壳聚糖/羟基磷灰石支架修复骨软骨缺损的实验研究

[目的] 探讨双层壳聚糖(chitosan CS)/羟基磷灰石复合支架(hydroxyapatite HA)修复兔骨软骨缺损的可行性.[方法] 采用冻干法和烧结法制作双层壳聚糖(CS)/羟基磷灰石(HA)复合支架,以骨髓间充质干细胞为种子细胞,运用纤维蛋白胶种植技术,以双层壳聚糖(CS)/羟基磷灰石(HA)复合支架为载体,修复骨软骨缺损,实验分3组,A组:BMSc 支架,B组:单纯支架,C组:未处理.将修复材料植入骨软骨缺损模型,分别于6、12周取材,进行大体观察,组织学检测,改良Wakitani法评分,经统计学处理,比较各组修复效果差异(P＜0.05).[结果] (1)CS/HA支架CS层孔隙率为76%± 5.01%,孔径为200～400 μm,平均为300 μm左右,孔相通性好,HA层孔隙率为72%± 4.23%,孔径为200～500 μm,平均为350 μm左右,孔相通性好,结合部结合好;(2)P2骨髓间充质干细胞较纯,扫描电镜观察MSCs附着在复合支架上.大体观察和组织学检测显示, A组基本修复软骨缺损,骨缺损有骨小梁长入.B、C组骨软骨缺损修复不良,组织学检测以纤维性组织或无新生组织形成,软骨及骨缺损均明显存在,改良Wakitani评分显示A组在6周、12周2个时间点的各项评分结果,均优于B、C组,且差异有统计学意义(P＜0.05).[结论] 双层壳聚糖(CS)/羟基磷灰石(HA)复合支架可作为骨软骨组织工程支架,结合BMSc可修复软骨与骨的缺损,重建关节的解剖结构和功能.     

双层壳聚糖与HAP复合支架的初步研究

目的 探讨双层壳聚糖(chitosan,CS)/HAP复合支架作为骨软骨组织工程支架的可行性,并结合兔自体BMSCs修复骨软骨缺损. 方法采用冻干法和烧结法制作双层CS/HAP复合支架,检测其理化特性.取日本大耳白兔骨髓4～6mL,全骨髓培养法分离纯化BMSCs,并鉴定.调整第2代BMSCs细胞密度为2×107个/mL,应用纤维蛋白胶种植技术,接种至双层CS/HAP复合支架,体外构建细胞一支架复合物.取36只日本大耳白兔,于右侧膝关节股骨下端外侧髁负重区,作一直径4mm、深3 mm的圆柱形缺损,制备兔膝关节骨软骨缺损模型.根据缺损区植入物的不同,分为A、B、C 3组(n=12).A组:植入细胞-支架复合物;B组:植入双层CS/HAP复合支架;C组:不植入任何材料,作为窄白对照组.术后6、12周取材,行大体及组织学观察,采用改良Wakitani法评分. 结果 双层CS/HAP支架CS层孔隙率为76.00%±5.01%,孔径为200～400 μm,平均300 μm,孔洞相通;HAP层孔隙率为72.00%±4.23%,孔径为200～500 μm,半均350μm,孔洞相通,结合部结合好.全骨髓法培养BMSCs,第7天可见集落形成,14 d传代;免疫组织化学检测示CD44( )和CD45(-).大体观察和组织学检测显示,A组基本修复软骨缺损,骨缺损修复不良,有骨小梁长入;B、C组骨、软骨缺损修复不良,组织学检测以纤维组织或无新生组织形成,软骨及骨缺损均明显存在.术后6、12周,A组改良Wakitani评分分别为(5.17± 1.17)分和(3.20±0.75)分,均优于B、C组,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 双层CS/HAP复合支架可作为骨软骨组织工程支架,复合BMSCs可修复兔关节软骨与骨缺损,重建关节解剖结构.     

