环指蛋白11调控Akt信号通路促进BMSCs成骨分化的机制研究北大核心CSCD

目的研究BMSCs成骨分化过程中环指蛋白11(ring finger protein 11,RNF11)对Akt信号通路的调节作用,为进一步阐明BMSCs成骨分化机制和用于临床治疗提供思路。方法从健康人体新鲜骨髓中分离培养BMSCs并传代,取第4代细胞经流式细胞术,成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定后用于实验。BMSCs成骨诱导分化培养0~14 d,通过茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度,并用Western blot法检测RNF11蛋白表达。取第4代BMSCs,分为空白对照组(A组)、空载慢病毒(Lv-NC)组(B组)和敲低RNF11(Lv-ShRNF11)组(C组),成骨诱导分化培养0~14 d,采用Western blot检测RNF11蛋白表达,茜素红染色和ALP染色检测其成骨分化程度,14 d实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测BMSCs成骨标志物Runx2、骨钙素(osteocalcin,OCN)及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的mRNA相对表达量;采用Western blot检测Akt、Smad1/5/8及β-catenin信号通路蛋白相对表达量,以磷酸化前后比值表示。为研究RNF11对Akt信号通路的影响机制,取第4代BMSCs分为Lv-NC转染组(A1组)、Lv-ShRNF11转染组(B1组)和添加Akt信号通路激活剂SC79的Lv-ShRNF11转染组(C1组),14 d时采用Western blot检测RNF11和Akt信号通路蛋白相对表达量,茜素红染色、ALP染色及qRT-PCR检测成骨相关指标。结果流式细胞术及成骨、成软骨和成脂诱导培养鉴定显示分离培养细胞为BMSCs。RNF11蛋白相对表达量随成骨分化时间延长而逐渐增加(P<0.05);下调RNF11后,茜素红和ALP染色示C组相较于A、B组BMSCs成骨分化程度降低,qRT-PCR检测示Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量减少(P<0.05)。随成骨分化时间延长,RNF11与Akt信号通路蛋白相对表达量均上升(P<0.05)。下调RNF11后,C组相较于A、B组,其Akt信号通路蛋白相对表达量显著降低(P<0.05),而对Smad1/5/8以及β-catenin信号通路蛋白相对表达量无明显影响(P>0.05)。B1、C1组相较于A1组,其RNF11蛋白相对表达量减少(P<0.05),B1组相较于A1、C1组,其Akt信号通路蛋白相对表达量降低(P<0.05);茜素红与ALP染色示C1组BMSCs成骨分化程度稍低于A1组(P>0.05),而明显高于B1组(P<0.05);qRT-PCR检测示C1组Runx2、OCN、OPN mRNA相对表达量稍低于A1组(P>0.05),而明显高于B1组(P<0.05)。结论RNF11通过正向调控Akt信号通路激活水平促进BMSCs向成骨细胞分化。RNF11可作为提高BMSCs修复骨缺损疗效以及治疗骨代谢病的潜在靶点。     

低氧预处理对大鼠BMSCs葡萄糖代谢的影响

目的观察低氧预处理对BMSCs葡萄糖代谢的影响,探讨其潜在机制,为干细胞疗法的优化提供理论依据。方法取1～3日龄SD大鼠骨髓,采用密度梯度离心法获得BMSCs,取第4代细胞用于实验。根据处理方法不同将细胞分为4组:A组采用常氧培养24 h;B组以1%低氧浓度培养24 h;C组于低氧预处理前用20μmol/L甲氧雌二醇处理24 h;D组于低氧预处理前用50μmol/L缺氧诱导因子1(hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)特异的siRNA处理12 h。采用MTT法、生化分析仪及实时荧光定量PCR检测各组BMSCs活力、葡萄糖代谢以及HIF-1αmRNA及葡萄糖转运蛋白1(glucose transporter 1,Glut-1)mRNA的表达。结果 MTT检测示A、B、C、D组吸光度(A)值分别为387.67±58.92、322.50±50.60、297.00±53.00、286.00±41.00,各组间差异无统计学意义(P>0.05)。与A组相比,B组葡萄糖摄取量和乳酸生成量显著增加(P<0.05);C、D组略高于A组,但差异无统计学意义(P>0.05),但显著低于B组,差异有统计学意义(P<0.05);C、D组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。与A组相比,B组HIF-1αmRNA和Glut-1 mRNA表达均显著上调(P<0.05);C、D组HIF-1αmRNA和Glut-1 mRNA表达较B组大幅度降低(P<0.05),但仍显著高于A组(P<0.05);C、D组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论低氧预处理可上调大鼠BMSCs的葡萄糖摄取和代谢能力,其机制涉及HIF-1 mRNA及其下游基因Glut-1 mRNA的表达上调。     

