SARS CoV抗原决定簇的预测和制备

目的获得严重急性呼吸道综合征（SARS）冠状病毒（CoV）中和性抗原蛋白.方法使用Blast工具将SARSS蛋白的氨基酸序列与其他蛋白进行比对分析.冠状病毒鼠肝炎病毒的刺突蛋白在S2段存在中和性抗体表位.通过对鼠肝炎病毒和SARS CoVS2的氨基酸序列分析,SARS CoV的S2段类似于鼠肝炎病毒的S2段.使用DNASTAR软件对2段的相似性进行分析.选取SARS CoVS2蛋白基因在大肠埃希菌中进行表达.表达产物进行免疫印迹分析.结果在SARS刺突蛋白C端发现了与其他冠状病毒S2蛋白具有较高的同源性的片段.在SARS病毒刺突蛋白的S2段可能存在中和性表位.将该肽段在大肠埃希菌中获得表达.表达的蛋白片段可以和来自SARS恢复期的人抗SARS-CoV免疫球蛋白特异性结合.结论表达的蛋白片段有可能成为预防SARS的候选疫苗.     

严重急性呼吸综合征患者抗病毒结构蛋白抗体和总抗体的变化规律

严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory svndrome，SARS）的病原体是一种新型的冠状病毒（SARS-CoV），目前已确定有6种主要蛋白。本研究对恢复期SARS患者不同时间段体内抗体进行随访测定，以观察不同时期特异性抗体的动态变化规律，同时还分别检测了SARS-CoV N抗体和SARS-CoV S抗体，并与SARS-CoV IgG总抗体进行比较研究。     

小儿血清SARS冠状病毒交叉抗体的筛查

目的：在非SARS小儿血清中筛查SARS冠状病毒交叉抗体。方法：用ELISA和RT-PCR方法对无SARS临床表现的住院小儿患者进行SARS冠状病毒RNA及抗SARS冠状病毒多克隆抗体IgG的检测。再对SARS IgG可疑阳性血清利用蛋白芯片方法进行SARS冠状病毒成份蛋白3CL、N、M、S1、S2、S3抗体的分析。结果：在190例非SARS患儿血清中，检出IgG多克隆抗体可疑阳性20例。SARS冠状病毒成分蛋白抗体分析发现N蛋白抗1例，抗M蛋白抗体阳性1例，抗N、M抗体同时阳性1例。结论：在部分非SARS小儿体内可能存在有抗SARS冠状病毒的交叉抗体。     

SARS冠状病毒多抗原表位融合蛋白的表达及其诊断应用

目的 制备SARS冠状病毒(SARS-CoV)多抗原表位融合蛋白,建立一种可特异性诊断SARS的血清学方法,用于SARS的明确诊断和流行病学调查研究.方法 设计含有SARS冠状病毒S、M和N蛋白优势抗原表位区的多表位融合蛋白SMN,利用大肠杆菌表达SMN蛋白,并作为包被抗原建立ELISA方法,用于SARS患者血清检测.结果 设计出包含S603-635 M2-31、N362-412表位区的多表位融合蛋白SMN,并在大肠杆菌中成功表达.以SMN蛋白为包被抗原,ELISA检测74份SARS患者血清全部为阳性,另44份非SARS-CoV感染的发热病人血清和62份健康人血清均为阴性.结论 SARS-CoV多抗原表位融合蛋白SMN在大肠杆菌中成功表达,以SMN为检测抗原建立的ELISA方法为SARS血清学诊断奠定了基础.     