自体骨髓间充质干细胞复合壳聚糖/羟基磷灰石支架修复兔膝骨软骨缺损

目的 探讨骨髓间充质干细胞(bone mesenehymal stem cells,BMSCs)复合壳聚糖(chitosan,CS)/羟基磷灰石(hydmxyapatite,HA)支架修复兔膝关节局部骨软骨缺损.方法 选健康日本大耳白兔36只,2～3月龄,体重1.7～2.0 kg,每只抽取自体骨髓4～6ml,体外分离培养BMSCs后以2×107/ml密度植于CS/HA支架上体外培养10 h,制成BMSCs-CS/HA支架复合物.将36只实验动物手术制成右膝股骨外侧髁负重区骨缺损模型后,随机分成A、B、C 3组,每组12只.A组植入BMSCs-CS/HA复合物,B组植入单纯CS/HA支架;C组不作任何植入,为空白对照组.分别于术后6周、12周各处死6只动物,取材后进行大体、组织学观察6根据改良Wakitani评分标准进行评分,评估软骨组织的修复情况,并行成组设计方差分析.结果 A组术后6周即可重建关节软骨缺损;修复软骨在观察期内逐渐变厚,软骨下骨有少量骨修复;术后12周透明软骨样修复,表面光整,与周围软骨色泽相近,软骨下骨有部分修复.而B组和C组12周时缺损区仍为纤维软骨样纤维组织修复,色泽浅黄.术后6、12周各组组织学半定量评分显示:股骨髁负重区修复A组评分明显优于B、C组(F=27.26,P＜0.05).结论 自体BMSCs复合CS/HA支架在体内环境下可形成透明软骨修复兔膝关节负重区骨软骨缺损.     

载淫羊藿苷/凹凸棒石/Ⅰ型胶原/聚己内酯复合支架修复兔胫骨缺损的实验研究

目的探讨载淫羊藿苷/凹凸棒石/Ⅰ型胶原/聚己内酯(icariin/attapulgite/collagen typeⅠ/polycaprolactone,ICA/ATP/ColⅠ/PCL)复合支架修复兔胫骨缺损的效果。方法利用溶液铸浇-粒子滤沥法分别构建ICA/20%ATP/ColⅠ/PCL(支架1)、ICA/30%ATP/ColⅠ/PCL(支架2)、20%ATP/ColⅠ/PCL(支架3)、30%ATP/ColⅠ/PCL(支架4)复合支架材料,采用扫描电镜观察支架2交联前、后结构特征,测量支架2、4的表面接触角检测材料吸水性能,采用体外降解实验评价支架2的药物缓释效果。取30只雄性日本大耳白兔,体质量(2.0±0.1)kg,随机分为A、B、C、D、E 5组,每组6只;制备直径1 cm双侧胫骨缺损模型后,A组不植入任何材料,B～E组分别于骨缺损处植入支架3、支架4、支架1、支架2。术后4、8、12周大体观察骨缺损修复效果;行HE、Masson染色以及成骨特异性转录因子RUNX2、成骨相关转录因子Osterix(OSX)、ColⅠ、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)抗体的免疫组织化学染色,观察不同支架材料修复骨缺损效果。结果扫描电镜观察示,支架2为多孔结构,交联前结构疏松,交联后结构致密;表面接触角检测示支架为疏水性材料,且支架2疏水性比支架4更高;药物体外缓释效果显示支架2上药物能微量长效释放。动物体内植入实验中,大体观察示术后4、12周D、E组缺损明显小于A、B、C组。HE和Masson染色示,术后4周A组缺损区域充满大量结缔组织,B、C组可见大量纤维组织,D、E组可见少量新生骨;术后8周各组新生骨比4周时增加;术后12周A组缺损区域仍以纤维组织为主,B、C组可见少量新生骨组织,D、E组可见大量新生骨组织,尤以E组明显,且大部分支架降解。免疫组织化学染色示,术后4周,D、E组新生组织中RUNX2和OSX表达明显高于其余各组,术后8、12周RUNX2表达与4周相比表达下降;术后8、12周与4周相比,各组ColⅠ、OPN表达均增加,且D、E组新生组织中ColⅠ、OPN表达明显高于其余各组。结论 ICA/ATP/ColⅠ/PCL复合支架具有良好的孔隙率和生物相容性,并具有促成骨作用,可达到良好骨再生和修复效果。     

骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球复合组织工程支架修复兔股骨髁部骨缺损的实验研究

目的 探讨重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)壳聚糖缓释微球复合聚乳酸-聚羟乙酸/磷酸三钙(PLGA/TCP)支架修复骨缺损的可行性和有效性.方法 取健康成年新西兰大白兔45只,在40只实验动物股骨髁部制备0.6 cm×1.0 cm骨缺损.实验分4组:A组:缺损组,B组:用PLGA/TCP空白支架修复骨缺损,C组:用等量rhBMP-2复合PLGA/TCP支架修复骨缺损,D组:用rhBMP-2壳聚糖微球复合PLGA/TCP支架修复骨缺损,每组10只动物.另5只动物为正常对照组(E组).应用X线、Micro-CT和组织病理学等方法检测术后4、12 周各实验组骨缺损修复效果.结果 术后4周X线片示:A组无新骨形成.B组有少量新生骨影像形成,C、D组骨缺损部位均有新骨影像形成.术后12周,Micro-CT结果显示:D组骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数目等指标均优于B组和C组,差异均有统计学意义(P<0.05),A组末检测到上述指标.术后4剧,D组可见大量骨组织形成,有部分成熟的骨小梁,PLGA/TCP支架大部分被降解.吸收.术后12周,D组支架和微球完全降解.骨缺损被成熟骨取代;B、C、D组骨长入率分别为5.78%±1.21%、37.26%±6.45%、74.25%±8.91%,3组之间比较差异均有统计学意义(P<0.05).结论 复合rhBMP-2壳聚糖微球的PLGA/TCP支架具有良好的骨缺损修复效果,临床应用前景较好.     

新型纳米羟基磷灰石/聚氨酯复合材料治疗慢性骨髓炎的实验研究北大核心CSCD

目的评价新型纳米羟基磷灰石(nano hydroxyapatite,n-HA)/聚氨酯(polyurethane,PU)复合材料在治疗胫骨慢性骨髓炎中骨修复的效果。方法合成一种新型载左氧氟沙星介孔二氧化硅纳米微球(levofloxacin@mesoporous silica microspheres,Lev@MSNs)/n-HA/PU复合材料,扫描电镜观察材料表面结构。取50只成年雌性新西兰兔,采用Norden的方法用3×10~7 CFU/m L浓度的金黄色葡萄球菌菌液制备右侧胫骨慢性骨髓炎模型,将造模成功的45只动物随机分为4组,于右胫骨皮质开窗,空白对照组(A组,n=9)仅行彻底清创术;B、C、D组(n=12)彻底清创后分别植入材料5 mg Lev@PMMA、1 mg Lev@MSNs/n-HA/PU、5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU。术后12周行胫骨X线片观察,然后处死动物后行胫骨大体形态观察、亚甲基蓝/酸性品红染色组织学观察、植入物-骨界面扫描电镜观察(B、C、D组)及生物力学试验(检测最大压缩力)。结果 X线片观察示,A组炎症感染较术前加重,而D组较术前炎症感染控制显著,骨愈合良好。大体观察示,A组见胫骨广泛骨质破坏,B、C组见材料-骨间隙明显,而D组见骨组织与材料紧密结合,骨修复良好。组织学观察示,B、C组材料周围无明显新生骨,而D组材料外周有大量新生骨包绕,孔隙内有新生骨长入,骨重建活跃。植入物-骨界面扫描电镜观察示,B、C组植入物-骨界面无新生骨,而D组植入物与宿主骨间形成骨性连接,界限模糊。生物力学检测示,B、D组最大压缩力显著高于A、C组(P<0.05),B、D组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论新型Lev@MSNs/n-HA/PU复合材料具有抗感染、促进成骨及良好的生物力学性能,应用于治疗兔慢性骨髓炎效果良好。     

微载体/水凝胶复合支架修复大鼠膝关节骨软骨缺损

[目的]探索以负载软骨细胞的Cytodex-3微载体和藻酸钠水凝胶为材料,制备微载体/水凝胶复合支架,并观察以此修复大鼠膝关节骨软骨缺损的效果。[方法]将大鼠软骨细胞与Cytodex-3微载体置于旋转式三维生物反应器(rotary cell culture systems,RCCS)中,软骨细胞在微载体表面快速大量扩增后,将负载有软骨细胞的微载体均匀的与藻酸钠水凝胶混合,制备微载体/水凝胶复合支架,并以此修复大鼠股骨滑车骨软骨缺损。实验分3组,A组:负载有软骨细胞的Cytodex-3微载体/藻酸钠水凝胶复合支架修复组;B组:单纯Cytodex-3微载体/藻酸钠水凝胶复合支架修复组;C组:空白对照组。术后6、12周取材,据大体、组织学、Micro-CT等检测结果对骨软骨修复效果进行评估。[结果]大体观显示A组的软骨修复效果明显优于B组和C组。组织学分析示A组的修复组织主要以透明软骨为主,而B组和C组主要以纤维组织为主。Micro-CT扫描结果表明各种软骨下骨均得到不同程度的重建,A组效果优于其他两组,比较差异有统计学意义。[结论]负载软骨细胞的微载体/藻酸钠水凝胶复合支架能够高效的修复大鼠股骨滑车骨软骨缺损,这种将微载体与水凝胶结合构建复合支架的方法,为组织工程软骨的制备提供了新的途径。     