血清对神经干细胞分化的影响北大核心CSCD

目的探讨血清对神经干细胞分化过程的影响。方法取孕14 d SD大鼠胚胎脑组织,分离培养神经干细胞并传代。取第3代细胞倒置相差显微镜下观察细胞形态,并行巢蛋白(Nestin)免疫细胞化学染色鉴定。将鉴定后的细胞分为A、B、C 3组,各组细胞培养基除FBS浓度不同(分别为5%、1%、0)外,其余成分均一致。培养第8天,行活/死细胞染色观察细胞生长情况;培养第4、8天,行免疫细胞化学染色以及实时荧光定量PCR检测,观察胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、Ⅲ型β神经元微管蛋白(β-Ⅲ Tubulin)表达。结果经细胞形态及免疫细胞化学染色鉴定培养细胞为神经干细胞。培养第8天,活/死细胞染色示A、B、C组细胞均无死亡现象。免疫细胞化学染色示,培养第4、8天,A、B、C组GFAP蛋白表达随FBS浓度降低而逐渐减弱,但β-Ⅲ Tubulin表达逐渐增强;各组第8天时染色均较第4天时增强。实时荧光定量PCR检测示,培养第4天和第8天3组间GFAP mRNA及β-ⅢTubulin mRNA相对表达量比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论血清能促进神经干细胞向胶质细胞分化,并减缓其向神经元分化速度,且血清浓度越低,该影响越小。     

周期性张力对骨髓间充质干细胞分化的血管平滑肌细胞的表型调节

目的 探讨周期性张力对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)诱导分化的血管平滑肌细胞(VSMCs)的表型的调节机制.方法 原代全骨髓法培养大鼠BMSCs,流式细胞术鉴定细胞.作成脂、成骨、成平滑肌细胞方向诱导,验证BMSCs的多向分化潜能.将细胞分为4组:A组用含10 μg/L转化生长因子-β1(TGF-β1)的完全培养基培养,B组用幅度10％、频率1 Hz周期性张力诱导,C组采用TGF-β1+周期性张力联合诱导,D组用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基培养作对照.3d后观察诱导后的细胞形态,并行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肌动蛋白(α-actin)、平滑肌肌球蛋白重链(SM-MHC)、钙调节蛋白1(calponin1)、钙调节蛋白3(calponin3)的mRNA表达水平,Western blot观察细胞内α-actin、SM-MHC、calponin1、calponin3蛋白表达水平.结果 经流式细胞术鉴定,所培养细胞为BMSCs.诱导3d后,A、B、C3组的VSMC标志物均较D组明显升高,以SM-MHC和calponin3增加为主.A组(0.919 2±0.028 1)较B组(0.823 6±0.024 6)的SM-MHC蛋白表达水平高,但低于C组(1.043 1±0.090 7),其差异均有统计学意义(P＜0.05).C组中calponin3 mRNA表达量比蛋白表达量变化更明显,而calponin1蛋白表达量和mRNA表达量同步增高.结论 周期性张力能够诱导BMSCs分化为VSMCs,对分化的VSMCs的表型调节还需要细胞因子的参与.     

人羊膜间充质干细胞来源的雪旺细胞样细胞移植在皮瓣神经再生中的作用

目的通过将人羊膜间充质干细胞(human amniotic membrane mesenchymal stem cells,hAMSCs)在体外诱导分化为雪旺细胞样细胞(Schwann cells-like cells,SCs-like cells),分别观察两种细胞移植对皮瓣神经再生的作用。方法采用胰蛋白酶/胶原酶二步消化法分离提取hAMSCs并传代,流式细胞术和免疫荧光法鉴定hAMSCs。取第3代培养6 d的hAMSCs体外诱导分化为SCs-like cells,诱导分化19 d后,分别采用免疫荧光法、Western blot及实时荧光定量PCR(real time fluorescent quantitative PCR,qPCR)检测SCs-like cells和第3代培养6 d的hAMSCs中S-100、p75和神经胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)的表达;ELISA检测第3代培养6 d的hAMSCs以及加入诱导液1、2、3诱导后19 d内上清液中BDNF和NGF表达量。另取SD雌性大鼠75只,建立大鼠腹壁失神经支配穿支皮瓣模型,分为3组(n=25),A、B、C组分别于大鼠皮瓣标记处皮下多点注射培养6 d处于增殖期的第3代hAMSCs 1×10~6个、SCs-like cells 1×10~6个和等体积PBS,分别于移植后2、5、7、9、14 d采用免疫荧光法观察神经丝重链多肽抗体(neurofilament heavy polypeptide antibody,NF-01)阳性表达的神经再生情况。结果经流式细胞术和免疫荧光法鉴定提示培养的细胞为hAMSCs。免疫荧光法、Western blot及qPCR检测结果显示,SCs-like cells的S-100、p75和GFAP阳性细胞百分比、蛋白表达量及基因相对表达量均明显高于hAMSCs,差异均有统计学意义(P0.05)。ELISA检测示:第3代培养6 d的hAMSCs中加入诱导液1后,BDNF和NGF表达量明显降低,随着诱导液2及诱导液3的依次添加,BDNF和NGF表达量逐渐升高,且浓度明显高于第3代培养6 d的hAMSCs,各时间点间差异均有统计学意义(P0.05)。免疫荧光法观察示,移植后5~14 d B组再生神经纤维数高于A组和C组。结论 hAMSCs在体外经适当的化学因子调节后可诱导分化为SCslike cells,在诱导分化过程中释放了大量促进神经生长的因子;且SCs-like cells移植后通过释放大量BDNF和NGF,在神经再生数量方面高于hAMSCs移植。     

