上皮间质转化与肝纤维化的研究进展

上皮间质转化是一个复杂的病理生理过程,目前认为他在肝纤维化过程中起着重要的作用.现有研究表明肝上皮细胞(肝细胞、胆管上皮细胞、肝祖细胞)可以通过上皮间质转化而促进肝纤维化.该过程主要通过转化生长因子-β1信号通路调节,并涉及多种细胞因子的参与.本文就上皮间质转化与肝纤维化的关系作一综述.     

基于转化生长因子β/Smad信号通路探讨中医药干预上皮-间质转化的研究进展

肺纤维化是一种慢性进行性间质性肺疾病,病因不明,预后较差。西医治疗有吡非尼酮、尼达尼布、氧疗、肺移植等方式,但上述治疗方式费用昂贵,极大地增加了患者的经济负担,已有研究证明中医药治疗肺纤维化具有独特优势。上皮-间质转化（EMT）是肺纤维化发生发展的重要环节,本文总结了基于转化生长因子β(TGF-β)/Smad信号通路中医药干预EMT进而缓解肺纤维化的研究,以期为肺纤维化的研究提供方向。     

转化生长因子β1和Smad4在胃癌中的表达

目的胃癌预后极差,是最为常见的肿瘤致死病因.转化生长因子信号转导通路具有一系列重要的细胞调节功能,包括细胞的生长、分化、粘附、转移、细胞外基质的形成和免疫功能.探讨转化生长因子-β1(TGF-β1)和Smad4与胃癌发生发展的关系.方法采用免疫组化和分子原位杂交的方法,对49例胃癌、20例萎缩性胃炎和17例正常胃黏膜的TGF-β1蛋白和Smad4 mRNA表达进行检测.结果胃癌组织中TGF-β1蛋白表达明显增强,其阳性率(79.6%)明显高于正常胃黏膜组(35.3%)及萎缩性胃炎组(40.0%),Smad4 mRNA表达则明显降低,其阳性率(57.1%)明显低于正常胃黏膜组(94.1%)及萎缩性胃炎组(85.0%),差异均有显著性(P＜0.01).胃癌组织的分化程度越低,TGF-β1蛋白的阳性率越高,Smad4 mRNA阳性率越低.结论TGF-β1蛋白的高表达和Smad4 mRNA的低表达,对细胞的恶性转化及增殖可能有一定的生物学意义.     

肝内细胞上皮-间质转化: 肝纤维化发生的新机制

上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transiti-ons,EMT)现象是近年来肝纤维化研究的热点问题之一.根据其发生环境的不同,EMT分为3种类型:Ⅰ型在胚胎形成中;Ⅱ型在创伤修复和纤维化过程中;Ⅲ型发生在肿瘤侵袭和转移中.在此过程中,一些细胞表达物会发生变化,可以用于研究EMT.这些生物学标记物包括细胞表面蛋白、细胞骨架蛋白、细胞外蛋白、转录因子、微小RNA等.涉及EMT的主要信号通路有TGF-通路、Wnt通路等.研究EMT的方法有免疫组织化学和细胞世代追踪技术,前者较为普遍.本文着重介绍了肝内3种主要的细胞(肝细胞、胆管细胞、肝星状细胞)发生上皮间质转化的证据.均有体外试验证据证明肝细胞、胆管细胞、肝星状细胞在一定刺激因子作用下可以发生EMT,但仅有为数不多的利用细胞发育制图技术进行的体内试验结果则相互矛盾或有被质疑之处.总之,EMT现象在肝纤维化中是否存在以及起多大作用,是值得深入研究的有趣问题.本文的目的就是综述支持或反对肝纤维化进程中肝内细胞发生EMT/MET现象的证据,以便今后做更深入的研究.     

