细菌直接PCR和双引物策略鉴定16S rRNA基因技术的建立

目的探索一种基于16S rRNA基因的快速鉴定细菌方法,为临床诊断治疗及耐药菌的分子遗传分析提供科学依据。方法对卫生部室间质评菌株和临床病人标本分离培养纯菌落,用双蒸水稀释菌落,然后直接以菌液为模板优化反应体系PCR扩增16S rRNA基因片段,再测序扩增片段。将测序结果在细菌Ribosomal数据库中进行同源性比对,根据序列同源性鉴定病原细菌。结果本实验鉴定的卫生部质评菌株结果与卫生部报告结果一致。本实验能够一次性鉴定出临床病人标本分离的菌株。结论本研究优化了一种免纯化细菌核酸直接PCR鉴定细菌16S rRNA基因的方法。本研究建立的基于病原细菌16S rRNA基因鉴定方法可用于细菌的快速诊断。     

小儿下呼吸道感染的细菌病原学分析

目的：分析小儿下呼吸道感染的细菌病原学情况。方法选取我院2012年1月~2014年8月接诊的下呼吸道感染小儿531例作为研究对象,根据入院前是否治疗分为治疗组(301例)与未治疗组(230例),两组患儿入院后皆采取深部痰细菌培养与抗菌药敏试验处理,以及测定菌种鉴定药敏度,并对比分析两组患儿结果。结果治疗组共计分离逸1种致病菌的例数为88例,其中病原菌依次为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌等,而未治疗组共计分离逸1种致病菌的例数为77例,其中病原菌依次为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌等,但两组病原菌分离率对比无显著性差异(>0.05);两组患儿在大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌上的耐药率前4位皆为阿莫西林、替卡西林、头孢噻吩、哌拉西林,而耐药率最低的前4位皆为亚胺培南、美罗培南、头孢哌酮-舒巴坦与阿米卡星。结论大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌属于下呼吸道感染患儿常见致病菌,入院前有无治疗对细菌病原学无显著影响,但入院前若应用了抗生素则可能导致并发真菌感染率增加。     

呼吸道感染患者病原性细菌临床检验研究

目的 研究呼吸道感染患者病原性细菌临床检验措施。方法 选取2018年2月~2019年2月在我中心治疗的80例呼吸道感染患者为研究对象,采用随机数字表法分为对照组和观察组,各40例。对照组采用常规痰液收集与检验,观察组在常规检验基础上,给予相应的检验质控措施,比较两组病原性细菌检验的总检出率以及病原菌分布情况。结果 观察组病原性细菌总检出率为100.00%（革兰阴性菌70.00%、革兰阳性菌12.50%、真菌17.50%）,高于对照组的67.50%（革兰阴性菌52.50%、革兰阳性菌5.00%、真菌10.00%）,差异具有统计学意义（P＜0.05）;病原菌分布革兰阴性菌以铜绿假单胞菌与肺炎克雷伯菌最为常见,革兰阳性菌以金黄色葡萄球菌最常见。结论 呼吸道感染患者病原性细菌临床检验中,加强的检验质控措施,可提高病原性细菌检出率。革兰阴性菌、真菌是诱发呼吸道感染患者的关键病原性细菌,临床可依据药敏结果合理选择抗生素。     

抗生素治疗时限对化脓性脑膜患儿脑脊液细菌16s rRNA基因检测的影响

目的：研究抗生素治疗时限对化脓性脑膜患儿脑脊液细菌16s rRNA基因检测的影响。方法：选取2014年2月至2016年3月在我院收治的化脓性脑膜炎患儿60例。对所有患儿予以16s rRNA基因检测和脑脊液细菌培养检测,比较两种方法检测结果,观察抗生素使用对两种检测方法的影响。结果：脑脊液细菌培养阳性率显著低于16s rRNA基因芯片检测阳性率[15%(9/60) vs.35%(21/60)](P<0.05)。抗生素应用早期的16s rRNA基因检测阳性率和抗生素使用后期的阳性率比较差异不显著[36.67%(11/30) vs.33.33%(10/30)](P>0.05);抗生素使用早期的脑脊液细菌培养阳性率显著高于抗生素应用后期的阳性率[13.33%(4/30) vs.0.00%(0/30)](P<0.05)。结论：和脑脊液培养相比,16s rRNA基因芯片法检测化脓性脑膜患儿脑脊液细菌受抗生素治疗时限的影响更小。     