阿仑膦酸钠对IL-1β体外诱导培养的大鼠膝关节软骨细胞影响的实验研究

目的二膦酸盐类药物可抑制骨重塑,通过观察阿仑膦酸钠(alendronate,ALN)对IL-1β体外诱导培养的大鼠膝关节软骨细胞的影响,探讨ALN治疗骨性关节炎(osteoarthritis,OA)的可行性。方法取15只1月龄SPF级SD大鼠(雌雄不限,体重100～150g)膝关节软骨,体外培养软骨细胞并传至第3代。倒置相差显微镜下观察细胞形态并进行鉴定。将第3代软骨细胞分为3组:空白对照组(A组)软骨细胞用常规DMEM完全培养液培养5d;IL-1β诱导组(B组)软骨细胞以10ng/mL重组人IL-1β培养2d后更换为常规DMEM完全培养液培养3d;IL-1β诱导后加ALN培养组(C组)软骨细胞以10ng/mL重组人IL-1β培养2d后更换为浓度为1×10-6mol/L的ALN培养3d。培养后取各组细胞进行免疫细胞化学染色及实时PCR检测,观察细胞中Ⅱ型胶原(collagen typeⅡ,ColⅡ)、基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase13,MMP-13)和β-连环蛋白(β-catenin)的表达水平。结果甲苯胺蓝染色示培养的细胞呈异染性,证实为软骨细胞。免疫细胞化学染色显示:A、B、C组ColⅡ表达积分吸光度(IA)值分别为15.3770±0.5718、5.4632±0.4504、10.2907±0.4992,C组高于B组,但低于A组,差异有统计学意义(P<0.05);MMP-13表达IA值分别为2.7775±0.1996、6.9981±0.3297、3.0686±0.2056,C组明显低于B组(P<0.05),但与A组比较差异无统计学意义(P>0.05);β-catenin表达IA值分别为4.3903±0.5519、11.7999±0.3487、6.6117±0.3818,C组低于B组,但高于A组,差异均有统计学意义(P<0.05)。实时PCR检测示,C组ColⅡmRNA表达高于B组,MMP-13及β-catenin的mRNA表达低于B组,比较差异均有统计学意义(P<0.05);ColⅡ和β-catenin mRNA表达高于A组,MMP-13mRNA表达低于A组,比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 ALN可能通过抑制IL-1β诱导的大鼠膝关节软骨细胞中ColⅡ的降解并下调MMP-13及β-catenin因子的表达,对软骨细胞具有一定的保护作用。     