Nr4a1拮抗剂抑制肺癌细胞的上皮-间质转化的作用机制

目的观察Nr4a1拮抗剂在αVβ6-ERK-ETS1通路中抑制肺癌细胞上皮-间质转化的作用。方法培养传代肺癌A549细胞系,分为实验组及对照组,两组均采用生长因子诱导上皮-间质转化过程,实验组采用Nr4a1拮抗剂阻断αVβ6-ERK-ETS1通路,对照组不采用拮抗剂,采用流式细胞术及Western印迹检测信号通路中相关蛋白表达水平。结果形态学上,实验组组细胞呈梭形或类似于成纤维细胞的形态,而对照组部分细胞呈圆形或卵圆形。Western印迹及流式细胞检测均发现对照组细胞上皮细胞标志物E-cadherin、γ-catenin及αvβ6表达均较处理前显著降低,而间质细胞标记物Nβ-cateinin、Vimentin表达则有不同程度升高(P<0.05)。结论 Nr4a1拮抗剂能够通过αVβ6-ERK-ETS1通路抑制肺癌细胞的上皮-间质转化。     

宫颈病变组织中Vimentin、P16INK4A、Smad4的定位、表达及其在EMT中的作用

目的 观察Vimentin、P16INK4A和Smad4在宫颈癌及前期病变中的定位与表达水平,探讨其对宫颈癌细胞上皮—间质转化（EMT）的影响和可能机制.方法 免疫组织化学染色方法检测30例慢性子宫颈炎、30例低级别宫颈上皮内瘤变（CIN）、30例高级别CIN和30例宫颈癌中Vimentin、P16INK4A和Smad4的表达水平和定位.结果 Vimentin、P16INK4A和Smad4在各宫颈病变组织中呈不同程度阳性表达,在细胞质和细胞核均可表达.宫颈癌组织Vimentin 表达水平较慢性子宫颈炎、低级别CIN、高级别CIN高（P均＜0.01）.慢性子宫颈炎组织中P16INK4A阴性表达,在CIN和宫颈癌组织中表达水平升高（P均＜0.01）.慢性子宫颈炎组织中Smad4在细胞核与细胞质均高表达,低级别CIN、高级别CIN和宫颈癌组织中Smad4细胞核表达水平降低（P均＜0.01）.Spearman相关分析显示,120例宫颈病变组织中Smad4核表达与P16ININKA核质表达均呈负相关（r分别为-0.274、-0.387,P均＜0.01）,Smad4核表达与Vimentin核表达亦呈负相关（r=-0.209,P＜0.05）,P16INK4A核质表达与Vimentin核表达均呈正相关（r分别为0.334、0.443,P均＜0.01）.宫颈癌中Vimentin、P16INK4A和Smad4无论细胞核表达或细胞质表达均与宫颈癌的分化和年龄无相关关系（P均＞0.05）.结论 Vimentin、P16INK4A和Smad4在各宫颈病变组织细胞质和细胞核中呈不同程度阳性表达.Vimentin核表达是反映宫颈癌细胞EMT的良好指标,P16INK4A核表达和Smad4核表达与宫颈癌细胞EMT密切相关.     

上皮间质转化相关信号通路在肝纤维化中作用的研究进展

肝脏细胞上皮间质转化(EMT)是指在慢性肝损伤的微环境下上皮细胞失去原有特性而获得成纤维细胞典型特征的病理过程。EMT最终将导致肝纤维化。多种信号因子和多条信号通路参与EMT过程,研究表明,这些通路之间并不是独立存在的,相互之间存在紧密联系。近年来,靶向治疗已经成为肝纤维化治疗的研究热点之一,信号通路的研究为肝纤维化的靶向治疗提供了重要依据。     