hBMP2/hVEGF165双基因腺病毒修饰BMSCs复合n-HA/PA66修复骨缺损影像学观察

[目的]探讨携带h BMP2/h VEGF165双基因重组腺病毒共修饰BMSCs复合多孔n-HA/PA66修复兔桡骨大段骨缺损在不同时相点影像学动态变化和临床影像评估的可靠性。[方法]选取40只成年新西兰大白兔,雄性,体重2.8~3.1 kg,采用完全随机法分为2大组,每组20只,手术制作15 mm双侧桡骨中段骨缺损模型。A1组:左侧骨缺损处不植入任何材料为空白对照组;A2组:右侧骨缺损处植入h BMP2/BMSCs/n-HA/PA 66人工骨材料;B1组:左侧骨缺损处植入BMSCs/n-HA/PA66人工骨材料;B2组:右侧骨缺损处植入h BMP2/h VEGF165/BMSCs/n-HA/PA 66人工骨材料。分别于术后2、4、8、12周进行X线、CT三维重建观察和甲苯胺蓝组织染色观察。[结果]B2组各个时期Lane-Sandhu法X线射线评分均高于其他各组,差异有统计学意义(P0.05),A2组优于B1组(P0.05),A1组最差(P0.05);且CT三维重建骨形成量和组织染色效果均优于同期其他各组。[结论]h BMP2/h VEGF165双基因重组腺病毒共修饰BMSCs复合多孔n-HA/PA66人工骨材料治疗兔大段骨缺损,影像学观察,直观、形象地显示了其持久、稳定、高效的骨修复作用,为基因治疗复合人工骨材料修复骨缺损提供了良好的实验依据。     

新型纳米羟基磷灰石/聚氨酯复合材料治疗慢性骨髓炎的实验研究

目的评价新型纳米羟基磷灰石(nano hydroxyapatite,n-HA)/聚氨酯(polyurethane,PU)复合材料在治疗胫骨慢性骨髓炎中骨修复的效果。方法合成一种新型载左氧氟沙星介孔二氧化硅纳米微球(levofloxacin@mesoporous silica microspheres,Lev@MSNs)/n-HA/PU复合材料,扫描电镜观察材料表面结构。取50只成年雌性新西兰兔,采用Norden的方法用3×10~7 CFU/m L浓度的金黄色葡萄球菌菌液制备右侧胫骨慢性骨髓炎模型,将造模成功的45只动物随机分为4组,于右胫骨皮质开窗,空白对照组(A组,n=9)仅行彻底清创术;B、C、D组(n=12)彻底清创后分别植入材料5 mg Lev@PMMA、1 mg Lev@MSNs/n-HA/PU、5 mg Lev@MSNs/n-HA/PU。术后12周行胫骨X线片观察,然后处死动物后行胫骨大体形态观察、亚甲基蓝/酸性品红染色组织学观察、植入物-骨界面扫描电镜观察(B、C、D组)及生物力学试验(检测最大压缩力)。结果 X线片观察示,A组炎症感染较术前加重,而D组较术前炎症感染控制显著,骨愈合良好。大体观察示,A组见胫骨广泛骨质破坏,B、C组见材料-骨间隙明显,而D组见骨组织与材料紧密结合,骨修复良好。组织学观察示,B、C组材料周围无明显新生骨,而D组材料外周有大量新生骨包绕,孔隙内有新生骨长入,骨重建活跃。植入物-骨界面扫描电镜观察示,B、C组植入物-骨界面无新生骨,而D组植入物与宿主骨间形成骨性连接,界限模糊。生物力学检测示,B、D组最大压缩力显著高于A、C组(P0.05),B、D组间差异无统计学意义(P0.05)。结论新型Lev@MSNs/n-HA/PU复合材料具有抗感染、促进成骨及良好的生物力学性能,应用于治疗兔慢性骨髓炎效果良好。     