多重半套式聚合酶链反应检测脑脊液中细菌16S rRNA基因

根据细菌 16Ｓ核糖体ＲＮＡ(ｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡ ,ｒＲＮＡ)基因兼有保守性和变异性 ,以及对于本应无菌的体液标本 (如血液、脑脊液 ) ,只要确定有细菌存在即可断定为感染之特点 ,建立了多重半套式聚合酶链扩增 (ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｓｅｍｉ ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ)的方法 ,对脑脊液标本中细菌的感染进行检测。在ＧＥＮＥＢＡＮＫ中查得常见细菌 16ＳｒＲＮＡ基因序列 ,用ＤＮＡｓｔａｒ软件进行分析 ,在保守区Ｕ3 和Ｕ8各寻找一段序列作为细菌的通用引物 (上游引物Ｐｕ3:5′ＴＡＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡ3′ ,下游…     

广州地区儿童急性呼吸道感染鼻咽部常见病原菌及其耐药性分析

目的了解儿童急性呼吸道感染（ARTIS）鼻咽部常见的病原菌及其耐药性．方法对285例取鼻咽拭子进行培养，分离鉴定病原菌，同时对肺炎链球菌和流感嗜血杆菌（Hi）进行耐药性监测．结果285例中共检出病原菌161株。肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉氏菌、金黄色葡萄球菌的分离率分别为20．4％、16．5％、13．0％、6．7％．肺炎链球菌对青霉素耐药率高达57．5％，同时对非B一内酰胺类抗生素复方新诺明、四环素、红霉素的耐药率已高达79．2％．89．5％，对头孢曲松、阿莫西林／棒酸尚具有较好的敏感性（85．1％－93．3％）．Hi对氨苄西林的耐药率为13.3％。对头孢克洛、头孢曲松、头孢呋新、阿莫西林／棒酸均有很好的敏感性（96．4％-100％），对四环素、复方新诺明的耐药范围分别为25．3％-56．6％．结论肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉氏菌和金黄色葡萄球菌是广州地区儿童急性呼吸道感染的常见病原菌．肺炎链球菌和流感嗜血杆菌耐药形势严峻，抗生素合理应用尤为重要．     

抗人CD16单克隆抗体可变区基因的克隆和表达

目的：克隆抗人CD16单克隆抗体重，轻链可变区（VH，VL）基因并合成单链抗体（ScFv)基因。方法：从分泌抗人CD16单克隆抗体的杂交瘤细胞B88－9中提取总RNA，应用RT－PCR技术获得抗CD16单克隆抗体的VH，VL基因，用连接肽（Linker)肽VH和VL连接成具有VH－Linker-VL结构的ScFv基因，将其克隆到表达载体pcDNA3.1( )，并转杂COS－7细胞。结果：VH基因长度为354bp，属于鼠抗体可变区重链基因家族I（B）亚群，VL基因长度为333bp，属于鼠抗体可变区kappa轻链基因家族Ⅲ亚群，采用夹心ELISA方法检测到ScFv的表达。结论：抗人CD16单克隆抗体VH与VL基因的克隆和ScFv基因的构建为基于CD16的导向免疫治疗奠定了基础。     

gyrB基因和16S rRNA基因序列分析在沙门菌属细菌鉴别中的临床应用评价

最近研究发现，gyrB基因是16S rRNA基因以外适合细菌鉴别的又一理想靶基因。gyrB基因是编码DNA解旋酶B亚单位的基因，其显著优点是基因进化率较快，碱基替换频率较高，在相似细菌的检测和鉴别方面比16S rRNA基因更具优越性。本实验以10株沙门菌为受试对象，     