红景天对大鼠肝纤维化肝脏组织Smad4、Smad7表达的影响

目的 探讨红景天对四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠肝纤维化肝组织Smad4、Smad7基因表达的影响.方法 健康雄性SD大鼠60只随机分组:①正常对照组;②肝纤维化模型组;③红景天干预组.每组20只.以CCl4腹腔注射法诱导大鼠肝纤维化,红景天干预组大鼠在造模的同时给予红景天灌胃,正常对照组给予橄榄油和生理盐水,8 w实验结束时处死动物,留取的肝脏组织做HE按0～4期标准判定肝纤维化程度,应用半定量RT-PCR及免疫组化法检测肝组织中Smad4、Smad7的表达.结果 模型组肝纤维化程度处于2～4期,其中大部分达3期以上,红景天干预组大鼠肝纤维化程度明显减轻,只有少部分达3期.红景天干预组大鼠肝脏Smad4蛋白、Smad4mRNA表达阳性率均低于模型组(P＜0.05);红景天干预组大鼠Smad7蛋白、Smad7mRNA阳性率高于模型组(P＜0.01).肝组织Smads蛋白表达与Smads mRNA水平变化一致.结论 红景天防治可显著抑制肝脏Smad4表达及促进Smad7的表达,从而减弱了由TGFβ1介导的肝纤维化信号,可能是其发挥抗肝纤维化作用的分子机制之一.     

Curcumin协同ABT-737对肝癌细胞上皮间质转化的抑制作用及相关机制初步研究

目的探讨Curcumin协同ABT-737对肝癌7404细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的抑制作用及机制研究。方法2μmol/L Curcumin、5μmol/L ABT-737或2μmol/L Curcumin+5μmol/L ABT-737作用肝癌7404细胞后,观察细胞形态的变化,细胞划痕实验检测7404细胞的迁移能力,蛋白质印迹法检测7404细胞中E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、ZEB1蛋白的表达和p-beta-catenin、p-JNK、Snail、Twist蛋白的表达。构建肝癌动物模型(Alb-Cre;P53f/f;Ras),在苏木精伊红染色下观察肝转移瘤情况,并对在肝脏形成的转移灶进行数量统计。结果相比2μmol/L Curcumin、5μmol/L ABT-737,2μmol/L Curcumin+5μmol/L ABT-737作用后,7404细胞梭形化明显减少(P<0.05),细胞迁移能力显著降低(P<0.05),Vimentin、N-cadherin、ZEB1蛋白的表达水平明显抑制(P<0.05),E-cadherin蛋白的表达水平明显上调(P<0.05),beta-catenin和JNK的磷酸化水平明显上调(P<0.05),beta-catenin下游靶基因Snail、Twist的表达水平明显抑制(P<0.05)。相比对照组,Curcumin+ABT-737作用后,肝癌动物模型(Alb-Cre;P53f/f;Ras)中肝转移瘤数量明显减少(P<0.05)。结论Curcumin协同ABT-737能抑制肝癌细胞上皮间质转化,JNK-beta-catenin可能参与EMT转化的抑制。     

胰腺癌组织DPC4／Smad4 mRNA表达的临床意义

目的：观察DPC4／Smad4 mRNA在胰腺癌组织中的表达及其临床意义。方法：应用原位杂交技术对23例胰腺癌组织中的DPC4／Smad4 mRNA表达进行研究。结果：胰腺癌组织中DPC4／Smad4 mRNA表达率为52．2％（12／23），低于癌周组织表达率9／10。统计学分析显示，DPC4／Smad4 mRNA表达与胰腺癌病理分级呈显著相关（P＜0．05），与胰腺癌临床分期有无局部淋巴结转移间无显著相关（P＞0．05）。结论：DPC4／Smad4 mRNA基因表达有可能作为胰腺癌诊断与鉴别诊断的生物学指标之一。     

