膜片钳实验中心肌细胞快速分离方法分析

目的介绍一种膜片钳实验中简便、快速分离大鼠和豚鼠心肌细胞的方法,探讨影响细胞分离产量和质量的原因。方法迅速取出动物心脏,挂在Langendorff装置上,分别用无钙台式液和酶液进行灌流一段时间,然后剪取心室部分,置于KB液中将其剪碎吹打分散,筛网过滤将滤液放置在2℃～6℃冰箱中冷藏4h后可进行膜片钳实验。结果用此方法分离出的心肌细胞存活率高,结构完整,具有良好的耐钙性和较长的存活时间。结论控制好分离心肌细胞分离中的各种实验条件和熟练的实验操作,是分离出适合于膜片钳实验的心肌细胞的重要因素。     

大鼠心肌细胞急性分离方法及影响因素探讨

目的探讨酶解法急性分离大鼠心肌细胞的相关影响因素。方法采用改良Langendorff主动脉逆行灌流法对大鼠全心工作细胞进行酶解分离,分析分离过程中的诸多条件,从中优化最佳的分离方案,为膜片钳实验提供合格细胞。结果分离所用灌流液pH值为7.35~7.40,分离细胞的存活率最高。不同复钙方法对后续细胞存活有明显影响。三步梯度复钙后的细胞存活率明显高于一步、二步复钙法。细胞分离时,灌流速度对细胞存活率有较大影响,3mL/min流速时细胞存活率最高,不同灌流流程对分离细胞的质和量较大影响。采用钙-无钙台氏液先后灌流后再行酶解分离方式可获得长杆状、棱角分明、立体感强的心肌细胞,该细胞复钙后存活率为(56.8±2.6)%;直接使用无钙台氏液灌流后再行酶解分离方法获得(57.2±3.3)%的心肌细胞,其复钙后存活率为(36.7±3.5)%,前述方法明显优于后者。结论灌流液的pH值、灌流速度、细胞分离后的复钙方法及不同的灌流流程等因素可对大鼠心肌细胞的急性分离结果产生显著影响。     

成年小鼠心肌细胞的分离及电生理特性

目的 :摸索成年小鼠心肌细胞分离方法并观察其电生理特性。方法 :采用酶消化法分离单个心肌细胞 ,应用膜片钳全细胞记录技术记录钙电流和钾电流。结果 :本法分离所得心肌细胞横纹清晰 ,一次性复钙 ,可获得 5 0 %～6 0 %的耐钙细胞 ;并具有正常电生理活性 ,易于形成高阻封接 ,可用于钙电流和钾电流记录。结论 :本实验所采用的分离方法经济、简便、成功率高 ,所获细胞具有正常的电生理活性     

降钙素基因相关肽对正常及模拟缺血缺氧心肌钙通道的作用及心肌细胞数学模型的仿真研究

作者运用细胞培养、膜片钳和激光共聚焦技术 ,观察了降钙素基因相关肽 （CGRP）对正常及模拟缺血、缺氧心肌细胞钙通道的作用及其电生理离子机制 ,并利用计算机重建技术在心肌细胞通道动力学及电流重建等方面进行了探索性研究 ,得到了如下提示性结论 :1CGRP对心肌的保护作用有赖于适当剂量和浓度 ;2本课题建立的急性心肌细胞分离方法 ,能够得到具有正常电生理特性的耐钙心肌细胞 ,是膜片钳实验和激光扫描共聚焦技术测定胞内钙的基础 ;3CGRP对急性缺血、缺氧心肌细胞具有保护作用 ,在急性缺血、缺氧时 ,急性分离的心肌细胞胞内钙离子浓度降低 ,CGRP可引起胞内钙浓度稍微升高 ,且 CGRP可改善因急性缺血、缺氧引起的胞内钙浓度的降低 ,其机制有待于进一步探讨 ;4CGRP能促使正常及模拟缺血缺氧状态下豚鼠心室肌细胞 ICa内流的增加 ,是 CGRP正性作用的主要离子机制 ;CGRP对钙通道的作用机制还有待进一步研究 ;5本课题建立的对几种离子电流的计算机重建方法 ,提示可以被用来讨论离子电流机制 ,是一种新的途径     

