小鼠内皮祖细胞的分离、培养与定向诱导分化

目的 建立一种稳定、高效,从小鼠骨髓中分离培养与定向诱导分化内皮祖细胞(EPCs)的方法。方法 从小鼠骨髓中密度梯度离心法分离单个核细胞,经差速贴壁结合特殊培养基扩增并向内皮细胞定向诱导分化EPCs。应用免疫荧光和流式细胞技术鉴定内皮细胞系列标志:CD34、CD31、Flk-1和祖细胞标志CD133。并通过检测其对FITC标记的UEA-1的吸附和内吞DiI-ac-LDL来进行细胞功能学的鉴定。对分化细胞行vWF、CD31 免疫组化染色鉴定,并与血管内皮细胞合成前列腺素能力进行比较。结果 经过梯度密度离心和贴壁法选择的细胞表达内皮细胞特异性抗原CD34、CD31、Flk-1,部分表达CD133。分离所得细胞经EBM-2专用培养基培养后,第4天可见集落形成,培养第9天流式细胞仪检测其CD34、CD133、CD31、Flk-1阳性率分别为(44±4)%、(18±3)%、(49±4)%和(79±6)%,细胞能特异性吸附FITC标记的荆豆凝集素并内吞DiI-ac-LDL,约3周左右可融合近80%,形成铺路石样内皮细胞特有形态。传代后vWF、CD31免疫组化染色阳性率分别为(66±5)%和(56±5)%。诱导后的内皮祖细胞的合成前列腺素能力与血管内皮细胞之间无显著差异。结论 从小鼠骨髓中分离培养与定向诱导分化EPCs的方法,效率高,稳定性和重复性好。     

成人骨髓源内皮祖细胞的体外分离培养及鉴定

目的探讨成人骨髓源内皮祖细胞（EPCs）体外分离培养的可行性。方法抽取成年男性骨髓,体外全骨髓培养,传代后采用免疫微珠分选方法收集CD南细胞,EGM—MV2条件培养基诱导培养EPCs,观察细胞形态、生长情况;采用流式细胞技术检测分选细胞纯度,免疫荧光法检测EPCs特殊分子标志物CD34,CD133和VE-cadherin表达,透射电子显微镜观察分选细胞超微结构,UEA-1和Dil-ac-LDL双染色法检测分选细胞的吞噬功能。结果分选后细胞培养第3天出现集落样生长,集落边缘细胞形态伸展呈梭形或多边形,传代后呈现串珠样排列;培养至5～6d,细胞连接成大片条索状结构;CD34^＋、CD133^＋细胞百分率分别为24．13％、93．29％,其表面特异性表达CD133、CD34、VE-cadherin,具有EPCs形态特征,能吞噬Dil-ac-LDL并结合UEA-1。结论成人骨髓来源的EPCs经体外培养后形态、增殖率、生存能力、表面标志表达、功能等均较为稳定,可作为心血管组织工程种子细胞或用于干细胞治疗。     

人脐静脉血内皮祖细胞的分离扩增和生物学特征

目的:探索人脐静脉血内皮祖细胞的分离和扩增条件,并观测其生物学特性.方法:采集人脐静脉血,应用密度梯度离心法,分离其中单个核细胞,流式细胞术检测CD133 CD34 阳性率;利用差速贴壁法(48 h内贴壁和48 h后贴壁)联合内皮细胞专用培养基EGM-2培养细胞,接种于预先包埋了明胶培养瓶或培养板,倒置显微镜观察细胞生长形态和形成集落能力,免疫细胞化学法检测其免疫表型,摄取Ac-LDL和连接UEA-1功能,在生长因子培养体系中诱导其向成熟内皮细胞分化.结果:所获单个核细胞中CD133 CD34 百分比为1.06%;在EGM-2培养体系下可获得2种亚型的内皮祖细胞,即早期内皮祖细胞和晚期增殖性内皮祖细胞.其中48h后贴壁细胞属于早期内皮祖细胞,增殖能力较弱,免疫荧光检测,显示CD14和CD34KDR胞浆呈阳性表达,Ac-LDL UEA-1 功能特征;而48 h内贴壁细胞在10～17 d时可见由单个细胞增殖形成的克隆,呈铺路石样单层排列,增殖力旺盛形成融合状态,形成次集集落;经免疫荧光检测,显示CD133CD34和CD34KDR细胞质呈阳性表达,Ae-LDL UEA-1 功能特征,传代后vWF,CD31呈强阳性表达,是晚期增殖性内皮祖细胞.结论:经人脐静脉血可分离培养获得2种亚型的内皮祖细胞,在特定的培养体系中细胞可由祖细胞表型向成熟内皮细胞分化.     