头颈部鳞状细胞癌组织中 Smad7、Smad4蛋白的表达变化及意义

目的：观察Smad7及Smad4蛋白在头颈部鳞状细胞癌组织中的表达变化,并探讨其意义。方法采用免疫组化SP法分别对头颈部鳞状细胞癌组织、癌旁组织、活检留取的正常头颈部组织中的Smad7蛋白、Smad4蛋白、TGF-β1表达进行检测,分析三者间表达及其与肿瘤临床病理参数的关系。结果①TGF-β1和Smad7蛋白在肿瘤组织中的表达水平明显高于癌旁组织和正常组织（F分别为5．71、7．31）,而Smad4蛋白在肿瘤组织中的表达明显低于癌旁组织和正常组织（F为14．92）,P均＜0．05。②随肿瘤分化程度增高,TGF-β1及Smad7蛋白表达呈降低趋势（F分别为11．2、12．8）、Smad4蛋白呈升高趋势（F为7．91）,P均＜0．05;Smad4蛋白表达与肿瘤直径呈负相关、Smad7蛋白表达与肿瘤直径呈正相关（P均＜0．05）,TGF-β1表达与肿瘤直径无明显相关（P＞0．05）;Smad4蛋白表达在淋巴结转移者明显低于无转移者（P＜0．05）,有无淋巴结转移者Smad7蛋白及TGF-β1表达无显著差异（P＞0．05）。③Smad4蛋白表达与TGF-β1呈负相关（r＝-0．32）,与Smad7蛋白呈正相关（r＝0．39）,P均＜0．05。结论头颈部鳞状细胞癌组织中Smad7、Smad4蛋白表达异常,且可能通过调控上皮-间质转化参与肿瘤的侵袭、分化;检测两者（尤其是Smad4蛋白）可为临床分期、预后评估提供依据。     

活血渗湿方对肝纤维化大鼠肝组织中Smad4和Smad7表达的影响

目的:探讨活血渗湿方抗肝纤维化的作用机制.方法:应用40% CCl4油剂诱导50只SD大鼠形成肝纤维化模型,随机分成3组,即模型组、渗湿方组和软肝片组,分别灌服0.85%氯化钠溶液、活血渗湿方水煎剂、复方鳖甲软肝片水溶液.另设正常大鼠20只,作为正常组.药物干预12周后,处死大鼠,行肝组织苦味酸-天狼红染色,观察肝纤维化程度;免疫组织化学法检测肝组织Smad4和Smad7的表达,放射免疫法检测血清透明质酸(HA)水平.结果:与模型组相比,渗湿方组和软肝片组大鼠血清HA水平明显降低(P＜0.05).模型组大鼠肝纤维程度较高,渗湿方组与软肝片组大鼠肝脏纤维化程度较模型组显著改善(P＜0.05).与模型组相比,渗湿方组和软肝片组大鼠肝组织Smad4的阳性表达面积明显减少(P＜0.05),而Smad7的阳性表达面积明显增加(P＜0.05).结论:活血渗湿方具有明显抗肝纤维化作用,其机制可能是调节肝组织Smad4和Smad7的表达.     

人突变型CDK4真核荧光表达质粒的构建及对人肝细胞SMMC-7702中POLD1基因表达的调控

目的:构建包含突变型CDK4基因的真核绿色荧光表达载体,作为POLD1基因依赖的细胞周期复制调控的模型,研究POLD1基因相关的癌性增殖的机制,为干预细胞恶性增殖提供新的思路.方法:设计人突变型CDK4基因全长特异性引物进行P C R扩增人肝癌细胞系SMMC-7721总cDNA,以pEGFP-C1质粒为模板连接,得到重组质粒GFP-CDK4后进行测序和生物信息学比对分析;转染细胞分3组:实验组(转染突变型CDK4重组真核表达质粒GFP-CDK4),阴性对照组(转染空载体pEGFP-C1组)和空白对照组(SMMC-7702).通过MTT试验分析细胞增殖变化;实时荧光定量PCR技术检测CDK4、POLD1及细胞周期相关因子的表达量,Western blot检测蛋白表达的差异.结果:成功构建了人突变型CDK4基因真核表达质粒GFP-CDK4,转染到肝细胞SMMC-7702后使细胞表达融合绿色荧光的C D K4蛋白;S M M C-7721细胞中突变型的C D K4存在5个碱基突变,4个碱基插入,2个碱基缺失,这使得5个氨基酸序列发生了改变;与空白对照组及阴性对照组相比,实验组细胞增殖明显升高(0.826±0.08vs0.596±0.06,0.609±0.10,F=7.033,均P<0.05);实验组CDK4mRNA表达水平差异明显(1.94±0.11vs1.01±0.00,1.05±0.12,F=54.046,P<0.01),POLD1mRNA相应地升高(2.47±0.25vs1.16±0.00,1.26±0.23,F=135.496,P<0.01);稳定转染细胞的蛋白水平变化趋势与基因相同,其中实验组CDK4(0.65±0.03vs0.41±0.03,0.39±0.05,F=14.665,均P<0.05),P125(0.54±0.04vs0.30±0.07,0.25±0.06,F=11.788,均P<0.05).结论:人突变型CDK4基因的真核表达载体GFP-CDK4显著促进肝细胞的增殖能力,这与POLD1基因及P125蛋白的高表达相关.     