不同时期bFGF或副甲状腺激素相关肽对TGF-β1诱导的兔BMSCs向软骨细胞分化的影响

目的探讨bFGF和副甲状腺激素相关肽(parathyroid hormone-related protein,PTHrP)对TGF-β1诱导兔BMSCs向软骨细胞分化的影响。方法 2月龄健康日本大耳白兔3只,雌雄不限,体重1.6～2.1 kg;取兔胫骨骨髓分离培养BMSCs。取第3代细胞行团块状立体培养,并按照不同诱导条件分为TGF-β1组(A组)、TGF-β1/bFGF组(B组)、TGF-β1/21 d bFGF组(C组)、TGF-β1/PTHrP组(D组)、TGF-β1/21d PTHrP组(E组)。于团块状立体培养开始时,各组均加入10 ng/mL TGF-β1;B、D组同时加入10 ng/mL bFGF或10 ng/mL PTHrP;C、E组于培养21 d时对应加入10 ng/mLbFGF或10 ng/mL PTHrP。培养后1、2、3、4、5、6周检测各组BMSCs向软骨细胞分化的标志性基因Ⅰ型胶原(collagentypeⅠ,ColⅠ)、ColⅡ、ColⅩ和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)13的表达,1、2、3、4、6周检测ALP活性,6周时行1,9二甲基亚甲蓝(1,9-dimethylmethylene blue,DMMB)染色观察细胞外基质分泌情况。结果 RT-PCR检测示,3周后C、E组ColⅠ基因表达呈显著下降趋势,4、5周时A组显著高于C、E组(P<0.05),3～6周A组显著高于B、D组(P<0.05);B、C组3、4周时及D、E组3周时比较,差异有统计学意义(P<0.05)。C、E组3周后ColⅡ、ColⅩ基因表达均逐渐下降,4～6周时显著低于A组(P<0.05);B、D组各时间点两基因表达均未见显著升高,与A组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。A组各时间点MMP-13均未见明显表达,3周时B组与A、C组比较差异有统计学意义(P<0.05),D组显著高于A、E组(P<0.05)。随着时间延长A组ALP活性逐渐升高,4周后C、E组显著下降,均低于A组(P<0.05);B、C组间及D、E组间比较,仅在2、3周时差异有统计学意义(P<0.05)。DMMB染色显示6周时A组软骨陷窝明显,其余各组软骨陷窝明显较少。结论 bFGF和PHTrP能通过改变软骨细胞外基质的合成和分解,抑制TGF-β1诱导的兔BMSCs向软骨细胞分化。这种抑制作用不仅通过抑制ColⅩ基因表达而实现,可能还通过抑制其他软骨分化相关蛋白实现。     

生长分化因子7体外促进BMSCs向肌腱细胞分化的研究

目的探讨生长分化因子7(growth differentiation factor7,GDF-7)在体外能否促进BMSCs向肌腱细胞分化,为改善BMSCs修复肌腱疗效提供依据。方法采用密度梯度离心法从绿荧光大鼠骨髓组织中分离培养BMSCs,通过成骨、成脂和成软骨分化鉴定其多向分化能力。取第3代BMSCs根据成肌腱培养液中加入不同浓度GDF-7(0、12.5、25.0、50.0ng/mL),分为A、B、C、D组。体外诱导培养2周后,实时荧光定量PCR检测各组scleraxis、tenomodulin、tenascinC和Ⅰ型胶原mRNA表达,免疫细胞化学染色观察tenomodulin、tenascinC和Ⅰ型胶原蛋白表达,Western blot法检测A、C组tenomodulin蛋白的表达。结果经鉴定,分离培养的BMSCs具有成骨、成脂和成软骨分化的多向分化能力。实时荧光定量PCR检测结果示,B、C、D组的tenomodulin mRNA表达分别较A组增加了2.85、3.41、3.07倍(P<0.05),scleraxis mRNA表达增加了2.13、1.50、2.56倍(P<0.05),tenascin C mRNA表达增加了2.45、2.86、1.88倍(P<0.05),但B、C、D组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。B、C组Ⅰ型胶原mRNA表达较A组分别增高了1.92和2.45倍(P<0.05);D组较A组有所增高,但差异无统计学意义(P>0.05)。免疫细胞化学染色示,B、C、D组均有tenomodulin、tenascin C和Ⅰ型胶原蛋白表达,而A组均未表达;除C组Ⅰ型胶原表达高于B、D组外,其他蛋白表达B、C、D组间无明显差异。Western blot检测示C组比A组有更高的tenomodulin蛋白表达。结论 GDF-7在体外能促进大鼠BMSCs向肌腱细胞分化。     

骨髓基质干细胞治疗脊髓损伤的体外诱导分化及相关蛋白表达

目的 探讨模拟脊髓细胞环境下骨髓基质干细胞(BMSCs)的分化及蛋白差异表达.方法 分离培养Wistar大鼠骨髓的BMSCs和脊髓的神经细胞,设立BMSCs自然分化组、与神经细胞共培养组和双层培养组,8 d后对各组BMSCs进行神经特异性烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光检测.应用表面增强激光解析离子化-飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)筛选双层培养组BMSCs变化明显的蛋白进行分析.结果 BMSCs与神经细胞共培养和双层培养8 d后,BMSCs呈神经细胞形态.NSE和GFAP检测结果 ,BMSCs与神经细胞共培养组明显高于BMSCs与神经细胞双层培养组(P＜0.05),而BMSCs和神经细胞双层培养组又明显高于BMSCs自然分化组(P＜0.05).SELDI-TOF-MS检测到TIP39_RAT和CALC-RAT增加到原来的5.360和2.807倍,INSL6-RAT、PNOC_RAT和PCSK1_RAT减少到原来的38.0%、49.9%和43.8%.结论 在脊髓神经细胞微环境下体外培养BMSCs能诱导其分化成神经细胞,而且接触培养分化率高;BMSCs在向神经细胞分化机制中与TIP39_RAT、CALC_RAT、INSL6_RAT、PNOC_RAT和PCSK1_RAT密切相关.     