不同诱导因子下内皮祖细胞具有双向分化的潜能

目的探讨内皮祖细胞(EPCs)在不同诱导因子作用下的体外分化潜能。方法人脐血单个核细胞分别予50ng/ml血管内皮生长因子(VEGF组)或50ng/ml血小板源生长因子(PDGF组)诱导分化。光镜形态观察,免疫荧光鉴定。流式细胞分析CD133+EPCs分化特征。结果新鲜脐血分离单个核细胞培养1周后贴壁细胞的EPCs特异的DiI标记乙酰化低密度脂蛋白鉴定为80%阳性。在VEGF或PDGF诱导下1周,单个核细胞大量贴壁生长多呈圆形,少量梭形生长。2周时,被诱导细胞有近50%贴壁呈梭形生长,VEGF组和PDGF组无明显差异。至4周时两组出现明显的分化差异,其中VEGF组呈"铺路石"样细胞融合,血管性假血友病因子免疫荧光呈阳性;而PDGF组呈梭形或长多角形融合,予α-平滑肌肌动蛋白标记部分呈阳性。单个核细胞磁珠分选后得到CD133+较CD133-更多分化为内皮样细胞(P<0.05);而在PDGF的诱导下CD133-较CD133+更多分化为平滑肌样细胞(P<0.05)。结论单个核细胞在体外不同的诱导因子诱导下可以双向分化,CD133+EPCs具有更强的内皮细胞分化潜能。     

改良法分离培养兔骨髓源性早晚期内皮祖细胞

目的探索简单有效分离培养兔骨髓源性内皮祖细胞的方法,并比较两种内皮祖细胞生物学性状。方法 4周龄左右的新西兰兔,于每侧胫骨取骨髓2 mL,密度梯度离心后取单个核细胞接种于培养瓶,48 h后将悬浮的细胞收集再次贴壁,血管内皮生长因子诱导其向内皮祖细胞分化。免疫细胞化学鉴定其表面标志物、免疫荧光功能学测定,对比前后两种贴壁细胞生长状况。结果早期获取的单个核细胞,半小时后就开始贴壁,3天左右即可长出长梭形的细胞,胞体较大,有血岛样克隆形成,随后培养可形成管腔样结构,10天左右即可呈漩涡状融合整个培养瓶,但这种细胞传代能力差,为早期内皮祖细胞;第2次贴壁的晚期细胞于贴壁后呈椭圆形生长,贴壁后5～7天即可出现集落,片状生长,最后呈铺路石样融合,并可连续传至10代以上,为晚期内皮祖细胞。第2次贴壁的内皮祖细胞在分化过程中明显失去CD133+,而CD34+表达有所升高,大部分第1次贴壁内皮祖细胞可以吞噬乙酰化低密度脂蛋白和荆豆凝集素l,第2次贴壁内皮祖细胞功能学鉴定结果与第1次贴壁的结果类似。结论改良后的密度梯度离心法结合差速贴壁法能有效分离培养兔骨髓源性内皮祖细胞,第2次贴壁的内皮祖细胞生长能力更强。     