基于克隆表达的芳香烃受体系统的二噁(口英)生物检测方法研究

目的 研究人工克隆表达的芳香烃受体核转位蛋白(ARNT)与天然芳香烃受体(AhR)特异性结合及其对制备的多克隆抗体识别的情况,通过两者结合与二噁(口英)(TCDD)的剂量反应关系,探索TCDD生物检测方法.方法 (1)以小鼠肝组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增目的 基因AhR-PAS[periodicity(Per)/Aryl hydrocarbon nuclear translocatar(ARNT)/single-minded(Sim)]端、AhR羧基末端(AhR-C端)、ARNT-PAS端,构建含有目的 基因的pGEX-5X1重组表达质粒,并采用大肠杆菌原核系统进行克隆表达.(2)用上述克隆表达的AhR片段蛋白(AhR-PAS、AhR-C)作为抗原免疫家兔,制备多克隆抗体.(3)从C57BL/6J纯系小鼠肝组织中提取具有结合活性的天然AhR复合物,将天然AhR复合物与结合在谷胱甘肽硫转移酶(GST)上面的融合蛋白GST-ARNT-PAS,分别在0.25、0.50、1.00、2.00 pmol TCDD存在的条件下进行结合,通过亲和吸附和免疫印迹观察所形成的蛋白复合物的量.结果 (1)成功构建含有目的 基因AhR-PAS、AhR-C和ARNT-PAS的重组质粒,并通过大肠杆菌原核系统表达出具有结合活性的目的 蛋白;(2)免疫家兔制得的多克隆抗体AhR-PAS、AhR-C的检测下限分别为5、1 ng;(3)测得该法制备的小鼠肝脏匀浆中总蛋白质的浓度为60.5 mg/ml;在TCDD存在的条件下,克隆得到的融合蛋白GST-ARNT-PAS能够与天然AhR复合物特异性地结合,并测得检测下限为0.25 pmol,约80 Pg TCDD.结论 成功地建立了基于克隆表达的芳香烃受体系统的TCDD生物检测方法,且检测下限达到pg级别.     

SARS-CoV人工合成基因CAGZ的克隆和表达

严重急性呼吸道综合征（severe acute respiratory syndrome。SARS）是一种传播快、病死率高、严重威胁人类健康和生命的急性传染病。WHO宣布一种新的冠状病毒（coronavirus）是引起SARS的病原体，即SARS—CoV，属于单链正义RNA病毒，其中纤突蛋白（Spike，S）是致病过程中的主要毒力因子，S蛋白含有若干B细胞表位。能够诱导中和抗体产生，这些特征使它成为研究基因工程疫苗的最佳候选结构蛋白。本研究应用生物信息学技术，对S蛋白结构进行分析，人工合成编码S蛋白抗原表位的嵌合基因，并将其克隆、表达，为SARS重组疫苗的研制奠定基础。现将结果报告如下。     

发热患者SARS冠状病毒抗体分析

目的了解临床发热患者中是否存在严重急性呼吸综合征（SARS）冠状病毒（SARS-CoV）隐性感染或亚临床感染。方法对2003年5月～7月，SARS流行期间湖北地区临床发热患者373例血清进行SARS冠状病毒（SARS-CoV）抗体（IgG、IgM、N蛋白抗体）酶联免疫吸附法（ELISA）检测和分子生物学（RT—PCR）检测。结果373例发热患者中，检出冠状病毒抗体阳性者24例，阳性率6．43％（24／373），其中SARSIgG抗体、IgM抗体、N蛋白抗体阳性率分别为0．54％，1．34％和5．09％，但SARS-CoVRT—PCR检测均为阴性。结论临床发热患者可能存在SARS-CoV隐性或亚临床感染，患者体内产生针对SARS-CoV的保护性抗体，应具有免疫力和抵抗力。     

SARS冠状病毒S蛋白部分序列的克隆与表达

〔目的〕表达SARS冠状病毒S蛋白部分序列S1。〔方法〕采用逆转录 -多聚酶链反应 (RT -PCR)技术从SARS冠状病毒RNA中扩增出编码S1蛋白的基因片段 ,鉴定后将目的片段与原核表达载体pQE3 0连接 ,构建重组表达质粒pQE3 0 -S1,IPTG诱导该重组质粒转化的大肠杆菌产生S1重组蛋白。〔结果〕(1)RT -PCR扩增获得长约 115 0bp的S1基因片段。 (2 )SDS -PAGE证明 ,S1重组蛋白的分子量约为 40kDa。 (3 )表达的蛋白能与SARS病人血清反应。〔结论〕成功构建了SARS冠状病毒S1蛋白的重组表达质粒 ,该质粒在大肠杆菌中表达了S1蛋白     