载柚皮苷复合支架对兔骨软骨缺损修复的实验研究

目的探讨载柚皮苷复合支架的性能及其对兔骨软骨缺损修复的效果。方法利用W/O/W方法制备载柚皮苷和无载柚皮苷缓释微球;以凹凸棒石和Ⅰ型胶原蛋白为材料,通过"3层夹心法"分别构建载柚皮苷、无载柚皮苷和载TGF-β_1复合支架。分别利用体外缓释、扫描电镜和细胞计数试剂盒8法评价载柚皮苷微球的缓释效果、支架的形貌和细胞相容性。取40只日本大耳白兔随机分为A、B、C、D4组,每组10只。于兔双侧股骨髁间窝处制备直径4.5 mm、深4 mm的骨软骨缺损模型,A组为缺损组(空白对照),B、C、D组分别于骨软骨缺损处植入无载柚皮苷复合支架(阴性对照组)、载柚皮苷复合支架(实验组)及载TGF-β_1复合支架(阳性对照组)。分别于术后3、6个月时取材,行大体、HE染色、甲苯胺蓝染色,分别观察骨软骨缺损修复效果;Western blot检测新生软骨Ⅱ型胶原蛋白表达水平。结果载柚皮苷微球具有良好的缓释效果;构建的骨软骨复合支架有较好的孔隙;载柚皮苷软骨层支架细胞的增殖率与无载柚皮苷支架比较明显增加,差异有统计学意义(P0.05)。兔体内植入实验大体观察示,术后3个月C、D组缺损范围与A、B组相比明显缩小;术后6个月C组缺损处被新生软骨所覆盖,D组新生软骨与周围正常软骨整合良好。组织学染色示,术后3个月A、B组缺损处被少量纤维组织填充,C、D组可见少量软骨生成;术后6个月C、D组新生骨软骨组织与正常骨软骨类似,A、B组缺损处以大量纤维组织为主。Western blot检测示,术后3、6个月C、D组缺损处新生组织中Ⅱ型胶原蛋白表达量均显著高于A、B组,差异有统计学意义(P0.05);C、D组间比较差异无统计学意义(P0.05)。结论载柚皮苷复合支架具有良好的组织相容性,并对兔关节骨软骨缺损有较好的修复效果。     

注射型硼酸盐壳聚糖复合物作为药物载体治疗骨髓炎的实验研究

目的评价载万古霉素的注射型硼酸盐壳聚糖复合物(vancomycin-loaded borate glass/chitosancomposite,VBC)的体内、外生物活性及治疗骨髓炎效果,探讨其生物降解及抗生素缓释规律,为临床应用奠定基础。方法 VBC固相由硼酸盐玻璃及万古霉素粉剂组成,液相由壳聚糖、柠檬酸和葡萄糖按照质量比1∶10∶20比例混匀制成,固相及液相按质量比2∶1比例混合凝固获得VBC。硫酸钙粉剂代替硼酸盐玻璃,无菌生理盐水代替壳聚糖溶液,同法制备载药硫酸钙(vancomycin-loaded calcium sulfate,VCS),作为对照。采用高效液相色谱法检测VBC及VCS抗生素释放率,抗生素双重管稀释法测定释放抗生素的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC);扫描电镜观察浸泡前及D-Hank’s溶液中浸泡2、4、8、16、40 d的VBC、VCS降解情况,X射线衍射仪分析VBC浸泡后40 d物相组成。取33只成年健康新西兰大白兔,雌雄不限,体重2.25～3.10 kg;采用Norden方法制备右胫骨近端骨髓炎模型。4周后将28只骨髓炎模型制备成功的大白兔随机分成4组:A组(n=8)单纯清创,B、C组(n=8)清创后注入VCS及VBC至缺损处,D组(n=4)不作任何处理。术后2个月摄X线片并行Norden评分,取缺损处标本行组织学观察。结果 VBC释药过程持续30 d,药物缓释前8 d释放率达75%,最终释放率达90%以上;VCS释药过程仅持续16 d。VBC、VCS的MIC均为2μg/mL。扫描电镜观察,VCS浸泡前为光滑玻璃晶体表面,4 d后已大部分降解;VBC浸泡前具有典型光滑玻璃表面,8 d后结合相的玻璃部分溶化,40 d后材料表面几乎完全被生成的白色颗粒状沉淀物覆盖,材料结合疏松。VBC浸泡40 dX线衍射分析反应生成物主要物相为羟基磷灰石。术后2个月X线片及组织学观察示C组骨髓炎症状均消失,优于其余各组。A、B、C、D组X线片评分分别为(3.50±0.63)、(2.29±0.39)、(2.00±0.41)、(4.25±0.64)分,Smeltzer评分分别为(6.00±0.89)、(4.00±0.82)、(3.57±0.98)、(7.25±0.50)分。其中D组评分显著高于A、B、C组,A组显著高于B、C组,比较差异均有统计学意义(P0.05);B组评分高于C组,但差异无统计学意义(P0.05)。结论 VBC具有药物缓释性及成骨性能,有望成为治疗骨髓炎的理想材料。     

