结核分枝杆菌mpt51基因原核表达载体的构建、表达和纯化

目的 构建结核分枝杆菌mpt51基因原核表达载体并进行表达、纯化.方法 用PCR扩增结核分枝杆菌mpt51基因,并克隆入pTA2质粒.测序正确后.再亚克隆人pET30a(+)质粒,构建pET30a(+):mpt51重组体.结果 以pET30a(+):mpt51转化BL21(DE3)后.经0.4 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导,重组菌表达出相对分子质量为38 000的重组蛋白.SDS-PAGE分析显示,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导4小时重组蛋白的表达量最高.表达蛋白以包涵体形式存在于胞质中.表达量占全菌蛋白质的30%.经Ni-NTA树脂纯化,获得纯度为90%的重组蛋白.结论 成功地构建原核表达载体pET30a(+):mpt51,并获得MPT51重组蛋白.为血清学诊断活动性结核病奠定了基础.     

HIV-1 Vif的克隆、表达与活性检测

目的克隆HIV-1Vif基因,构建原核表达质粒,进行蛋白的表达及其生物学活性的检测。方法 PCR扩增Vif基因,并将其克隆到原核表达载体pET28a(+)中,构建原核表达质粒pET28a(+)/Vif,进行双酶切及测序鉴定。获得的阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析,利用亲和层析方法纯化Vif蛋白。利用Pull-Down方法检测HIV-1Vif与SH3(HCK)特异性结合活性。结果通过酶切和测序,结果表明重组质粒pET28a(+)/Vif构建正确。SDS-PAGE和Western blot结果鉴定了原核表达的Vif重组蛋白大小正确。纯化了蛋白Vif、SH3和GST。GST pull-down试验说明Vif和SH3蛋白具有体外特异性结合活性。结论成功地克隆、表达和纯化了Vif蛋白,Vif与SH3蛋白具有结合活性,为进一步研究针对Vif与SH3结合的药物筛选提供实验依据。     

粪肠球菌心内膜炎抗原efaA蛋白的原核表达及纯化

目的原核表达纯化粪肠球菌心内膜炎抗原efaA蛋白,为粪肠球菌心内膜炎的致病机制研究及临床血清学诊断奠定基础。方法从粪肠球菌中扩增efaA基因,相应酶切后,克隆到原核表达载体pET30a中,构建pET30a-efaA重组质粒。经BamhI、XhoI酶切及测序鉴定,将pET30a-efaA质粒转化入BL21(DE3)。以IPTG诱导BL21(DE3)表达efaA融合蛋白,亲和层析纯化重组蛋白,SDS-PAGE、WesternBlot分析鉴定。结果PCR体外扩增efaA基因产物约943bp,重组表达质粒pET30a-efaA在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,通过亲和层析获得纯化重组蛋白。SDS-PAGE、Western免疫印迹显示蛋白表达带的分子量约为34kd。结论粪肠球菌心内膜炎抗原efaA蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达并纯化。     

GⅡ.2型诺如病毒VP1蛋白原核表达及蛋白纯化

目的利用原核表达系统,表达了GⅡ.2型诺如病毒VP1蛋白,优化诱导条件并进行蛋白的纯化。方法扩增诺如病毒的VP1基因,克隆至pET32a(+)载体,构建重组质粒pET32a-VP1。将pET32a-VP1转化至大肠埃希菌BL21(DE3),加入IPTG进行诱导表达并优化诱导条件。利用His标签镍离子蛋白纯化柱纯化表达蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度。结果成功扩增大小为1 659 bp的诺如病毒VP1基因。PCR检测重组质粒pET32a-VP1构建成功。将重组质粒转化至BL21(DE3),IPTG诱导表达70×10~3的VP1重组蛋白,优化的最佳诱导表达条件为37℃,0.6 mmol/L IPTG诱导5 h。重组蛋白以包涵体的形式表达,并SDS-PAGE鉴定镍柱纯化产物为单一电泳条带的目的蛋白。结论利用原核表达系统成功构建了重组质粒pET32a-VP1,并表达纯化了诺如病毒VP1重组蛋白,为单克隆及多克隆抗体的制备、检测试剂盒以及新型疫苗的研发奠定了基础。     