正常耐钙Spraque-Dawley大鼠心室肌细胞分离方法及体会

目的探讨稳定分离用于膜片钳实验的耐钙Spraque-Dawley大鼠心室肌细胞的方法。方法在自制心脏灌流装置上,采用三步法行逆行主动脉灌流获得单个耐钙心肌细胞,以膜片钳全细胞方式记录离子流。结果在分离过程中如整个心脏保持红润,则细胞数量在90%以上,耐钙细胞KB液中孵育后在70%左右;在分离过程中心脏局部保持红润部位的细胞数量在80%以上,耐钙细胞在60%左右,而苍白区细胞数量变异较大,但一般均在50%以下,且耐钙细胞较少;在分离过程中如整个心脏始终苍白,则细胞数量不仅低于30%,且几乎没有耐钙细胞。结论在心肌细胞分离过程中如严格按照本文的介绍,能获得大量具有正常电生理特性的耐钙心肌细胞。     

成年大鼠心室肌细胞的急性分离方法

目的介绍一种新型的成年大鼠心肌细胞的急性分离方法。方法麻醉大鼠后快速取心脏,为心脏先循环灌流无钙台氏液,后循环灌流酶液,酶解完成后取左心室,迅速置于含0.5 mg/ml BSA的KB液(恒温37℃)中拉碎,吹打数次后离心,去上清,温育在含0.5 mg/ml BSA的KB溶液中35 min,梯度复钙。结果首次分离细胞存活率在80%~90%,复钙完成仍有40%~50%的细胞维持杆状,横纹清晰且90%以上细胞处于静止状态。结论通过该方法可获得稳定、高比例的存活心肌细胞,能够为成年大鼠心肌细胞原代培养及电生理学研究提供高品质细胞。     

Spraque-Dawley大鼠心室肌细胞分离和胞内钙离子浓度测定

目的 探讨Spraque-Dawley大鼠心室肌细胞分离和胞内钙离子浓度测定方法.方法 采用三步法行逆行主动脉灌流获得单个耐钙心肌细胞,然后采用胞内钙荧光测定技术测定细胞内钙离子浓度.结果 在分离过程中如整个心脏保持红润,则细胞数量在90%以上,耐钙细胞KB液中孵育后在70%左右;在分离过程中心脏局部保持红润部位的细胞数量在80%以上,耐钙细胞在60%左右,而苍白区细胞数量变异较大,但一般均在50%以下,且耐钙细胞较少;在分离过程中如整个心脏始终苍白,则细胞数量不仅低于30%,且几乎没有耐钙细胞.采用荧光探针Fura-2/AM,可准确测定细胞内钙离子浓度.结论 通过本研究采用的方法,不仅可获得大量耐钙心肌细胞,而且可准确测定细胞内钙离子浓度.     

腺病毒过表达TNNI3K基因对成年大鼠心肌细胞肌丝钙敏感度的影响

目的检测TNNI3K基因过表达对成年大鼠心肌细胞肌丝钙敏感度变化的影响,为进一步研究TNNI3K基因在心肌收缩功能、心肌肥厚、心衰及其它心脏疾病中的作用提供了可靠有效的研究模型。方法恒压Langedoff灌流装置逆向灌流法分离成年大鼠心肌细胞,之后对该心肌细胞进行逐级复钙。然后,将心肌细胞接种于改良的M199培养基中。分别感染Ad.GFP病毒和Ad.TNNI3K病毒,24小时后,以IonOptix单细胞可视化动缘系统检测心肌细胞肌丝钙敏感度。结果成功分离培养了成年大鼠心肌细胞,并在该细胞中成功过表达了TNNI3K基因。钙敏感度测定结果表明,TNNI3K基因能够增强心肌细胞肌丝钙敏感度。结论在本实验成功分离培养的成年大鼠心肌细胞中以腺病毒载体过表达TNNI3K基因,可增强心肌细胞肌丝的钙敏感度,该模型为进一步研究TNNI3K基因在心肌收缩功能中的作用及机制奠定了基础。     