血清对神经干细胞分化的影响

目的探讨血清对神经干细胞分化过程的影响。方法取孕14 d SD大鼠胚胎脑组织,分离培养神经干细胞并传代。取第3代细胞倒置相差显微镜下观察细胞形态,并行巢蛋白(Nestin)免疫细胞化学染色鉴定。将鉴定后的细胞分为A、B、C 3组,各组细胞培养基除FBS浓度不同(分别为5%、1%、0)外,其余成分均一致。培养第8天,行活/死细胞染色观察细胞生长情况;培养第4、8天,行免疫细胞化学染色以及实时荧光定量PCR检测,观察胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、Ⅲ型β神经元微管蛋白(β-Ⅲ Tubulin)表达。结果经细胞形态及免疫细胞化学染色鉴定培养细胞为神经干细胞。培养第8天,活/死细胞染色示A、B、C组细胞均无死亡现象。免疫细胞化学染色示,培养第4、8天,A、B、C组GFAP蛋白表达随FBS浓度降低而逐渐减弱,但β-Ⅲ Tubulin表达逐渐增强;各组第8天时染色均较第4天时增强。实时荧光定量PCR检测示,培养第4天和第8天3组间GFAP mRNA及β-ⅢTubulin mRNA相对表达量比较,差异均有统计学意义(P0.05)。结论血清能促进神经干细胞向胶质细胞分化,并减缓其向神经元分化速度,且血清浓度越低,该影响越小。     

NGF、BDNF基因修饰的BMSCs静脉注射治疗脊髓损伤

[目的]探讨神经生长因子（nerve growth factor，NGF）和脑源性神经生长因子（brain derived nerve growth factor，BDNF）基因修饰的骨髓基质细胞（bone marrow stem cells，BMSCs）静脉移植治疗脊髓损伤。[方法]SD大鼠制备成脊髓损伤动物模型。随机分为损伤对照组（A组）、BMSCs静脉移植组（B组）、NGF、BDNF基因修饰的BMSCs静脉移植组（C组）、正常对照组（D组）。治疗后2、6、10周，每组动物分别进行联合行为评分（GBS）、运动诱发电位（MEP）、感觉诱发电位（SEP）检查、双下肢功能测定（爬坡试验），评价脊髓损伤功能恢复情况。[结果]随时间的延长，C组GBS、MEP、SEP及下肢功能明显改善。与其他组相比较，差异有显著性，P〈0．05。[结论]NGF、BDNF基因修饰的BMSCs静脉移植能部分恢复损伤脊髓的功能。     

同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的时效性分析

目的：观察脊髓损伤后不同时间点骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）移植治疗后大鼠行为学变化、脊髓的病理改变及脑源性神经营养因子（brain—derived neurotrophic factor,BDNF）和神经生长因子（nervegrowthfactor,NGF）表达变化,探讨BMSCs的最佳移植时间。方法：80只健康成年SD大鼠随机分为8组,每组10只。A组为假损伤组,暴露胸10段脊髓但不造成冲击伤,B、C、D、E、F、G、H组以改良Allen法建立脊髓损伤模型。造模成功后,C、D、E、F、G、H组分别于损伤后0h、6h、24h、3d、5d和7d,将lxl0。体外培养的BMSCs用微量注射器注入于脊髓损伤局部,B组为单纯造模组,用等量细胞培养液代替。各组分别于损伤后1、2、4周进行脊髓运动功能BBB（Basso,Beattie,Bresnahan）运动学评分;分别取各组脊髓损伤组织0．5cm,制作HE染色病理切片,观察其形态学改变;Elisa法检测各组大鼠脊髓BDNF和NGF表达情况。结果：假手术组1、2、4周大鼠脊髓功能BBB评分均明显高于其余7组（P〈0．01）;术后l周细胞移植各组评分与单纯造模组相比差异无统计学意义（P〉0．05）;术后2周和4周细胞移植各组评分高于单纯造模组（P〈0．05）;损伤后2周BBB评分从高到低依次为F、E、G、D、H、C组,但6组组间比较差异无统计学意义（P〉0．05）;损伤后4周BBB评分,F组与其余5组（C,D,E,G,H组）比较差异有统计学意义（P〈0．05）,但其余5组组间差异无统计学意义（P〉O．05）。EUSA检测结果显示,F组BDNF和NGF含量均高于其他7组（P〈0．05）。大鼠脊髓标本切片HE染色,假手术组脊髓组织结构完整清楚,无中性粒细胞浸润;其余7组局部组织水肿明显,灰白质交界处模糊,周围可见不同程度胶质细胞增生及炎细胞浸润。结论：大鼠脊髓损伤后同种异体BMSCs移植对脊髓功能恢复有一定疗效,损伤后3d可能是BMSCs最佳移植时间。     