中国中部地区间日疟原虫分离株Duffy血型结合蛋白Ⅱ区的克隆表达与初步鉴定

目的克隆中国中部地区间日疟原虫分离株Duffy血型结合蛋白Ⅱ区基因(PvDBPⅡ),体外表达和鉴定重组PvDBPⅡ蛋白。方法PCR法从间日疟患者血液DNA样品中扩增PvDBPⅡ基因,将产物插入到原核表达载体pET28a(+)中,构建pET28a PvDBPⅡ重组表达质粒,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3+),异丙基βD硫代吡喃半乳糖苷诱导表达带有His标签的重组蛋白,采用镍柱亲和层析纯化重组蛋白,相应表达物分别采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot进行分析鉴定。结果PCR扩增的PvDBPII基因为1.1 kb,重组pET28a PvDBPⅡ质粒经测序验证,其插入片段序列与GenBank参考序列相似性为99%,转化E.coli所表达的重组蛋白分子量约为44 kDa,且能被间日疟患者血清特异性识别。结论成功克隆了PvDBPⅡ基因,表达了重组PvDBPII蛋白,为进一步研究基于PvDBPⅡ的红内期间日疟疫苗奠定了基础。     

恶性疟原虫FCC1/HN株嘌呤核酸磷酸化酶(PNP)基因的克隆和原核表达

目的 从恶性疟原虫基因组中扩增、克隆恶性疟原虫嘌呤核酸磷酸化酶(PNP)基因,并进行原核表达产物。方法根据恶性疟原虫FCB株嘌呤核酸磷酸化酶基因编码序列,设计一对引物,引入EcoR I和Xho I。采用PCR技术从恶性疟原虫FCC/HN株基因组DNA中特异扩增PNP基因。纯化后扩增产物用EcoR I和Xho I双酶切后,定向克隆入原核质粒pET30a( )和真核质粒pcDNA3,重组质粒pET30a( )-PNP转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性重组子后,用PCR、EcoRI Xho I双酶切和DNA序列测定鉴定。用IPTG诱导重组质粒pET30a( )-PNP表达融合蛋白。结果 从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组中特异扩增出PNP基因,将扩增的目的基因亚向插入pET30a( )和pcDNA3表达质粒的EcoR I和XhoI位点;重组子pET30a( )-PNP在大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达中表达,表达融合蛋白分子量为31.4kDa。结论 从恶性疟原虫基因组中获取PNP基因,并成功构建pET30a( )-PNP和pcDNA3-PNP重组质粒,获得PNP原核表达产物。     

类鼻疽伯克霍尔德菌AraC转录因子基因的原核表达及纯化北大核心CSCD

目的从海南类鼻疽伯克霍尔德菌菌株BPHN001中克隆得到AraC转录因子基因,构建类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)AraC转录因子基因原核表达质粒,对该转录因子基因进行原核表达,并对表达产物进行纯化。方法根据AraC转录因子基因设计特异性扩增引物,将PET-28a(+)质粒和扩增得到的AraC转录因子基因产物同时用BamHⅠ和HindⅢ双酶切,构建带His标签的重组质粒。经测序验证后,将重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3),采用最佳浓度IPTG进行诱导,采用SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达情况。通过Ni^(2+)柱纯化目的蛋白,采用Western blot检测纯化蛋白的免疫反应性。结果特异性引物扩增得到的产物大小约为1000 bp,与目的基因片段1032 bp基本一致。将扩增产物与PET-28a(+)载体连接后测序,与预期完全一致。重组载体转化BL21(DE3)后用最适IPTG浓度(0.5 mmol/L)诱导过夜(约16 h),SDS-PAGE检测表达产物分子质量在40~55 ku之间,与预期相符。表达蛋白纯化后进行Western blot,能被相应抗体识别。结论成功克隆得到AraC转录因子基因,,构建的含AraC转录因子基因原核表达载体转化DE3后经IPTG诱导可表达出融合蛋白,经Ni^(2+)柱纯化得到具有免疫反应原性的AraC转录因子蛋白,为AraC转录因子的功能研究奠定了基础。     