The receptor for β2GP Ⅰon membrane of hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721 is annexin Ⅱ

AIM： To evaluate the receptor protein which can specifically bind to β2GP Ⅰ on the membrane of hepatocellular carcinoma （HCC） cell line SMMC-7721, and to study the biological function of the receptor.
METHODS： Through β2GP Ⅰ -affinity chromatography column, the peptid-polysome-mRNA complex, which can specially bind to β2GPⅠ, stayed with the column and was separated from the whole polysome of liver cells, and then eluted and collected. Using cDNA synthesis kit and cDNA PCR kit, the corresponding cDNA was obtained and sequenced. RT-PCR was used to amplify annexin Ⅱ, and flow cytometry was used to study the competitive binding of annexin Ⅱ with β2GPⅠ to SMMC-7721.
RESULTS： A total of 1.1 kb of the cDNA fragment of the specific binding protein of β2GPⅠ on liver cell membrane was obtained. The sequence of cDNA shared high homology with human annexin Ⅱ（98%）. Annexin Ⅱ was expressed on the membrane of SMMC-7721, and could compete with β2GP Ⅰ for combining with SMMC-7721.
CONCLUSION： The receptor for β2GP Ⅰ on membrane of SMMC-7721 cells is annexinⅡ, which might bridge HBV to infect hepatocytes.     

羟基磷灰石纳米粒子诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的研究

目的观察不同浓度的羟基磷灰石纳米粒子对肝癌SMMC-7721细胞作用的影响。方法将羟基磷灰石纳米粒子以不同浓度和时间作用于肝癌SMMC-7721细胞，采用MTT比色法观察细胞毒性；应用电镜技术及HE染色法观察凋亡细胞的形态；原位末端标记法（TUNEL法）检测细胞凋产率。结果羟基磷灰石纳米粒子以剂量依赖和时间依赖的方式抑制SMMC-7721细胞的生长，作用48h后的半数有效抑制浓度IC50值为179．8μg／ml。HE染色和透射电镜观察到凋亡特性的形态学改变。结论HAP抑制SMMC-7721细胞的增殖，诱导细胞凋亡，HAP也许会成为临床治疗肝癌自可有效抗肿瘤药物。     

上皮间质转化在原发性肝癌侵袭、转移中的作用

上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮细胞在特定的情况下向间质细胞转分化的现象。在原发性肝细胞癌的侵袭、转移中存在这一现象。因此,本文除介绍EMT及其诱导调控因素之外,还对它在原发性肝癌侵袭、转移中的作用进行综述。     

Downregulation of alpha-fetoprotein siRNA inhibits proliferation of SMMC-7721 cells

AIM: To study the function of α-fetoprotein (AFP) in SMMC-7721 hepatoma cells. METHODS: A hairpin siRNA expressing plasmid pSilencer3.0-H1-afp was constructed and transfected into SMMC-7721 cells with Lipofectamine 2000. The expression of AFP was monitored by real-time RT-PCR and immunoassays, its effect on SMMC-7721 cell proliferation and cell death was detected by MTT and fluorescenceactivated cell sorter (FACS). RESULTS: The AFP-siRNA expressing plasmid downregulated the expression of AFP obviously (about 34%), and inhibited SMMC-7721 cell proliferation, but did not induce apoptosis. CONCLUSION: Downregulation of AFP siRNA inhibits proliferation of SMMC-7721 cells, but cannot cause apoptosis.