音猬因子体外诱导人骨髓基质干细胞转化为神经元样细胞的研究

目的：研究体外使用音猬因子（sonic hedgehog，SHH）诱导人骨髓基质干细胞（BMSCs）分化为神经元样细胞（神经干细胞、神经细胞、神经胶质细胞）的可行性。方法：从健康志愿者髂骨抽取骨髓5ml．离心、分离BMSCs。接种于含10％胎牛血清（FBS）的DMEM／F12培养液中，BMSCs体外扩增、纯化到第五代后分别种于含有不同浓度诱导液的24孔板中：A组为空白对照；B组加SHH 700ng/ml，碱性成纤维生长因子8（fibroblast growth factor-8，FGF-8）140ng／ml；C组加SHH500ng/ml，FGF-8100ng／ml；D组加SHH250ng/ml，FGF-8 50ng／ml；E组加SHH125ng／ml，FGF-825ng／ml，诱导BMSCs分化。使用免疫组化及免疫荧光鉴定微管相关蛋白（MAP-2）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、神经元烯醇化酶（NSE）的表达。结果：诱导7d后，部分BMSCs胞体收缩、突起伸出，表现出神经元样细胞的形态。除A组外其余各组免疫组化及免疫荧光染色NSE、MAP-2均为阳性，各组免疫组化及免疫荧光染色均有GFAP阳性细胞存在，且以B组、C组的MAP-2、GFAP、NSE染色阳性细胞数最多。结论：人BMSCs具有较强的自我更新和多向分化潜能，一定浓度的SHH可以在体外有效诱导人BMSCs转化为神经元样细胞。     

双向诱导的骨髓基质干细胞体外成骨与成血管的实验研究

目的 探讨双向诱导的骨髓基质干细胞(BMSCs)形成内皮细胞、成骨细胞与BMSCs共存体系的体外成骨与成血管的能力.方法 采用密度梯度离心法分离培养兔BMSCs.贴壁细胞分为四组:A组(单纯的BMSCs组)、B组(成骨诱导的BMSCs组)、C绀(内皮诱导的BMSCs组)和D组(双向诱导的BMSCs组).通过倒置相差显微镜观察细胞形态学变化,并采用流式细胞仪检测诱导前后的细胞表面抗原,采用茜素红染色观察钙结节,基质胶成血管法观察四组细胞体外成血管的能力.结果 ①经流式细胞学检测,分离培养的BMSCs主要表达CD90、CD105和CD44;BMSCs向内皮细胞诱导1周后,细胞表面抗原CD34和CD133的表达升高,而CD90和CD105的表达减少,相比诱导前差异有统计学意义(P<0.05);BMSCs继续向成骨细胞诱导1周后,细胞表面抗原CD44和HLA-DR升高,相比诱导前差异有统计学意义(P<0.05).②茜素红染色结果显示D组的钙结节大于B组,而A组和C组未见钙结节形成.③体外血管新生试验中,C组的管道数目与面积大于D组,差异有统计学意义(P<0.05),而A组与B组未见管道形成.结论 BMSCs双向诱导形成内皮细胞、成骨细胞与BMSCs共存体系,在体外共培养过程中不仅可以形成钙结节,而且可以形成微血管,有利于骨组织和血管联合构建,是一种良好的构建组织工程骨的种子细胞.     

BMSCs来源成骨细胞和内皮细胞复合壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架构建血管化组织工程骨研究

目的探讨大鼠BMSCs来源的成骨细胞和内皮细胞复合壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架植入大鼠桡骨缺损处的成骨作用和成血管作用。方法取分离培养至第3代的SD大鼠BMSCs行成骨和成内皮细胞诱导并鉴定。分别将内皮细胞(A组)、成骨细胞(B组)、混合细胞(成骨细胞和内皮细胞比例为1∶1,C组)均匀滴加于壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架上制备3组细胞-支架复合物,MTT检测支架内细胞增殖活性。取2月龄雄性SD大鼠30只,制作大鼠桡骨5 mm长缺损模型并分别植入3组细胞-支架复合物(n=10)。术后4、8、12周分别取移植物行HE染色观察,CD34免疫组织化学染色计数微血管密度,RT-PCR法检测骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨保护素(osteoprotegrin,OPG)mRNA表达。结果 BMSCs成骨诱导7 d后ALP染色可见细胞质内蓝染颗粒,细胞核呈红染;内皮细胞诱导14 d后,CD34免疫细胞化学染色可见细胞内棕色颗粒。MTT检测示3组细胞活性随时间延长逐渐升高。HE染色示,术后12周A组未见明显类骨质形成,而有较密集的微血管结构及较多纤维组织形成;B、C组可见均质的类骨质,呈条索状和岛状分布,可见大量成骨样细胞存在。术后各时间点A、C组微血管密度均显著高于B组(P<0.05);A组术后12周微血管密度高于C组(P<0.05),其余2个时间点A、C组间差异无统计学意义(P>0.05)。A组3个时间点OPN和OPG mRNA表达水平均较低,与B、C组比较差异有统计学意义(P<0.05);B、C组分别于术后8、12周OPN mRNA表达达峰值,4周时OPG mRNA表达达峰值。结论 BMSCs来源的成骨细胞和内皮细胞按1∶1比例共培养于壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架作为组织工程骨移植物,可以促进大鼠桡骨缺损部位骨的形成和血管化,促进骨缺损愈合。     