SARS冠状病毒M蛋白全长基因的克隆、表达与纯化

目的克隆SARS冠状病毒M蛋白基因编码序列，构建原核重组表达质粒pET23a-M，并在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达、纯化。表达产物用Western Blot检测其抗原性。方法RT-PCR扩增M编码基因目的片段，胶回收纯化，插入克隆载体pMD-18T载体并转化大肠杆菌DHSa。序列测定后亚克隆至表达质粒载体pET23a，构建重组体pET23a-M，转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆，以限制性酶切分析鉴定后，转化大肠杆菌BL21（DE3）以异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达。用SDS-PAGE与免疫印迹分析表达产物。结果PCR扩增出约675bp的特异性片段，与预期片段大小相符，测序鉴定无有义突变；所构建的pET23α-M重组体阳性克隆经PCR与双酶切鉴定，与预期结果一致；SDS-PAGE显示表达产物约27kD；表达产物经金属螯和层析纯化；免疫印迹表明表达产物能被混合的SARS病人恢复期血清识别。结论成功克隆了SARS冠状病毒M蛋白基因编码序列，构建了pET23α-M表达质粒，诱导表达并纯化出了SARS冠状病毒M蛋白，并以免疫印迹鉴定。本研究的成功为进一步进行SARS病毒诊断试剂与疫苗的开发奠定了基础。     

结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药相关蛋白的原核表达及纯化

目的构建结核分枝杆菌pncA基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌吡嗪酰胺酶的表达蛋白。方法制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用聚合酶链反应扩增目的基因片段;通过pET28a构建表达载体pET28a-pncA,序列测定证实正确后转化大肠埃希菌DH10b,经IPTG诱导表达His-吡嗪酰胺酶融合蛋白,采用SDS-PAGE和Western blot分析重组蛋白。结果扩增出结核分枝杆菌pncA基因并构建了具有正确基因序列的质粒载体pET28a-pncA,转化大肠埃希菌BL21后经诱导产生了分子质量单位约20ku的表达产物,并得到纯化的带His标签的目的蛋白。结论构建了结核分枝杆菌pncA基因原核表达质粒,并诱导表达了His-吡嗪酰胺酶融合蛋白,为进一步研究吡嗪酰胺耐药性奠定了基础。     

犬圆环病毒ORF3基因的克隆及表达载体的构建

目的克隆犬圆环病毒(Canine circovirus,CanineCV)ORF3基因,制备ORF3的抗体,为研究ORF3的功能奠定基础。方法以CanineCV基因组为模板,PCR扩增编码框ORF3全长序列。将ORF3基因克隆至原核表达载体pET-28a,构建重组原核表达质粒pET(28a)-ORF3。重组质粒转化入感受态细胞BL21(DE3),用IPTG诱导表达重组蛋白ORF3,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果 PCR扩增出CanineCV编码框ORF3片段长度为318bp。构建的重组质粒pET(28a)-ORF3转化DE3后经IPTG诱导5h,表达分子质量单位(Mr)约为15×103蛋白,与预期相符。Western blot显示重组蛋白能被Anti-His标签抗体识别。结论成功构建了pET(28a)-ORF3重组原核表达质粒,并能在大肠杆菌中表达具有免疫反应性的ORF3,为抗ORF3抗体的制备奠定了基础。     

华支睾吸虫F0-ATP合酶b亚基基因的克隆表达和重组蛋白的免疫原性分析

目的 对华支睾吸虫F₀-ATP合酶b亚基（CsF₀-ATP-synt_B）基因进行克隆、表达及重组蛋白的免疫原性分析。 方法 以华支睾吸虫成虫cDNA文库中含有F₀-ATP合酶b亚基基因的质粒为模板，扩增该基因（去除线粒体靶向序列的成熟肽基因），将其克隆到原核表达质粒pET-28a（+）中，转化大肠埃希菌BL21（DE3），异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达，经亲和层析获得的纯化表达产物免疫SD大鼠，制备抗血清。蛋白质印迹（Western blotting）分析重组蛋白的免疫原性。 结果 华支睾吸虫F₀-ATP合酶b亚基成熟肽基因的编码区含813个碱基，编码271个氨基酸，相对分子质量（Mr）为31 171.9。经亲和层析获得的重组蛋白可被其免疫的大鼠血清识别。 结论 华支睾吸虫F₀-ATP合酶b亚基基因可在原核表达系统中获得具有免疫原性的高效表达。     

