-PCR扩增Biot2基因片段,并将其克隆入原核表达载体pQE30中,构建重组质粒pQE30-Biot2。经限制性内切酶BamHI、HindIII双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coliXL-Blue,经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot检测。结果构建pQE30-Biot2重组原核表达质粒,表达的融合蛋白经SDS-PAGE分析,在相对分子质量(Mr)约17700处出现了1条蛋白条带,该表达蛋白具有与His-tag单克隆抗体(mAb)特异性的结合能力。结论成功地构建了Biot2基因的原核表达载体,并表达出pQE30-Biot2重组蛋白,为下一步制备多克隆抗体和蛋白功能的深入研究奠定了实验基础。     

小鼠GM-CSF基因真核表达载体的构建及其表达活性的鉴定

目的：构建小鼠GM－GSF基因的高效真核表达载体，筛选导入该载体后高水平表达GM－CSF的小鼠淋巴瘤细胞系RMA，并探讨转GM－CSF基因瘤苗治疗小鼠T淋巴细胞瘤的方法。方法：PCR扩增小鼠GM－CSF cDNA3‘端770bp的片段，将其插入真核表达载体pcDNA3；用电穿孔法将构建的载体导入小鼠淋巴瘤细胞系RNA，有限稀释法制备单个细胞克隆，经RT－PCR、骨髓祖细胞增殖实验和集落形成实验筛选相对高表达GM－CSF的RNA克隆，该克隆细胞经丝裂霉素灭活后免疫小鼠以诱导其产生抵抗RMA肿瘤细胞再攻击的能力。结果：构建的重组质粒含有预期片段，插入方向正确，核酸序列无误，且获得了高表达GM－CSF的RMA克隆，将其用丝裂霉素灭活免疫小鼠后使它们产生了抗肿瘤免疫保护力。结论：转GM－CSF基因瘤苗可能作为有效的抗T淋巴细胞瘤瘤苗。     

葡萄球菌肠毒素A基因原核表达系统的构建及其表达产物的鉴定

 目的：构建葡萄球菌肠毒素A（SEA）基因原核表达系统，了解重组表达产物rSEA促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长的作用。方法：采用高保真PCR从金黄色葡萄球菌ATCC13565株DNA中扩增全长SEA基因片段，T-A克隆后测序，构建SEA基因原核表达系统pET32a-SEA-E.coliBL21DE3。采用SDS-PAGE检测rSEA表达量，Ni-NTA亲和层析法提纯rSEA。采用TCID₅₀法测定rSEA对Vero细胞的细胞毒性并计算TCIC₅₀值。采用MTT比色法分别检测不同浓度rSEA体外对小鼠脾细胞、人外周血单个核细胞（PBMC）的促增殖作用以及对HepG2细胞（人肝癌细胞）、HeLa细胞（人宫颈癌上皮细胞）的生长抑制作用。结果: 与公布的相关序列比较，所克隆的SEA基因核苷酸序列相似性为100%。rSEA表达量约为细菌总蛋白的25%。rSEA对Vero细胞的TCIC₅₀为3.14 μg。1.0-20.0 mg/L的rSEA对小鼠脾细胞和人PBMC均有明显的促增殖作用（P<0.05）。5.0-20.0 mg/L rSEA作用的人PBMC上清均能有效地抑制HepG2细胞和HeLa细胞生长（P<0.05）。结论:成功地构建了rSEA原核表达系统。rSEA仍然具有生物学活性。所建立的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长作用的检测方法，为以后减毒rSEA突变体的筛选奠定了基础。     

点突变SEA(D227A)的基因构建、原核表达与鉴定

目的：进行点突变的SEA(D227A)基因原核表达载体的构建，并进行表达、分离纯化与鉴定。方法：采用PCR技术从产SEA的葡萄球菌标准株中克隆SEA基因，通过下游引物上的点突变，使得到的SEA基因752位碱基突变由A突变为c，致使SEA成熟蛋白的第227位氨基酸残基由D(DAT)突变为A(GCF)，构建pRSET：SEA(D227A)重组表达质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行原核表达，再通过Western blot进行鉴定。结果：构建的SEA(D227A)基因经测序证实与设计的序列一致。成功地构建pRSET-SEA(D227A)重组表达质粒，转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，通过IPTG诱导得到分子量约为32kD的蛋白，Western blot显示其能够与抗SEA的单克隆抗体特异性结合，最后采用Ni^2 -NTA柱进行分离纯化。结论：成功地构建SEA(D227A)基因原核表达载体，并在大肠杆菌中得到高效表达，为寻找有效低毒副作用的超抗原提供了线索。     