广州地区儿童急性呼吸道感染鼻咽部常见病原菌及其耐药性分析

目的了解儿童急性呼吸道感染(ARTIS)鼻咽部常见的病原菌及其耐药性.方法对285例取鼻咽拭子进行培养,分离鉴定病原菌,同时对肺炎链球菌和流感嗜血杆菌(Hi)进行耐药性监测.结果 285例中共检出病原菌161株,肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉氏菌、金黄色葡萄球菌的分离率分别为20.4%、16.5%、13.0%、6.7%.肺炎链球菌对青霉素耐药率高达57.5%,同时对非β-内酰胺类抗生素复方新诺明、四环素、红霉素的耐药率已高达79.2%～89.5%,对头孢曲松、阿莫西林/棒酸尚具有较好的敏感性(85.1%～93.3%).Hi对氨苄西林的耐药率为13.3%,对头孢克洛、头孢曲松、头孢呋新、阿莫西林/棒酸均有很好的敏感性(96.4%～100%),对四环素、复方新诺明的耐药范围分别为25.3%～56.6%.结论肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉氏菌和金黄色葡萄球菌是广州地区儿童急性呼吸道感染的常见病原菌.肺炎链球菌和流感嗜血杆菌耐药形势严峻,抗生素合理应用尤为重要.     

肺表面活性蛋白A基因多态性与呼吸道合胞病毒下呼吸道感染的相关性研究

目的探讨肺表面活性蛋白（SP）-A1-1101C/T和SP-A2-1649G/C位点基因多态性与呼吸道合胞病毒下呼吸道感染（RSV-LRTI）的相关性。方法应用聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性（PCR-RFLP）分析法检测200例病例组和150例健康对照组2个位点的基因多态性,并进行基因型、等位基因型频率分析;采用DNA测序法进行测序分析。结果 1.病例组SP-A1-1101C/T位点TT、CT基因型频率分别为76.0%、24.0%,T、C等位基因频率分别为88.0%、12.0%;对照组TT、CT基因型频率分别为80.7%、19.3%,T、C等位基因频率分别为90.3%、9.7%,两组基因型及等位基因频率差异无统计学意义（χ2=1.088、0.953,P〉0.05）。2.病例组SP-A2-1649G/C位点CC、CG、GG基因型频率分别为41.5%、50.5%、8.0%,C、G等位基因频率分别为66.8%、33.2%;对照组CC、CG、GG基因型频率分别为43.3%、49.3%、7.4%,C、G等位基因频率分别为68.0%、32.0%,两组基因型及等位基因频率无统计学意义（χ2=0.141、0.122,P〉0.05）;但该位点基因型和等位基因在轻度和重度患儿间的差异有统计学意义（χ2=6.664、5.207,P〈0.05）,携带G等位基因的个体患重度RSV-LRTI的风险是患轻度风险的1.656倍,（OR=1.656,95%CI：1.072～2.559,P=0.023〈0.05）。结论温州地区汉族儿童存在SP-A1-1101C/T、SP-A2-1649G/C基因多态性,未发现其与RSV-LRTI疾病易感性存在关联,但携带SP-A2-1649G等位基因的个体患重度RSV-LRTI的风险是患轻度风险的1.656倍,表明G等位基因可能是影响RSV-LRTI疾病严重程度的一个候选基因。     

Identification of a novel 16S rRNA gene variant of Actinomyces funkei from six patients with purulent infections

Little is known about the clinical significance and laboratory diagnosis of Actinomyces funkei. In this report we describe six clinical cases where A. funkei was isolated from purulent, polymicrobial infections. Conventional identification procedures were compared with molecular methods including matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technique. Analysis of the full 16S rRNA gene sequence of the six investigated strains revealed differences from the A. funkei type strain. DNA–DNA hybridization showed that the clinical strains represent a novel 16S rRNA gene variant within the species of A. funkei.     