结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达

目的　在大肠杆菌中高效融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白ESAT 6和CFP 10 ,获得纯化的重组ESAT6 CFP10 (rCFP10 ESAT6 )融合蛋白抗原。方法 通过聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)扩增CFP10 ESAT6融合基因 ;以质粒pET 2 8a为表达载体 ,构建重组质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ;以异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达目的蛋白 ,通过SDS PAGE电泳和蛋白免疫印迹法 (Westernblotting)鉴定rCFP10 ESAT6在大肠杆菌中的表达 ,确定rCFP10 ESAT6蛋白抗原在大肠杆菌中的表达形式 ;采用ChelatingSepharoseFastFlow蛋白纯化试剂纯化重组蛋白。West ernblotting及酶联免疫吸附试验 (ELISA)分析重组蛋白的免疫原性。结果 重组质粒pET2 8a CFP10 ESAT6中目的基因测序结果与报道序列相同 ;在大肠杆菌中以可溶性形式表达 ;分子量约2 8kDa ,表达量约占菌体总蛋白的 4 6 % ,纯化后的rCFP10 ESAT6样品经SDS PAGE和激光密度扫描分析表明其纯度为 90 %左右 ,每 10 0ml培养菌可获得 16mg左右的重组蛋白 ;Western印迹结果证实重组蛋白与His·tag单克隆抗体及确诊的肺结核病患者血清发生特异免疫反应。ELISA结果分析表明 ,该重组抗原能区分肺结核患者血清及正常人血清。结论 成功地表达和纯化了结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白。该重组蛋白具有特异的免疫原性。     

日本血吸虫SCP/TAPS基因家族的生物信息学分析和克隆表达

目的以黄蜂Vv Vesv5蛋白为检索源检索日本血吸虫EST数据库,对检索出的序列进行生物信息学分析,并挑选出有代表性的基因进行克隆表达,为日本血吸虫SCP/TAPS家族蛋白的功能研究打下一定的基础。方法利用生物信息学软件对检索出的日本血吸虫SCP/TAPS家族蛋白进行生物信息学分析,经PCR确定后,以AAW24579为代表进行进一步的研究,将其命名为SjVAL2。根据SjVAL2的序列设计引物,通过RT-PCR扩增出全长编码区域,克隆到原核表达载体pET-28a（＋）中,在大肠埃希菌中诱导表达并纯化,免疫印迹实验（Western-blotting）鉴定纯化的重组蛋白。结果日本血吸虫SCP/TAPS家族中至少有17个不同的蛋白成员存在,多序列比对分析发现它们初步可以分为3个不同的亚组。以日本血吸虫成虫cDNA为模板RT-PCR扩增出SjVAL2序列,PCR、双酶切及DNA测序均证实pET-28a（＋）-SjVAL2重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明,目的基因在大肠埃希菌中获得高效表达,重组蛋白能识别日本血吸虫感染的小鼠血清,说明其具有免疫反应性。结论日本血吸虫SCP/TAPS家族中至少有17个不同的蛋白成员存在,其中SjVAL2基因可在原核表达系统中高效表达,为进一步研究该家族蛋白的功能打下基础。     