万古霉素阳离子脂质体复合纳米羟基磷灰石/壳聚糖/魔芋葡苷聚糖支架对金黄色葡萄球菌生物膜体外抑制作用

目的：研究万古霉素阳离子脂质体（ CLVs）复合纳米羟基磷灰石/壳聚糖/魔芋葡苷聚糖支架对金黄色葡萄球菌生物膜的抑制作用。方法采用微量肉汤稀释法测定药物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度,采用再生实验方法研究支架释放的CLVs对金黄色葡萄球菌生物膜的敏感性。结果万古霉素和CLVs对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别为1．0 mg/L和0．6 mg/L;相同浓度的万古霉素脂质体复合支架对细菌生物膜的作用在低浓度和短时间的接触较游离万古霉素支架更有效。结论 CLVs复合纳米羟基磷灰石/壳聚糖/魔芋葡苷聚糖支架可以作为新的载药系统,在临床治疗生物膜感染方面可起到重要作用。     

Ⅰ型胶原凝胶包埋脂肪干细胞复合PLGA-β-TCP支架修复兔自体桡骨缺损

目的 采用Ⅰ型胶原凝胶悬浮包埋兔脂肪干细胞并复合PLGA-β-TCP支架修复自体桡骨缺损。方法 使用Ⅰ型胶原凝胶悬浮兔脂肪干细胞并与PLGA-β-TCP复合构建脂肪干细胞-Ⅰ型胶原凝胶/PLGA-β-TCP复合体(ASCs-COL/PLGA-β-TCP)(A组),同时设立单纯细胞/PLGA-β-TCP材料复合体(ASCs/PLGA-β-TCP)(B组)、单纯Ⅰ型胶原凝胶/PLGA-β-TCP复合体(COL/PLGA-β-TCP)(C组)、单纯PLGA-β-TCP支架材料(D组)以及空白缺损(E组)作为对照,体外成骨诱导培养2周后植入桡骨1.5cm缺损部位。30只兔(60侧)采用两因素随机区组设计每只兔两侧骨缺损植入组别。分别于术后8、16、24周处死兔,取材,进行相关分析。结果 术后8周,大体观察、放射学、组织学检测示A组桡骨断端连续性基本恢复。术后16周,A组骨断端连续性完全恢复,髓腔未通。术后24周,A组髓腔再通,改建塑形趋于完成,材料基本降解。自术后16～24周,A组残存材料比例低于其他3组(P＜0.05,n=4);与A组比较,在整个观察周期内,B、C、D组均无明显成骨现象,E组保持骨缺损状态(P ＜0.05,n=4)。结论 通过应用Ⅰ型胶原凝胶悬浮包埋脂肪干细胞进而与PLGA-3-TCP多孔支架材料复合构建新型仿生骨组织工程复合体,可修复兔桡骨1.5 cm缺损。     

新型多孔PLGA/HA复合支架体外细胞相容性的实验研究

目的研究新型多孔聚乳酸乙醇酸/羟基磷灰石(PLGA/HA)支架材料的体外细胞相容性。方法采用贴壁法对兔骨髓基质细胞(BMSCs)进行体外矿化诱导培养,扩增后与实验A组(含5%HA的PLGA/HA),实验B组(含10%HA的PLGA/HA)及对照C组(仅含PLGA)分别进行体外复合培养;并通过定性及定量法检测BMSCs在材料表面的粘附能力、增殖活力,验证细胞材料复合体的成骨活性。比较分析各组之间的差异。结果兔BMSCs在每组材料的表面均能生长,经体外诱导后在支架材料的表面形成钙结节,A、B组细胞的粘附及增殖能力均强于C组(P<0.05),A、B组之间无差异。结论兔BMSCs与新型多孔PLGA/HA支架材料有良好的相容性。     