兔血管内皮祖细胞的分离及诱导分化

目的:探讨自兔骨髓中分离及诱导血管内皮祖细胞(EPCs)的方法。方法:抽取兔骨髓,Ficoll离心液梯度离心,分离出骨髓单个核细胞,用含有血管内皮生长因子(VEGF)、碱性纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的M199培养液诱导培养EPCs,透射电镜及免疫荧光法对所培养细胞进行鉴定。结果:细胞诱导培养48~72h后即可见有细胞贴壁,逐渐变成梭形。培养至8d左右,可观察到数条由梭形贴壁细胞直线生长连接而成的条索,7~10d出现多个细胞团,贴壁的梭形细胞开始从细胞团的边缘出芽长出,培养至14d左右,细胞逐渐融合,连接成大片条索状结构。透射电镜及免疫荧光检查证实为血管内皮祖细胞。结论:梯度离心法自兔骨髓获得单个核细胞,在体外经诱导分化可获得血管内皮祖细胞。     

基质细胞衍生因子1α对大鼠骨髓源内皮祖细胞迁移的影响

目的观察基质细胞衍生因子1α对体外培养的大鼠骨髓源内皮祖细胞迁移的影响。方法微孔法从大鼠骨髓提取内皮祖细胞。免疫荧光鉴定血管内皮生长因子受体2和CD133,不同浓度基质细胞衍生因子1α处理内皮祖细胞后,采用Transwell迁移系统检测内皮祖细胞迁移能力。结果分离出的大鼠骨髓内皮祖细胞免疫荧光下血管内皮生长因子受体2 和CD133 双阳性,基质细胞衍生因子1α呈浓度依赖性促进内皮祖细胞迁移,对照组与基质细胞衍生因子1α各处理组比较差异均具显著性(P<0.05或P<0.01)。结论基质细胞衍生因子1α呈浓度依赖性促大鼠骨髓源内皮祖细胞迁移。     

外源性内皮祖细胞在裸鼠骨髓内的归巢和维持

目的研究外源性内皮祖细胞（EPCs）在裸鼠骨髓内的归巢性和维持情况,及缺氧诱导因子1α（HIF-1α）在其中的作用。方法从脐血中利用梯度密度离心法分离、培养EPCs。将绿色荧光蛋白（GFP）基因转染入EPCs,将转染后的EPCs移植到肢体缺血的裸鼠体内。分别在术后12 h、3 d7、d、14 d2、1 d通过荧光显微镜、免疫组化和PCR检测GFP-EPCs、CD133、HIF、CD31在裸鼠皮肤、脾脏、缺血组织和骨髓中的表达情况。结果在裸鼠缺血组织和骨髓内可见转染GFP的EPCs。缺血组织和骨髓内的CD133、HIF-1αRNA表达高于皮肤和脾脏内（P〈0.01）。移植后71、42、1 d,CD133在骨髓内的表达无明显改变（P〉0.05）。结论外源性EPCs可在受体体内向骨髓归巢,并在一定时间内在骨髓内保持未分化状态。     

人和大鼠内皮祖细胞培养及其生长特性的比较

目的建立人内皮祖细胞（hEPCs）离体培养的方法,探讨培养条件,观察细胞生长状态、形态。xd同时行大鼠EPCs（rEPCs）培养。建立hEPCs和rEPCs培养体系,比较两者不同的生长条件和生长状态。方法：取人脐带血80-120ml/袋,先分离单个核细胞,后使用磁珠细胞分选法（MACS）,分选出CD133＋/VEGFR2＋的细胞,进行流式细胞检测,发现双阳性细胞占48.79%。用差速贴壁法培养5-9天,倒置相差显微镜观察细胞形态并照相、免疫荧光染色后荧光显微镜下观察照相。取大鼠骨髓,冲洗骨髓腔,离心沉淀出细胞,差速贴壁培养法培养、观察。结果：（1）hEPCs在普通光镜下呈索条状、卵圆形。（2）细胞吞噬DiI-acLDL、UEA染料后可在荧光显微镜下特异显色,证明细胞有吞噬功能,推断为hEPCs。（3）CD133＋/VEGFR2＋的hEPCs细胞,占使用MACS筛选后细胞比例为48.79%。（4）从骨髓中分离出的rEPCs生长活力明显优于hEPCs。结论：（1）该方法培养的hEPCs和rEPCs生长活性好,在普通光镜下呈索条状、卵圆形或铺路石样;（2）hEPCs在细胞数量上可不少于rEPCs,从骨髓中培养出的rEPCs增殖力优于脐血来源的hEPCs。此实验比较并完善了两种不同来源内皮祖细胞培养的方法学及其生长特征,有利于根据不同的细胞培养特性来选择应用于内皮祖细胞的实验研究。     