广州管圆线虫雌性成虫肌蛋白-1基因的克隆表达及免疫学效应分析

目的 对广州管圆线虫雌性成虫肌蛋白-1(Ac-fmp-1)基因的开放读码框进行克隆、表达及重组蛋白的免疫学效应分析,评价其重组蛋白在免疫学诊断中的应用前景。方法 逆转录聚合酶链反应扩增目的基因,克隆至原核表达载体pET-30a-c(+),重组质粒转化至大肠埃希菌E.coli BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,镍离子亲和层析(Ni-IDA)纯化分离表达产物。免疫印记(Western-blot)和酶联免疫吸附试验(ELISA)分析重组蛋白的免疫性。结果 广州管圆线虫Ac-fmp-1基因的编码区有1 251个碱基,编码417个氨基酸。原核表达载体pET-Ac-fmp-1构建成功,IPTG诱导表达获得了体外高效表达的重组融合蛋白,经亲和层析得到纯化蛋白。融合蛋白可被感染广州管圆线虫的SD大鼠血清及病人血清所识别;作为包被抗原用于ELISA检测大鼠血清其敏感性与特异性均为100%,与粗抗原无差别;检测广州管圆线虫病人血清敏感性为100%,与粗抗原有差别;检测其他寄生虫病人血清与正常病人血清其特异性为100%和98%,与粗抗原相比特异性较高。结论 广州管圆线虫Ac-fmp-1基因在原核表达系统获得高效表达,编码蛋白可能是虫体的重要抗原成分,在免疫学诊断方面有潜在的应用前景。     

阴道毛滴虫病毒衣壳蛋白基因cap2037的克隆与表达

目的对阴道毛滴虫病毒衣壳蛋白基因的克隆与原核表达。方法提取阴道毛滴虫总核酸为模板，根据所克隆的阴道毛滴虫病毒部分序列和GenBank中发表的阴道毛滴虫病毒TvV—T1序列设计一对引物，经RT—PCR得到与预计大小一致的PCR特异性产物，将其克隆到pMD-18T载体后测序，并与GenBank中核苷酸序列进行同源性搜索与分析，再将其克隆至表达载体pET28a。并以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。结果目的基因片段长度为2037bp，与阴道毛滴虫病毒T1株（U08999）的同源性最高为82．9％，构建原核表达载体pET—Cap2037；IPTG诱导后，SDS—PAGE显示表达产物的大小约75kDa。结论成功克隆出阴道毛滴虫病毒衣壳蛋白基因序列，与TVV—T1株序列有82．9％的同源性，经IPTG诱导，SDS-PAGE分析表明，75kDa蛋白基因在大肠杆菌BL21（DE3）中得到高效表达。     

华支睾吸虫Rap2B样基因的生物信息学分析及其克隆、表达

目的从华支睾吸虫cDNA文库中筛选Rap2B样基因并分析其结构和功能,初步进行克隆和表达纯化,为进一步研究其功能奠定基础。方法利用多种生物信息学分析软件,分析华支睾吸虫Rap2B蛋白的拓扑学结构、生物学和免疫学功能特征。设计引物,从华支睾cDNA质粒文库中扩增目的基因cDNA序列,构建原核重组质粒并初步表达纯化。结果华支睾吸虫Rap2B样基因长度为847bp,其全长编码序列为426bp,编码141个氨基酸,理论分子量是15851.1。重组的原核表达质粒pET-28a(+)-Rap2B经PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒构建成功。该基因在大肠杆菌中能高效表达。经His亲和层析柱获得了纯化的重组蛋白,Western blotting证实Rap2B重组蛋白能被感染华支睾吸虫的大鼠血清识别。结论华支睾吸虫Rap2B蛋白经生物信息学预测为ras原癌基因家族成员,可能在华支睾吸虫致癌过程中有一定作用。该基因可在原核表达系统中高效表达,并得到了纯化的重组蛋白,为进一步研究该蛋白的功能以及在致病尤其是可能促发肿瘤的作用方面奠定一定基础。     

弓形虫表面抗原SAG2基因的克隆表达纯化及鉴定

目的构建弓形虫表面抗原2(SAG2)基因重组质粒并在大肠埃希菌中表达。方法根据SAG2基因序列设计并合成引物,用PCR法从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因片段,再克隆到p GEX-4T载体中,构建重组质粒。重组质粒经酶切鉴定并测序后,在大肠埃希菌BL21中诱导表达,产物经SDS-PAGE分析并纯化,以Western blotting分析其反应原性。结果 SAG2基因PCR产物大小约为561 bp,与预期相符。重组质粒经酶切及PCR鉴定构建成功,测序结果与已知序列吻合。重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达的SAG2融合蛋白分子量约为47 ku,该蛋白可被GST标签抗体识别。结论成功重组了弓形虫SAG2基因,表达蛋白具有反应原性。     