Early prosthetic joint infection due to Ureaplasma urealyticum: Benefit of 16S rRNA gene sequence analysis for diagnosis

Detection of the most frequently bacteria involved in prosthetic joint infection (PJI) is usually performed by conventional cultures. We report a case of early PJI due to Ureaplasma urealyticum, diagnosed by 16S rRNA gene sequence analysis, which highlights the interest of molecular methods if fastidious bacteria are involved in PJI.     

Intraspecific 16S rRNA gene diversity among clinical isolates of Neisseria species

In the present work, nearly the entire 16S rRNA gene sequences of 46 clinical samples of Neisseria spp. were determined, and the aligned sequences were analyzed to investigate the diversity of 16S rRNA genes in each commensal Neisseria species. Two 16S rRNA types were identified in two Neisseria sicca strains, three 16S rRNA types in five Neisseria macacae strains, fourteen 16S rRNA types in twenty Neisseria flavescens isolates, and fourteen 16S rRNA types in nineteen Neisseria mucosa isolates. The number of nucleotides that were different between 16S rRNA sequences within specie ranged from 1 to 15. We found high intraspecific sequence variation in 16S rRNA genes of Neisseria spp. strains.     

产ESBL肺炎克雷伯菌中16S rRNA甲基化酶的分布与相关耐药性的研究

目的 调查我院产ESBL肺炎克雷伯菌临床分离株16S rRNA甲基化酶基因的分布以及与耐药谱的关系,并初步探讨其在分子流行病学分析中的作用.方法 收集我院临床2010年3月至9月分离出69株非重复产ESBL肺炎克雷伯菌,采用PCR法检测16S rRNA 甲基化酶基因,并对阳性菌株进行ESBL基因及整合子基因分析,通过DNA直接测序确定.质粒接合试验和质粒消除试验确定16S rRNA甲基化酶基因的传播途径,利用ERIC-PCR技术进行基因分型.结果 69株产ESBL肺炎克雷伯菌中有rmtB阳性菌株20株(28.9％),其中2株同时携带有rmtB和armA.在20株产16SrRNA甲基化酶菌株中,均携带有CTX-M基因,测序显示14株CTX-M-14基因,6株CTX-M-15基因;14株携带有TEM-1基因;8株携带有SHV基因,测序显示5株SHV-12基因,3株SHV-11基因;3株携带有OXA-10基因;3株携带有VBE-1基因.另有12株携带有int1阳性,含有5种不同的耐药基因盒,分别携带drfA25、drfA1、drfA12、aadA1、aadA2、sat和blaVEB-1基因.ERIC-PCR法显示20株16SrRNA甲基化酶基因阳性的肺炎克雷伯菌主要分为5型,A型为优势流行克隆株.质粒接合和消除试验发现A型克隆株KP5和KP16 rmtB均位于一质粒上并通过接合传播.结论 本院产ESBL肺炎克雷伯菌临床分离株中存在16S rRNA甲基化酶基因rmtB的普遍流行,导致对多种氨基糖苷类抗生素高水平耐药.rmtB可通过水平基因传播和克隆传播的两种方式进行播散,并且存在同时产ESBLs、16S rRNA甲基化酶和Ⅰ类整合子的肺炎克雷伯菌的传播.     