CS/PVA凝胶负载Ad-hTGF-β1转染的BMSCs移植修复兔关节软骨缺损

目的 探讨温敏型CS/PVA凝胶负载Ad-hTGF-β1转染的骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植修复兔关节软骨缺损的实验效果.方法 体外分离培养兔BMSCs,在Ad-hTGF-β1转染1周后,用细胞免疫化学方法检测hTGF-β1在细胞内的表达.用24只成年新西兰大白兔制造关节软骨缺损模型,双侧后肢均用于实验,动物模型随机分为4组,各组动物6只.A组:凝胶复合转染BMSCs修复组;B组:凝胶复合未转染BMSCs修复组;C组:凝胶修复组;D组:空白对照组.在术后16周时处死动物取材,通过大体标本和组织学染色观察评价各组修复效果,按照改良Pinoda法评分,对各组修复效果进行统计学分析.结果 免疫组化证实体外培养的BMSCs在Ad-hTGF-β1转染后表达hTGF-β1蛋白,阳性率为85.4%.术后16周取材见凝胶复合转染细胞组关节软骨缺损部位为软骨样组织填充,组织学观察见再生的软骨组织细胞排列及细胞密度与正常软骨相似,Ⅱ型胶原免疫组化阳性,Pineda评分同其它各组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 CS/PVA凝胶作为一种温敏型可注射支架材料,其负载hTGF-β1转染的BMSCs移植可用于兔关节软骨缺损修复.

Abstract：

Objective To investigate the experiment effects of rabbit joint articular cartilage defects repaired by thermosensitive CS/PVA composite hydrogel engineered hTGF-β1 transfected bone marrow mesenchymal stem cells. Methods Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and cultured in vitro. The positive rate of transfection was defected by cell immunohistochemistry methods after Ad-hTGF-β1 transfected for 1 week. Twenty-four adult New Zealand white rabbits with full articular cartilage defects were randomly divided into 4 groups, each group had 6 animals, both hind limbs were used in the experiment. Group A: hydrogel combined with transfected cells; Group B: hydrogel combined with untransfected cells; Group C: hydrogel group; Group D: blank control group. Specimens and histological observation were used to evaluate the repair effect after 16 weeks according to Pineda's score. Results The positive rate of hTGF-β1 expression in BMSCs was about 85.4% after transfection. After 16 weeks the defects of group A were repaired by cartilage-like tissue, the cell arrangement and densities of regenerated cartilage were similar to normal cartilage, type Ⅱ collagen immunohistochemistry were positive. There was a significant difference in Pineda's score compaired with other groups (P ＜ 0.05). Conclusion Rabbit articiular cartilage defects could be repaired by CS/PVA hydrogel engineered hTGF-β1-transfected bone marrow mesenchymal stem cells.     

核心结合因子α1基因修饰骨髓间充质干细胞对骨缺损的修复研究

目的 探讨以核心结合因子α1（core-binding factor a1，Cbfa1）基因修饰骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs）作为种子细胞，与猪脱细胞骨基质材料复合构建组织工程骨修复兔桡骨缺损的可行性。方法选择3月龄日本大白兔40只，建立桡骨1．2cm缺损模型，根据不同的修复方式分成4组。A组：Cbfa1基因修饰MSCs与脱细胞骨基质材料复合后修复；B组：未行基因修饰的MSCs与脱细胞骨基质材料复合后修复；C组：单纯脱细胞骨基质支架材料修复；D组：空白对照，不作任何植骨处理。术后4、8和12周分别行大体、X线片和组织学观察评价修复效果，并对修复后桡骨进行生物力学检测。结果大体观察至术后12周取材时，A组原骨缺损植骨区新生骨成熟度好、饱满、质硬；B组植骨区有骨性连接，质软；C组可在植骨区发现少量骨性连接；D组形成骨不连。X线片和组织学观察示：术后4、8周A组支架材料降解、新骨生成及髓腔再建优于其它3组。术后12周A组支架材料完全降解，新骨塑形完成，骨髓腔通畅，皮质骨改建成正常的板层骨结构；B组缺损区近端部分骨髓腔塑形再通；C组截骨两端骨痂向植骨中长入，髓腔塑形不明显；D组纤维组织充填，形成骨不连。以前述各组健侧桡骨为正常对照组（仍为D组），余分组同前，行破坏压缩载荷检测，结果示12周后A、B组与D组比较差异无统计学意义（P〉0．05），而C组与D组比较差异有统计学意义（P〈0．01）。结论Cbfa1基因修饰MSCs与脱细胞骨基质材料复合构筑的组织工程骨可较好地修复兔桡骨址螺     