弓形虫三磷酸核苷水解酶基因克隆、表达与鉴定

目的 对刚地弓形虫三磷酸核苷水解酶基因（NTPase）进行克隆、表达和鉴定。 方法 采用PCR扩增刚地弓形虫RH株的NTPase基因，克隆入pGEM?-T Easy载体，经酶切与测序鉴定后亚克隆至表达质粒pBAD-HisB，并转入大肠埃希菌(E.coli)BL21（DE3）中进行诱导表达。用镍-次氮基三乙酸亲和层析柱纯化重组质粒pBAD-HisB-NTPase表达产生的含组氨酸的重组蛋白，用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹（Western blotting）分析蛋白表达产物。 结果 PCR扩增得到特异的刚地弓形虫NTPase-Ⅱ基因序列，经测序鉴定无基因突变。SDS-PAGE结果表明NTPase-Ⅱ基因在E.coli BL21（DE3）中获得高效表达，其融合蛋白相对分子质量（Mr）约70 000，与理论值相近。Western blotting分析结果显示，纯化的重组蛋白可被弓形虫感染的鼠血清及鼠抗重组蛋白血清识别。 结论 所克隆表达的弓形虫NTPase-Ⅱ重组蛋白具有良好的抗原性。     

弓形虫RH株膜表面抗原2全长基因的高效表达与抗原性分析

目的　构建原核重组表达质粒pET23aSAG2,并在大肠埃希菌中实现高效表达,以及检测表达产物的抗原性。　方法　PCR扩增SAG2编码基因目的片段,琼脂糖凝胶电泳回收纯化,克隆至pMD18T载体,转化大肠埃希菌DH5α。测序后亚克隆至表达质粒载体pET23a,构建重组表达质粒pET2 3aSAG2,转化大肠埃希菌DH5α。筛选阳性克隆,经限制性酶切分析鉴定后,转化大肠埃希菌BL21(DE3),以异丙基 βD硫代半乳糖苷诱导表达。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)与免疫印迹分析表达产物。　结果　PCR扩增出约500bp的SAG2编码基因目的片段,与预期片段大小相符,经测序鉴定无基因突变;所构建的pET23aSAG2重组表达质粒阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致;含有pET23aSAG2重组质粒的大肠埃希菌BL21(DE3)诱导后得到了高效表达,SDS PAGE显示表达产物约Mr19000;免疫印迹结果表明表达产物具有良好的抗原性。　结论　成功构建了pET23aSAG2表达质粒,实现了全长成熟SAG2蛋白在大肠埃希菌中的高效表达;表达产物具有良好的抗原性。     

重组分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32的表达及其抗原性

目的 重组表达结核分枝杆菌CFP10和ESAT 6的融合蛋白及卡介苗（BCG）CFP32,分析其抗原性。 方法 用重组PCR从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA中扩增获得融合基因cfp10-esat6;从BCG基因组DNA中扩增cfp32基因。经克隆和测序分析后,分别亚克隆至表达载体pQE-30和pET-23a(+),在大肠埃希菌BL21中表达重组蛋白,予以纯化、 鉴定,Western blot和间接ELISA分析重组蛋白的抗原性。 结果构建了重组表达质粒pQE30-cfp10-esat6和 pET-cfp32,表达了CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32。CFP10-ESAT6蛋白表达量约占菌体总蛋白的15.2%,纯化后蛋白纯度约为92%,浓度为0.456-g/L;CFP32蛋白表达量约占菌体总蛋白的10.6%,纯化后蛋白纯度约为90%,浓度为0.310-g/L。纯化CFP10-ESAT6融合蛋白和CFP32检测结核病的敏感性分别为85.7%和71.4%,特异性均为100%。 结论 重组表达获得具有良好抗原性的重组融合蛋白CFP10-ESAT6和重组蛋白CFP32。