16S rRNA基因检测在儿童化脓性脑膜炎早期诊断中的研究

目的探讨儿童化脓性脑膜炎快速诊断方法。方法收集可疑化脓性脑膜炎患儿脑脊液标本85例,分别用16S rRNA基因PCR方法和细菌培养法进行检测,比较两种方法检测病原菌的敏感性。结果85例标本中,PCR方法检测出33例,阳性率为38.82%,培养法检出14例,阳性率为16.47%,PCR方法检出率明显高于培养法（P〈0.01）。结论PCR方法能特异、敏感、快速地检测脑脊液感染的常见病原菌。     

鲍曼不动杆菌armA基因的分布与耐药性的研究

目的 调查我院鲍曼不动杆菌中16S rRNA甲基化基因armA的分布以及与鲍曼不动杆菌耐药谱的关系,并初步探讨其在分子流行病学分析中的作用.方法 收集72株鲍曼不动杆菌,采用K-B法对鲍曼不动杆菌进行药物敏感试验,后采用PCR筛选鲍曼不动杆菌的16S rRNA甲基化基因armA,并利用随机扩增多态性DNA法(RAPD)技术进行基因分型.统计各鲍曼不动杆菌菌株对多种氨基糖苷类药物的药敏结果,并分析基因型与耐药性的关系.结果 根据PCR产物片段大小,72株鲍曼不动杆菌共有armA基因阳性菌株20株(27.8%).含有armA基因型鲍曼不动杆菌菌株对庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星的耐药率均为90%;随机扩增多态性DNA法显示20株armA基因阳性的鲍曼不动杆菌主要分为7型,A型为优势克隆株.结论 产16S rRNA甲基化基因armA的鲍曼不动杆菌菌株可对多种氨基糖苷类抗生素高水平耐药.同一克隆菌株在病房内和病房间的传播为我院armA基因传播的主要方式.     

Parallel Detection of Bacterial Pathogens in Cerebrospinal Fluid with 16S rRNA Probe Microarray

The most commonly used method for detection ofpathogenic bacteria in cerebrospinal fluid (CSF) speci mens of clinical laboratories is isolation and identificationof the causative agents by cultural method, biochemicaland serological t…     

Cutaneous manifestations of Crohn's disease, its spectrum, and its pathogenesis: intracellular consensus bacterial 16S rRNA is associated with the gastrointestinal but not the cutaneous manifestations of Crohn's disease

The classic pathology of skin disease discontinuous from the inflamed gastrointestinal (GI) tract in patients with Crohn's disease (CD) includes pyoderma gangrenosum (PG), erythema nodosum (EN), and so-called metastatic Crohn's disease. The purpose of this study was two-fold: First, we explored the full spectrum of cutaneous lesions associated with Crohn's disease, and second, we sought to explore a potential molecular basis of the skin lesions in patients with CD. In this regard, we analyzed skin and GI tract biopsies from affected patients for the consensus bacterial SrRNA to determine whether direct bacterial infection was associated with either condition. Formalin-fixed, paraffin-embedded sections were studied and correlated to clinical presentation and histories from 33 patients with CD. Consensus bacterial RNA sequences were analyzed using an RT in situ PCR assay on both skin biopsy and GI biopsy material. The GI tract material included biopsies from 3 patients who had skin lesions and from 7 patients in whom there were no known skin manifestations. There were 8 cases of neutrophilic dominant dermal infiltrates, including pyoderma gangrenosum, 6 cases of granuloma annulare/necrobiosis lipoidica-like lesions, 5 cases of sterile neutrophilic folliculitis, 5 cases of panniculitis, 4 cases of vasculitis, 2 cases of psoriasis, 2 cases of lichenoid and granulomatous inflammation, and 1 case of classic metastatic CD. Intracellular bacterial 16S rRNA was detected in 8 of 10 tissues of active CD in the GI tract, of which 3 of the cases tested were from patients who also developed skin lesions at some point in their clinical course; in contrast, none of the skin biopsies had detectable bacterial RNA. The dermatopathological manifestations of CD discontiguous from the involved GI tract mucosa have in common a vascular injury syndrome, typically with a prominent extravascular neutrophilic and/or histiocytic dermal infiltrate. In addition, this study, the first to document in situ intracellular consensus bacterial SrRNA in the GI tract in CD, suggests that hematogenous dissemination of viable microbes is not associated with the cutaneous manifestations of this disease. Bacteria do, however, appear to play a role in bowel lesions of patients with CD.