人外周血内皮祖细胞的分离培养及鉴定

目的:从人外周血中分离培养内皮祖细胞(EPCs),并探讨其体外诱导培养的条件。方法:密度梯度离心法分离正常人外周血单个核细胞,置于鼠尾胶原包被的培养瓶中进行体外培养,流式细胞术和免疫荧光法检测分化细胞表面特异性抗原标记物的表达。结果:人外周血单个核细胞在鼠尾胶原包被的培养瓶中培养后呈梭形,并表达内皮细胞的特异性抗原CD34和KDR,和干/祖细胞抗原CD133。提示这些培养细胞既具有内皮细胞的表面标志和功能,又具有祖细胞特性。结论:成功从外周血中培养出EPCs。鼠尾胶原可取代EPCs培养中常用的纤维连接蛋白,是体外分离培养外周血EPCs的更节省的一种方法。     

Endothelial progenitor cells: isolation and characterization

Bone marrow of adults contains a subtype of progenitor cells that have the capacity to differentiate into mature endothelial cells and have therefore been termed endothelial progenitor cells (EPCs). Of the three cell markers (CD133, CD34, and the vascular endothelial growth factor receptor 2) that characterize the early functional EPCs, located predominantly in the bone marrow, EPCs obviously lose CD133/CD34 and start to express CD31, vascular endothelial cadherin, and von Willebrand factor when migrating to the circulation. Various isolation procedures of EPCs from different sources by using adherence culture or magnetic microbeads have been described, but published findings with regard to the number of EPCs in the peripheral circulation of healthy adults are scanty and no data regarding the lifetime of EPCs in vivo exist. Clinical studies employing EPCs for neovascularization of ischemic organs have just been started; however, the mechanisms stimulating or inhibiting the differentiation of bone marrow-derived EPCs in vivo and the signals causing their adhesion, migration, and homing to sites of injured tissue are largely unknown at present.     

骨髓源性内皮祖细胞与内皮细胞共培养促进其向成熟内皮细胞分化的研究

目的：探讨共培养的内皮细胞对内皮祖细胞向成熟内皮细胞分化的影响。方法：分离1～2个月龄,SD大鼠股骨髓,个核细胞（MNCs）,MNCs,Dil-ac-LDL与FITC-UEA-1荧光双染鉴定内皮细胞的特性。应用贴块法培养大鼠腹主动脉的内皮细胞,vWF免疫组化染色进行鉴定。采用Transwell培养板,上、下室分别加入内皮祖细胞和内皮细胞,15%胎牛血清的NO.2 DMEM/F12培养液培养14 d,倒置相差显微镜观察培养内皮祖细胞的形态。RT-PCR检测eNOS、vWF mRNA,流式细胞术检测CD31及KDR的表达。结果：荧光双染显示培养的单个核细胞具有内皮祖细胞特性;共培养的内皮祖细胞呈短梭型、铺路石状,培养至4 w时有复杂的网状结构形成。RT-PCR检测显示,eNOS及vWF mRNA表达均较对照组显著增加（P〈0.05）。流式细胞术分析表明,共培养组的内皮祖细胞CD31及KDR的表达,也显著高于对照组（分别为P〈0.05及P〈0.01）。结论：与内皮细胞共培养可促进内皮祖细胞向成熟内皮细胞分化。     

Selective functional exhaustion of hematopoietic progenitor cells in the bone marrow of patients with postinfarction heart failure.