含锶羟基磷灰石浸提液诱导骨髓基质干细胞成骨分化的研究

目的 探讨含锶羟基磷灰石(Sr-HA)对骨髓基质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响.方法 从2只SD雄性大鼠双侧股骨、胫骨提取BMSCs.用含锶量分别为摩尔百分比为10%Sr-HA(A组)、5%Sr-HA(B组)、1% Sr-HA(C组)及不含锶的HA(D组)生物陶瓷粉末制备浸提液培养大鼠BMSCs.在培养的1、3、5、7、10 d检测各组BMSCs的增殖情况,于诱导培养后6、9、12及15 d检测各组BMSCs的碱性磷酸酶(ALP)活性,于诱导培养后3、6、9及12 d检测各组BMSCs的核心结合因子α1(Cbfα1)基因表达.结果 A、B、C、D组细胞培养1、3、5、7、10 d四甲基偶氮唑盐(MTT)检测结果显示:各组间吸光度值差异均无统计学意义(P＞0.05),但同一组内不同时间点的吸光度值差异均有统计学意义(P＜0.05).细胞培养6 d时A、B、C、D组的ALP活性OD值分别为(0.061±0.005)、(0.058±0.003)、(0.056±0.005)、(0.055±0.005),从6 d起A组和B组ALP活性均显著高于C、D组,差异有统计学意义(P＜0.05).细胞培养9和12 d时各组Cbfα1 mRNA相对表达量两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 HA中含锶量对BMSCs增殖无明显影响,但能促进BMSCs的成骨分化.     

异体骨髓间充质干细胞移植提高皮肤扩张效率

目的探讨异体骨髓间充质干细胞（bone marrow—derived mesenchymal stem cells,BM—MSCs）在皮肤扩张中发挥的作用,为临床更好地使用皮肤扩张术提供新的方法。方法体外分离、培养乳猪BM—MSCs。小型猪随机分为A、B、c、D4组,前3组脊柱两侧各埋置3个扩张器,A组扩张局部注射BM—MSCs、B组耳静脉注射BM—MSCs、C组仅埋置扩张器、D组为对照组。定期注水,测量各组扩张第7、14、28天标记面积,免疫荧光检测BM—MSCs的分化作用。结果流式鉴定BM—MSCs示CD90、CD29阳性表达,CD34、CD45阴性表达。扩张第28天,A组面积较c组增加明显（P〈0．01）,B组与C组之间比较差异具有统计学意义（P〈0．05）。免疫荧光示CD31、PCNA阳性表达率A、B组大于C、D组。结论异体移植的BM—MSCs能有效促进扩张皮肤新生,以局部移植的效果明显。     

促红细胞生成素动员骨髓间充质干细胞治疗脊髓损伤

目的 观察促红细胞生成素(EPO)动员骨髓间充质干细胞(BMSCs)对脊髓损伤局部起的修复作用,并探讨其机制.方法 将30只SD大鼠随机分成假手术组、生理盐水组及EPO治疗组,各组均经尾静脉注射Hoechst33342标记的BMSCs,移植后1、3、7、14、21、28 d采用BBB法进行大鼠后肢运动功能评分观察大鼠神经功能恢复情况,应用免疫荧光检测比较各组BMSCs动员到脊髓损伤处的数目,Western blot检测损伤局部BMSCs表达脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)的水平.结果　从第3天起,EPO治疗组BBB评分分别为(5.29±0.69)、(8.18±0.38)、(13.32±0.77)、(15.25±1.83)、(18.71±1.54),明显高于生理盐水组,移植的BMSCs计数分别为(90.12±7.68)、(116.26±13.54)、(186.32±20.35)、(211.64±31.83)、(298.71±21.54),数目明显增加(P＜0.05),其BDNF和NGF的表达也明显增强(P＜0.05).结论 EPO能够动员BMSCs向脊髓损伤部位迁移并通过促进BMSCs表达BDNF和NGF来促进神经功能的恢复.