间接免疫荧光法在检测SARS冠状病毒特异性抗体中的应用

目的 利用间接免疫荧光技术(IFA)建立SARS冠状病毒(SARS—CoV)特异性抗体血清学诊断方法。方法 采用组织培养技术，用SARS病人的咽漱液样本，在Vero—E6细胞中培养，分离SARS冠状病毒；用已制备的SARS病毒抗原片与临床确诊为SARS的病人双相血清和正常人对照血清作用，再用荧光标记羊抗人IgM/IgG抗体与之结合，在荧光显微镜下观察荧光图像。结果 通过建立检测SARS冠状病毒特异性抗体的间接免疫荧光方法，在44份SARS临床病例标本中，检出IgG抗体阳性3l份，与临床诊断符合率为70．45％。31份IgG阳性者的急性期血清中IgM检出率为38．70％，IgM最早产生于发病第3天，发病7d以上的6例的IgM抗体均为阳性，滴度在发病12～15d达到高峰(1：80)；恢复期血清中IgG抗体最早产生于发病第8天，滴度在发病15～20d达到高峰(1：320～1：640)。97份正常人的血清标本中IgG抗体阳性率为3．09％，IgM抗体为阴性。结论 利用此方法，证实被SARS冠状病毒感染后，在机体中产生有特异性的IgM／IgG抗体；本方法检测结果与临床诊断符合率较高，可以用于早期临床诊断SARS病毒感染和辅助临床做出鉴别诊断。     

用噬菌体肽库筛选SARS病原体的模拟抗原表位

目的筛选SARS病原体的模拟抗原表位。方法以混合SARS患者恢复期血清Ig作为筛选分子，从噬菌体肽库中筛选出能与患者血清Ig结合的模拟抗原表位，并研究其抗原特性。结果得到2个能与SARS患者恢复期血清Ig特异性结合的阳性克隆；DNA测序结果显示这2个模拟抗原表位与SARS抗原无同源性。结论用噬菌体肽库成功筛选得到SARS的模拟表位，为开展用SARS模拟抗原表位探索SARS的防治研究创造了条件。     

猪链球菌2型溶血素sly基因的表达及其产物的纯化和活性研究

目的 克隆并表达猪链球菌2型(SS2)溶血素基因(sly),为筛选SS2疫苗保护性抗原奠定基础.方法 用PCR方法从SS2临床分离株05ZYH33的基因组DNA中扩增出溶血素基因片段,将目的 基因插入表达载体pET-30b(+)中,构建重组表达载体pET30b-sly.重组载体经限制性内切酶酶切和DNA测序鉴定后,转化大肠埃希菌(E.coli Rosetta).IPTG诱导表达,镍离子亲和层析纯化重组蛋白,鉴定目的 蛋白的免疫学活性以及溶血活性.结果　PCR扩增的sly基因长度约为1500 bp,经测序分析,插入载体的sly基因序列准确并保持了正确的读框.经IPTG诱导的目的 蛋白表达量约占总蛋白的30%,亲和层析纯化后,蛋白纯度达80%以上.Western blot检测证实该蛋白能与感染SS2的人血清发生特异性结合.溶血试验表明重组蛋白溶血素能使猪红细胞发生溶解,溶血价为256.结论 成功构建了表达载体pET30b-sly,该载体可在大肠埃希菌中表达,表达蛋白具有免疫反应原性及溶血活性.     

人源性DNA聚合酶β原核蛋白的表达、蛋白纯化及其功能初探

[目的]利用人源性DNA聚合酶β原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化DNA聚合酶β蛋白,并检测蛋白活性。[方法]将重组质粒pCR-BluntII-TOPO-DNApolβ转化入大肠杆菌E.coli中,IPTG诱导其表达并鉴定。利用金属螯合层析技术进行蛋白纯化,得到人源性DNApolβ融合蛋白,纯化的融合蛋白用EK酶酶切后,通过Ni2+柱纯化获得高纯度的人源性DNApolβ蛋白,电泳迁移率变动分析实验检测DNApolβ融合蛋白的AP修复活性。[结果]转化入大肠杆菌E.coliRosetta2的DNApolβ诱导表达最好,蛋白表达量高。金属螯合层析纯化后得到融合蛋白经EK酶切后得到高纯度的人源性DNApolβ蛋白,EMSA实验证明所纯化的DNApolβ融合蛋白不具有AP修复活性。[结论]利用原核表达载体pCR-BluntII-TOPO-DNApolβ在E.coliRosetta2中表达和纯化获得高纯度的DNApolβ融合蛋白,为下一步开展DNApolβ蛋白的生物学功能研究打下基础。     