BMSCs来源成骨细胞和内皮细胞复合壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架构建血管化组织工程骨研究

目的探讨大鼠BMSCs来源的成骨细胞和内皮细胞复合壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架植入大鼠桡骨缺损处的成骨作用和成血管作用。方法取分离培养至第3代的SD大鼠BMSCs行成骨和成内皮细胞诱导并鉴定。分别将内皮细胞(A组)、成骨细胞(B组)、混合细胞(成骨细胞和内皮细胞比例为1∶1,C组)均匀滴加于壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架上制备3组细胞-支架复合物,MTT检测支架内细胞增殖活性。取2月龄雄性SD大鼠30只,制作大鼠桡骨5 mm长缺损模型并分别植入3组细胞-支架复合物(n=10)。术后4、8、12周分别取移植物行HE染色观察,CD34免疫组织化学染色计数微血管密度,RT-PCR法检测骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨保护素(osteoprotegrin,OPG)mRNA表达。结果 BMSCs成骨诱导7 d后ALP染色可见细胞质内蓝染颗粒,细胞核呈红染;内皮细胞诱导14 d后,CD34免疫细胞化学染色可见细胞内棕色颗粒。MTT检测示3组细胞活性随时间延长逐渐升高。HE染色示,术后12周A组未见明显类骨质形成,而有较密集的微血管结构及较多纤维组织形成;B、C组可见均质的类骨质,呈条索状和岛状分布,可见大量成骨样细胞存在。术后各时间点A、C组微血管密度均显著高于B组(P<0.05);A组术后12周微血管密度高于C组(P<0.05),其余2个时间点A、C组间差异无统计学意义(P>0.05)。A组3个时间点OPN和OPG mRNA表达水平均较低,与B、C组比较差异有统计学意义(P<0.05);B、C组分别于术后8、12周OPN mRNA表达达峰值,4周时OPG mRNA表达达峰值。结论 BMSCs来源的成骨细胞和内皮细胞按1∶1比例共培养于壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架作为组织工程骨移植物,可以促进大鼠桡骨缺损部位骨的形成和血管化,促进骨缺损愈合。     

仿生组装纳米羟基磷灰石/壳聚糖骨修复材料的制备及其生物相容性研究

目的 探讨以一种简单、廉价的方法制备纳米羟基磷灰石/壳聚糖(n-HA/CS)复合材料,并评价其理化特征和生物相容性. 方法采用原位沉析和冷冻干燥法制备n-HA/CS支架,通过扫描电镜、组织切片染色、X线衍射和傅立叶红外光谱分析其微观形貌和组成;采用万能材料试验机分析材料的力学性能.采用材料浸提液和表面接种考察n-HA/CS复合材料对第3代人骨髓基质干细胞(hBMSCs)黏附、增殖的影响,评估其细胞相容性.将n-HA/CS复合材料植入新西兰大白兔背部肌袋,经组织学染色后评价其组织相容性. 结果 n-HA/CS复合材料具有多孔结构,孔隙率为(88.65±2.34)%,孔径为(112.63±20.47) μm,HA晶体颗粒长度为200～700 nm,且分散均匀;X线衍射和红外光谱分析表明合成的HA是含CO32-弱结晶纳米晶体.材料的断裂强度为(1.47±0.15)MPa,弹性模量为(37.52±3.43)kPa,可满足非负重部位骨修复要求.n-HA/CS材料浸提液未明显抑制hBMSCs的增殖,直接接种在n-HA/CS复合材料表面的细胞黏附、增殖功能正常;组织相容性实验也表明,植入4周后组织炎性反应明显减轻,12周后材料基本降解并由新生组织爬行替代. 结论采用原位沉析和冷冻干燥法制备的n-HA/CS复合材料具有良好的理化性质和生物相容性,有望应用于组织工程骨的构建.