OBJECTIVES: This study investigated whether reduced levels of circulating endothelial progenitors cells (EPCs) in chronic heart failure (CHF) are secondary to an exhaustion of hematopoietic stem cells (HSCs) in the bone marrow or to reduced mobilization. BACKGROUND: Circulating EPCs presumably originate from bone marrow-derived HSC. Persistent mobilization of EPCs was shown to be associated with favorable left ventricular infarct remodeling processes. METHODS: We assessed the number and functional capacity of EPCs in 17 healthy controls, 25 patients with ischemic cardiomyopathy (ICM), and 20 patients with dilated cardiomyopathy (DCM). To document an impairment of HSC function in the bone marrow, the colony-forming unit capacity of bone marrow-derived mononuclear cells and the number of CD34+ HSCs were examined in 6 healthy volunteers, 94 ICM patients, and 25 DCM patients. RESULTS: The number of EPCs was reduced in CHF, irrespective of its etiology. In contrast, the migratory capacity was selectively impaired in EPCs of ICM patients (4.8 +/- 4.0 migrated cells; DCM 9.7 +/- 5.8; p = 0.02). On multivariate analysis, ICM, advanced New York Heart Association functional class, and CHF were independent predictors of functional EPC impairment. The number of bone marrow-derived CD34+ cells did not differ between the CHF populations. However, colony-forming units (CFUs) were selectively reduced in ICM patients (54.4 +/- 24.6; DCM 68.1 +/- 26.9; p < 0.02). Ischemic cardiomyopathy was the only independent predictor of impaired CFU capacity. Impaired CFU capacity was associated with reduced matrix metalloproteinase-9 activity in the bone marrow plasma. CONCLUSIONS: Ischemic cardiomyopathy is associated with selective impairment of progenitor cell function in the bone marrow and in the peripheral blood, which may contribute to an unfavorable left ventricular (LV) remodeling process.     

巴曲酶对内皮祖细胞功能的影响及其机制的探讨

目的研究巴曲酶(DF-521)对体外培养下内皮祖细胞(EPCs)的增殖、分化、成血管能力以及NO分泌能力的影响,并探讨其可能的机制。方法从人外周血中提取单个核细胞,用流式细胞术检测细胞表型CD34、CD31、血管内皮生长因子2和血管性假血友病因子(vWF),激光共聚焦显微镜观察细胞经过FITC标记的荆豆凝集素I和DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白双染色后的情况,由此鉴定EPCs。实验分为:DF-521的低、中、高剂量干预组和对照组。检测各组EPCs的CD31和vWF表达,观察EPCs在基质胶上的成管情况以及测定培养液中NO的浓度。透射电子显微镜鉴定分化后的细胞。结果低、中、高剂量干预组EPCs的数量、CD31、vWF表达及NO浓度均明显高于对照组(P<0.05),而且这些效应随DF-521浓度升高而增加(P<0.05)。高剂量干预组EPCs形成条梭状和管腔样结构。电子显微镜观察到怀布尔-帕拉德小体。结论体外培养务件下.DF-521促进EPCs的增殖和成血管功能,并诱导其向内皮细胞分化,改善分泌NO的能力。DF-521的这些作用可能与内皮型一氧化氮合酶有关。     

大鼠外周血晚期内皮前体细胞体外培养研究

目的体外培养大鼠外周血内皮前体细胞（EPCs）,观察细胞克隆形态并进行鉴定。方法密度梯度离心法分离SD大鼠外周血单个核细胞,EGM-2培养基离体培养。免疫荧光染色鉴定细胞CD34、CD31、CD133、FLk-1、vwF细胞表面标志。Real—TimePCR检测细胞CD34、CD133、FLk-1、eNOSmRNA表达。结果细胞培养10天后可见“铺路石样细胞”和少数“紊乱生长细胞”,传代培养后经免疫荧光及Real—TimePCR鉴定“铺路石样细胞”符合晚期EPCs特点,紊乱生长细胞不表达相应标志。结论通过体外分离长时培养可从大鼠外周血获得晚期内皮前体细胞,具有内皮细胞的特征。