溶血磷脂酸对心肌细胞胞内钙的影响

目的探讨溶血磷脂酸（LPA）心肌细胞胞内钙的影响。方法分离成年Wistar大鼠的心肌细胞,应用Fluo-4/AM荧光染料,采用逐步钙负荷的方法诱导钙促钙释放。观察不同浓度（0.1、1、5、10、20μmol/L）的LPA对心肌细胞钙促钙释放的影响,并在不同起搏频率（0.25、0.5、1.0 Hz）下观察LPA（10μmol/L）对心肌细胞胞内钙曲线峰值及其变异性的影响。结果 0.1μmol/L的LPA并不影响钙促钙释放次数;从1μmol/L开始及更高浓度（5、10、20μmol/L）可以促进心肌细胞发生钙促钙释放,但这种效应并没有表现出浓度依赖性。同时,LPA（10μmol/L）能显著增加心肌细胞在起搏状态下的胞内钙曲线峰值和0.25、0.5 Hz起搏频率下的变异性。结论 LPA能促进心肌细胞钙促钙释放,并破坏起搏状态下心肌细胞的钙稳态。     

成熟心肌细胞的培养技术

成熟心肌细胞的培养 ,首先要成功地无菌分离成熟的心肌细胞 ,这比单纯地分离成熟心肌细胞或单纯地培养胚胎期和新生期心肌细胞较困难。一般可作典型的L angandorff装置 ,配合无菌操作要求来得到用于培养的无菌成熟心肌细胞。实验动物等都经消毒灭菌 ,分离仪器保存在分层的通风橱中 ,以免在分离过程上空气传播的污染物污染溶液。其它预防污染的方法有 :1用 70 %酒精彻底清洗分离装置 ,用无菌去离子水冲洗 ,在心脏灌流之前至少要进行两次冲洗 ;2在即将开始分离之前 ,对易于拆卸的装置进行灭菌 ,然后重新装好。分离用灌流液、酶液、保存液及培…     

心肌细胞裂解液对骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化诱导作用的研究

目的通过向骨髓间充质干细胞(MSCs)培养体系中添加心肌细胞裂解液的方法,体外模拟心肌微环境,观察MSCs向心肌细胞分化的诱导作用,并与诱导分化剂5-氮杂胞苷(5-aza)比较。方法分离新生乳鼠的心肌细胞并制成心肌细胞裂解液,自成年大鼠骨髓中分离MSCs,用含有心肌细胞裂解液的培养基(A组)、含有5-aza的培养基(B组)、含有5-aza和心肌细胞裂解液的培养基(c组)以及普通培养基(对照组)培养。观察细胞形态的改变,并通过免疫组化分析分化后细胞表达α-肌动蛋白、心脏特异性肌钙蛋白T(cTnT)、连接蛋白43及CD31的情况。结果A、B组的MSCs在培养1周后均形成肌细胞形态,并且均表达α-肌动蛋白和cTnT;A组MSCs分化的肌样细胞所含的肌纤维较B组更丰实,细胞生长趋势也优于B组,并且可以表达CD31;B组MSCs分化的肌样细胞不表达CD31;对照组细胞仅表达α-肌动蛋白。结论心肌细胞裂解液是体外诱导MSCs分化为心肌样细胞的理想条件,优于传统的5-aza,在心肌细胞移植技术中可以用于体外模拟心肌细胞微环境。     

狗心肌细胞内钙、镁、铜、锌含量测定的研究

本文介绍一种分离狗心肌细胞及其钙、镁、铜、锌离子含量测定方法。活检心肌组织经酶分离的心肌细胞中,75～80%保持了细胞形态结构的完整性。电生理记录到静息电位(-70μV)和动作电位波形,并产生频率响应性兴奋收缩。本文建立的心肌细胞内钙、镁、铜、锌离子含量测定方法具有较理想的准确度和精密度。     