胰岛-脑1基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的 构建并鉴定表达胰岛-脑1(Islet-Brain 1,IB1)基因的真核细胞表达质粒.方法 从人胰岛细胞瘤提取总RNA,根据IB1 cDNA文库的序列利用RT-PCR扩增IB1基因.将此基因插人带有绿荧光的真核表达载体pEGFP-N1的EcoR1/KpnI酶切位点区域,携带IB1基因的真核表达质粒转染到胰岛细胞系(RINm5F),最后通过G418筛选获得稳定的携带IB1基因的胰岛细胞系.利用倒置相差荧光显微镜、流式细胞仪、Western blot鉴定的质粒及转染的细胞系.结果 RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析为840 bp的分子(IB1 AA1-280),测序分析证明与Genbank IB1 cDNA具有相同的序列.用EcoR I和Kpn I消化可见两条条带,Western blot分析证明IB1基因在RINm5F细胞表达.结论 成功构建了pEGFP-N1-IB1真核表达载体,转染到胰岛细胞系并稳定表达.     

铜绿假单胞菌外毒素衍生物PE38KDEL的原核表达载体构建及其鉴定

目的 构建铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38KDEL)的原核表达载体并对其表达的蛋白进行鉴定.方法 采用PCR方法扩增本实验所需要的PE38KDEL基因片段,再通过酶切及连接反应构建原核表达载体pGEX-4T-1-PE38KDEL,重组载体经过限制性内切酶酶切、PCR扩增鉴定及DNA序列测定证实插入片段正确后,转化感受态大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳后及蛋白免疫印迹法分别测定其大小和特异性.结果 经鉴定证实原核表达载体pGEX-4T-1-PE38KDEL构建成功,且在大肠杆菌BL21中获得了PE38KDEL与GST的融合表达,且表达蛋白产物的分子质量大小与预期值一致,并可被PE的特异性抗体所识别.结论 PE38KDEL在大肠杆菌中获得了高效的融合表达,为下一步研究其功能奠定了基础.     

SERPINA3K原核表达系统的构建及其表达

目的：通过构建丝氨酸蛋白酶抑制因子SERPINA3K的原核表达载体,并将其转化到Rosetta-g ami2感受态细胞中,表达重组SERPINA3K,从而为对其功能的深入研究奠定了基础.方法：以小鼠MS-1细胞cDNA为模板通过PCR的方法扩增Serpina 3k基因的表达全片段,再将其插入到原核表达载体pET-41a中,酶切并测序鉴定重组体.将构建好的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta-gami2感受态细胞,表达产物用Western blot鉴定.结果：原核表达载体pET-4 1a-Serpina 3k成功构建,可在大肠杆菌Rosetta-gami2中高效表达,得到重组蛋白SERPINA3K,经Western blot鉴定正确.结论：成功构建SERPINA3K原核表达载体且获得表达,为研究SERPINA3K生物学活性及产品开发提供了实验基础.     

人IP-10融合蛋白表达载体的构建和表达及活性鉴定

目的：构建人His标记的IP-10 (interferon-γ-inducible protein 10)融合蛋白表达载体并在原核细胞中表达、纯化，获得有活性的IP-10蛋白，为进一步研究其在炎症过程中的作用机制及寻找新的抗炎途径提供基础。 方法： 从人肺cDNA文库中PCR扩增无信号肽的IP-10基因编码序列，构建重组载体pET-14b/IP-10；重组质粒经酶切、测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株；经异丙基β-D-硫代半乳糖（IPTG）诱导后，用镍离子亲和层析柱纯化融合蛋白，以THP-1细胞进行微室跨膜迁移（transwell）实验鉴定融合蛋白活性。 结果： 酶切、测序鉴定重组载体pET-14b/IP-10构建正确，并纯化得到高纯度的IP-10融合蛋白。而且该蛋白具有诱导单核细胞THP-1跨膜迁移活性。 结论： 成功构建了人IP-10融合蛋白表达载体，并纯化得到具有活性的IP-10融合蛋白，为进一步研究IP-10的功能提供了重要的实验材料。