日本血吸虫核糖体蛋白S4基因的克隆、表达、纯化及免疫诊断价值的初步研究

目的 体外重组日本血吸虫核糖体蛋白S4(SjRPS4),并评价其在日本血吸虫病免疫诊断中的应用价值.方法 从日本血吸虫尾蚴cDNA文库获得了SjRPS4蛋白相关基因,将该段基因克隆入pQE30表达载体并转化到大肠杆菌M15中,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白表达.融合蛋白经Ni2+-NTA树脂柱进行亲和层析纯化,并通过十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定蛋白反应,通过Western blot和ELISA对其免疫原性进行鉴定.结果 成功构建了pQE30/SjRPS4重组菌.重组菌诱导培养后,SDS-PAGE电泳分析可见在相对分子质量约30×103处有SjRPS4融合蛋白的表达,经纯化获得纯度达90%以上的表达蛋白.Western blot检测结果表明该重组蛋白能被日本血吸虫病患者血清识别.用ELISA法检测疑似血吸虫病患者血清,敏感性为90.91%(70/77),特异性为92.59%(25/27),SjRPS4重组表达蛋白阳性率为67.30%(70/104),与肺吸虫病患者血清无交叉反应.结论 成功克隆表达了SjRPS4蛋白,初步证实了SjRPS4在诊断血吸虫病中具有良好的应用价值.     

布氏菌外膜蛋白bp26的表达和鉴定

[目的]研究布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因的克隆、表达与测序，并对其进行初步的血清学鉴定。[方法]从布鲁氏菌基因组中获得bp26基因连接入PMD18-T克隆质粒并测序，目的基因与融合表达载体PGEX-4T-1连接。构建重组质粒PGEX-4T-1／bp26，在大肠杆菌中表达该蛋白。用western—blot鉴定重组表达的GST—bp26蛋白。[结果]成功构建了PGEX-4T-1／bp26原核表达载体，并在大肠杆菌中成功表达了bp26基因，布鲁氏菌免疫动物血清能特异性识别所表达的蛋白。[结论]布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因的成功表达，它可以与布鲁氏菌免疫血清产生特异性结合反应，为之后的抗原性以及免疫原性研究打下良好的物质基础。     

恶性疟原虫丝氨酸重复抗原基因在大肠杆菌中的表达

采用 PCR方法特异性扩增恶性疟原虫云南株 (PFD- 3/ YN)丝氨酸重复抗原基因片段 ,经基因序列测定后克隆于 p GEX- 4T- 1融合蛋白表达载体 ,并转化大肠杆菌 TG1。SERA基因与 p GEX- 4T- 1重组后能在大肠杆菌 TG1中表达一 45 KDa的融合蛋白 ,当工程菌 OD5 90 为 0 .8～ 1.0时 ,加入终浓度 1m mol/ L IPTG进行诱导 ,表达量较高。采用 dot- EL ISA对表达产物进行鉴定。结果表明 SERA融合蛋白能被抗 SERA单克隆抗体所识别。     

Plant-synthesized E. coli CFA/I fimbrial protein protects Caco-2 cells from bacterial attachment

A DNA fragment encoding the cholera toxin A2 subunit (CTA2) linked to the enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) colony forming fimbrial antigen CFA/I was inserted into a plant expression vector containing the cholera toxin B subunit (CTB) fused to the rotavirus enterotoxin 22 amino acid epitope NSP422. Anti-CFA/I antibodies recognized a single band of approximately 72-kDa in transformed potato tuber tissue consistent with CFA/I-CTA2 and CTB-NSP4 fusion protein assembly into a cholera holotoxin-like structure. Enzyme-linked immunosorbent assay (GM1 ELISA) indicated that the CFA/I-CTA2 fusion protein bound specific GM1 ganglioside membrane receptors and made up approximately 0.002% of the total soluble tuber protein. Oral immunization of BALB/c mice with transformed tuber tissues generated anti-CFA/I serum and intestinal IgG and IgA secretory antibodies. Attachment of ETEC H10407 to enterocyte-like Caco-2 human colon carcinoma cells incubated with antiserum from immunized mice was reduced by 15% in comparison with Caco-2 cells incubated with serum from unimmunized mice. Immunogold staining of bacterial preparations revealed deposition of gold particles on E. coli H10407 fimbria incubated with immune serum but not on fimbria treated with sera from unimmunized mice demonstrating the specificity of antibodies in the immune serum for binding to CFA/I protein containing fimbria. The protection against toxic E. coli binding to Caco-2 cells generated by antisera from mice immunized with plant-synthesized CFA/I antigen demonstrates the feasibility of plant-based multi-component vaccine protection against enterotoxigenic E. coli, rotavirus and cholera, three enteric diseases that together exert the highest levels of child morbidity and mortality in economically emerging countries.     