溶血磷脂酸对幼年大鼠心肌细胞收缩和钙瞬变的影响

目的我们前期的研究发现LPA受体在幼年大鼠心脏的表达显著高于成年的表达,提示LPA信号在心脏收缩功能尚未成熟时可能具有更为重要的调节作用。本研究通过观察LPA对此未成熟阶段心肌细胞钙瞬变和收缩力的作用,探讨LPA信号对幼年心肌兴奋-收缩耦联的影响。方法 Langendorff装置逆向灌流胶原酶分离获得不同发育阶段大鼠心肌细胞;采用IonOptix细胞收缩和钙离子浓度同步测定系统进行心肌细胞收缩力和钙瞬变的测定;Western blot检测不同发育阶段心肌细胞LPA受体的表达。结果 LPA对出生后14天和21天大鼠心肌细胞的收缩和钙瞬变均没有显著影响,表明LPA信号并不参与出生后14-21天大鼠心肌细胞的兴奋-收缩耦联过程和心肌细胞收缩。在大鼠出生后发育过程中,LPA受体在心肌细胞的表达在出生后14天已显著下调,不同于在整体心脏表达下调的时间点(P21d),这可能是LPA对此发育阶段心肌细胞的收缩和钙瞬变均不产生影响的原因,提示在出生后14天LPA信号对心肌细胞的发育调节功能可能即已减弱或消失。结论 LPA信号对出生后14天及之后心肌收缩和钙瞬变无显著影响,但尚不能排除LPA对出生后更早期的未成熟心肌细胞收缩和兴奋-收缩耦联的作用。     

犬心房肌细胞分离的方法学探讨

目的建立稳定的适于膜片钳实验研究的犬心房肌细胞分离方法。方法取健康成年犬心脏12个,采用Langendorff灌流,行回旋支插管,正常台式液灌流10 s,使心脏自主收缩排除残留余血。持续高钾液灌流,同时结扎其他血管及分支,剪去其余心脏组织,待左房及左心耳充盈,无钙台氏液灌流5 min,125 U/ml胶原酶Ⅱ200ml反复灌流消化约30~45 min,后用无钙台氏液冲洗心脏5 min,剪下心房肌组织,KB液中室温下剪碎,吹打,孵育5 min后,用200目筛网过滤,逐步复钙法复钙后,室温静置1 h,应用于膜片钳记录。结果分离的活性心肌细胞比率约90%,形态呈杆状、横纹清晰、膜周边光滑完整。结论采用本方法可以获得高产量与高质量的用于膜片钳离子流检测的心房肌细胞。     

各部位心肌细胞的分离技术

单个心肌细胞是进行膜片钳实验所必需的，同时制备单个心肌细胞又是十分困难的。本文回顾了心肌细胞分离的历史，介绍了分离心肌细胞的一般方法和应注意的问题，并详细讨论了心脏不同部位组织细胞分离的具体步骤。     

各部位心肌细胞的分离技术

单个心肌细胞是进行膜片钳实验所必需的，同时制备单个心肌细胞是十分困难的。本文回顾了心肌细胞分离的历史，介绍了分离心肌细胞的一般方法和应注意的问题，并详细讨论了心脏不同部位组织细胞分离的具体步骤。     

代谢性抑制预处理中Na+/Ca2+交换体反向转运的激活触发预处理后的心肌保护作用（英文）

目的研究大鼠心室肌细胞在代谢性抑制预处理中钠/钙交换体（NCX）反向转运的活性,以及NCX反向转运抑制剂是否可以阻止代谢性抑制预处理后的心肌保护作用。方法酶解法分离制备钙耐受心肌细胞,用Fura2/AM负载,采用双激发荧光光电倍增系统（IonOptixPhotometrySystem）检测钙信号,用单心肌细胞动缘探测技术观察心肌细胞收缩/舒张功能,台盼蓝染色法检测细胞存活率。结果在代谢性抑制预处理30min时,NCX反向转运被激活。NCX反向转运抑制剂KBR7943（0.5μmol/L）可以抑制代谢性抑制预处理对心肌细胞收缩功能和细胞存活率的作用。NCX激动剂E4031（1μmol/L）可以模拟代谢性抑制预处理后对心肌细胞收缩功能的保护作用,这一作用也可被KBR7943阻断。结论代谢性抑制预处理中,NCX反向转运的激活触发了代谢性抑制预处理后的心肌保护作用;NCX的抑制剂可以阻止代谢性抑制预处理后的心肌保护作用。     