Abstract：

Objective To obsevre the effect of erythropoietin (EPO) treatment on the mobility of bone marrow mesenchymal stem cell (BMSCs) to the sites of injured spinal cord and explore the molecular mechanism. Methods Thirty SD rats were randomly divided into sham-operation group, saline group and EPO treatment group. BMSCs labeled with Hoechst33342 were transplanted by tail vein. Functional outcome measurements were evaluated by the Basso, Beattie and Bresnahan (BBB) score at 1st, 3rd, 7th,14th, 21st and 28th day. The immigrating number of BMSCs was measured by immunofluorescent staining.The expression of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and nerve growth factor (NGF) in BMSCs was detected by Western blotting. Results From the 3rd day on, the BBB scores in EPO treatment group were (5.29±0.69), (8.18±0.38), (13.32±0.77), (15.25 ±1.83), (18.71 ±1.54) respectively, which were obviously higher than in saline group. The number of BMSCs was (90. 12 ±7. 68), (116. 26 ± 13. 54),( 186. 32 ± 20. 35 ), (211.64 ± 31.83 ) and (298.71 ± 21.54) respectively, which was significantly increased in EPO treatment group (P ＜ 0. 05 ). The protein levels of BDNF and NGF expressed by BMSCs were increased significantly (P ＜ 0. 05) in EPO treatment group as compared with sham-operation group.Conclusion EPO treatment after spinal cord injury may help BMSCs migrate to the injury site and accelerate recovery of neural function by up-regulating the expression of BDNF and NGF.     

BMP-2联合低氧环境诱导BMSCs向软骨表型分化的研究

目的探讨BMP-2联合低氧环境诱导BMSCs向软骨表型分化的可行性,并进一步研究其生物学机制。方法取4周龄健康清洁级雌性SD大鼠骨髓采用贴壁法体外培养BMSCs,取第2代细胞根据培养条件不同分为4组:常氧对照组(A组)、常氧加BMP-2诱导液组(B组)、低氧(O2浓度3%)对照组(C组)和低氧加BMP-2诱导液组(D组)。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,培养7、14、21 d阿利新蓝染色检测各组软骨基质糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAG)分泌水平,21 d时Western blot检测细胞内Ⅱ型胶原和低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)蛋白表达水平,RT-PCR检测成软骨、成骨以及低氧相关基因表达水平。结果诱导培养21 d,D组细胞变为类圆形,细胞密度降低,细胞周边呈陷窝样,基质包裹细胞;A、B、C组均未见上述典型变化。D组阿利新蓝染色明显较其他组深,并随诱导时间延长蓝染加深,21 d时出现成片深染蓝色,其他组各时间点仅见散在少量的淡染蓝色。Western blot检测D组细胞内Ⅱ型胶原蛋白表达水平较其他组显著增高,C、D组HIF-1α蛋白表达水平较A、B组显著增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR检测D组成软骨分化相关指标Ⅱ型胶原α1(collagenⅡα1,COL2α1)、聚集蛋白聚糖表达最高,而B组成骨分化相关指标COL1α1、ALP、Runt相关转录因子2表达水平最高,C、D组低氧相关指标HIF-1α较A、B组显著增强,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 BMP-2联合低氧(O2浓度3%)环境可以诱导大鼠BMSCs向软骨分化,并抑制其成骨分化,HIF-1α可能是参与促软骨生成过程中的一个重要信号分子。     

脊索细胞培养基促进BMSCs增殖分化的研究

目的为研究椎间盘组织工程种子细胞,观察脊索细胞培养基对BMSCs增殖分化的影响。方法取4周龄日本大耳白兔胸腰段椎间盘分离培养脊索细胞,取双侧股骨分离培养BMSCs,用含15%FBS的DMEM/F12培养基培养脊索细胞,5 d后制备脊索细胞培养基。实验分为两组,实验组BMSCs中加入脊索细胞培养基培养,对照组BMSCs中加入含15%FBS的DMEM/F12培养基培养。使用细胞活力细胞毒性检测检测细胞增殖情况,采用免疫荧光及实时荧光定量PCR检测BMSCs蛋白多糖及Ⅱ型胶原表达情况。结果成功分离脊索细胞及BMSCs。细胞增殖检测示,培养5、7、9、14 d,实验组细胞数量明显多于对照组(P<0.05)。免疫荧光检测示对照组培养7、14 d细胞内均无或者有较少Ⅱ型胶原及蛋白多糖表达,实验组二者均有较多表达,且培养14 d时表达明显多于7 d。实时荧光定量PCR检测示,培养7、14 d实验组蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA表达均显著高于对照组(P<0.05);实验组14 d蛋白多糖和Ⅱ型胶原mRNA表达显著高于7 d(P<0.05)。结论脊索细胞培养基可促进BMSCs增殖,并诱导BMSCs向类软骨细胞分化,为脊索细胞和BMSCs作为种子细胞治疗椎间盘退变提供了依据。