霍乱毒素B亚单位与志贺毒素2B亚单位融合表达及抗原性检测

目的 克隆表达出血性大肠埃希菌(EHEC)O157:H7志贺毒素2B亚单位(Stx2B)与霍乱毒素B亚单位(CTB)的融合蛋白(CTB-Stx2B),并检测其抗原性和与神经节苷脂(GM1)结合能力.方法 设计引物扩增融合蛋白CTB-Stx2B的编码基因ctb-stx2b,T-A克隆测序验证后克隆入原核表达质粒pET30a(+)C,构建表达质粒pET30a(+)-ctb-stx2b,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达、纯化,获得目的蛋白CTB-Stx2B,SDS-PAGE和Western-blot检测其抗原性和形成五聚体的能力;GM1-ELISA法检测其与GM1结合能力.结果 扩增出约750 bp的目的片段,测序鉴定与设计序列一致;原核表达质粒pET30a(+)-ctb-stx2b转化E.coliBL21(DE3)后,经酶切和PCR扩增鉴定正确;IPTG诱导后SDS-PAGE初步测定CTB-Stx2B单体的相对分子质量(MR)约为20×103;Western-blot检测CTB-Stx2B能与CTB单克隆抗体结合,纯化产物经复性后大多以五聚体形式存在;ELISA检测CTB-Stx2B具有结合GM1活性.结论 成功克隆、表达了融合蛋白CTB-Stx2B;表达的蛋白具有良好的CTB抗原性和GM1结合能力.     

结核分枝杆菌rESAT-6-CFP-10融合蛋白的制备及其血清学诊断价值

目的 表达、纯化结核分枝杆菌rESAT-6-CFP-10(rEC)融合蛋白,评价其在结核病血清学诊断方面的应用价值.方法 用镍离子螯合亲和层析柱纯化融合蛋白,用ELISA法检测血清样本中的抗结核抗体,以37例PPD阴性患者正常血清A492+2s为正常限值,评价rEC诊断的特异性及灵敏度.结果 rEC融合蛋白在大肠埃希菌中以可溶性非包涵体形式表达,表达浓度为0.19 mg/mL.rFC检测抗结核抗体在PPD阳性健康人群中的特异性为100%(30/30),在痰涂片或细菌培养阳性和两法均阴性的结核病患者中灵敏度分别为75.56%(34/45)和67.3]%(35/52).结论 结核分枝杆菌rEC融合蛋白以可溶性形式高效表达,具有较强的免疫反应性和较高的血清学诊断价值.     

弓形虫微线体蛋白1部分基因的克隆、测序及表达

目的 构建弓形虫ZS2株pWR450-1－微线体蛋白1（MIC1）原核表达重组质粒,对MICI基因进行序列测定,并在不同大肠杆菌中表达。方法 用PCR技术从弓形虫ZS2株的基因组DNA中扩增编码MICI的基因片段,酶切,连接,重组入pWR450-1表达载体,再经含氨苄培养基筛选、酶切、PCR鉴定,进行序列测序后转化大肠杆菌TG－1、JM109（DE3）和DH5α。在不同菌体浓度及不同剂量异丙基－β－D－硫代半乳糖诱导下,用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定MIC1融合蛋白的表达。结果 从ZS2株基因组DNA中扩增出特异的MIC1基因片段,克隆后获得pWR450-1/MIC1重组质粒,测序结果表明,MIC1这部分基因与弓形虫RH株相应基因序列完全一致,高度保守。该基因可在不同大肠杆菌中表达相对分子质量约70000的融合蛋白。结论 构建了弓形虫ZS2株pW450-1-MCI1重组质粒,为研究MIC1的结构与功能奠定了基础。