代谢性抑制预处理中Na+/Ca2+交换体反向转运的激活触发预处理后的心肌保护作用

目的研究大鼠心室肌细胞在代谢性抑制预处理中钠/钙交换体(NCX)反向转运的活性,以及NCX反向转运抑制剂是否可以阻止代谢性抑制预处理后的心肌保护作用。方法酶解法分离制备钙耐受心肌细胞,用Fura2/AM负载,采用双激发荧光光电倍增系统(IonOptixPhotometrySystem)检测钙信号,用单心肌细胞动缘探测技术观察心肌细胞收缩/舒张功能,台盼蓝染色法检测细胞存活率。结果在代谢性抑制预处理30min时,NCX反向转运被激活。NCX反向转运抑制剂KBR7943(0.5μmol/L)可以抑制代谢性抑制预处理对心肌细胞收缩功能和细胞存活率的作用。NCX激动剂E4031(1μmol/L)可以模拟代谢性抑制预处理后对心肌细胞收缩功能的保护作用,这一作用也可被KBR7943阻断。结论代谢性抑制预处理中,NCX反向转运的激活触发了代谢性抑制预处理后的心肌保护作用;NCX的抑制剂可以阻止代谢性抑制预处理后的心肌保护作用。     

胚胎期及出生后不同年龄段小鼠心肌细胞体外分离方法及优化

目的:基于目前已有报道的心肌细胞体外消化及分离方法,对胚胎期及出生后不同年龄段小鼠心肌细胞体外分离的方法进行系统探索和优化。方法:取胚胎期及出生后不同年龄段小鼠心脏,运用不同方法分离心肌细胞。利用Count Star仪器检测心肌细胞大小及活性。取细胞悬液涂片,针对心肌细胞标志物α辅肌动蛋白(α-actinin)表达进行免疫荧光染色,用共聚焦显微镜观察心肌细胞形态。结果:用胰酶消化法分离胚胎期小鼠心肌细胞,获得存活率大于94%的心肌细胞。用心脏解离试剂盒法(Gentle MACS法)体外分离新生小鼠(出生后1～3 d)心肌细胞,获得存活率约为97%的心肌细胞。分别用Gentle MACS法、非Langendorff灌流法分离出生后4 d和7 d的小鼠心肌细胞,前者仅获得存活率为58%的心肌细胞,而后者获得的心肌细胞存活率为70%～80%。对于成年小鼠,非Langendorff灌流法和Langendorff灌流法均可获得杆状率、存活率都在70%左右的心肌细胞。结论:结合文献以及本实验结果发现,分离胚胎期小鼠心肌细胞可用胰酶消化法;分离出生后1～3 d小鼠心肌细胞可用Gentle MACS法。对于出生后4 d和7 d的小鼠,非Langendorff灌流法可获得存活率及杆状率均较高的心肌细胞,分离成年小鼠心肌细胞则适合用非Langendorff灌流法和Langendorff灌流法。     

改良成年小鼠心室肌细胞分离方法

目的 小鼠是优良的背景基因动物,分离成体原代心肌细胞可以真实地从细胞和分子水平反映单个心室肌细胞的功能。小鼠心室肌细胞的分离和大鼠相比较困难,分离获得的细胞存活率较低,为提高小鼠心室肌细胞的成活率和收获量,本研究团队通过艰苦的摸索,改进了小鼠成体心肌细胞的分离方法。方法 该方法采用心脏在体主动脉插管,行独创的前加压灌流法冲洗心脏后接入改进的langendorff装置,用胶原酶液II灌流、消化心脏后,将心脏剪碎并用吸管吹打,经200目滤网过滤后获得单个小鼠心室肌细胞。本研究检测并对比了在体和离体主动脉插管获得的心肌细胞的状态：梯度复钙后,在倒置显微镜下观察细胞的形态和杆状心室肌细胞的数目。结果 研究结果显示：改良的主动脉逆行灌流法在缩短手术时间的同时,提高了小鼠心室肌细胞收获量和存活率。本课题组利用医用三通管,独创倒置灌流排气法,可以迅速排空灌流装置中的气体;利用注射器和灌流针结合,独创前加压灌流法,可以快速彻底地冲洗心脏中的血液;并采用实验室常规眼科镊和血管钳巧妙组合成协助装置,可以单人独立完成插管,不需要助手协助,节约人力,节省经费开支。结论 这一方法的改进使整个实验流程简化,缩短了实验时间,操作简便易学;同时该分离方法稳定、可靠、有效,可以为同类型实验提供思路和借鉴。